ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר
4 בנובמבר 2009
דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.
טכנולוגיית NanoDrop משלבת סיבים אופטיים ומתח פנים כדי להחזיק ולמדוד כמויות קטנות של דגימות כגון חומצות גרעין וחלבונים. טיפה קטנה של דגימה מוזרמת ישירות על הכן התחתון. לאחר מכן כן אופטי עליון מפעיל את הדגימה ליצירת עמודה.
המעמד זז אוטומטית כדי להתאים את אורך הנתיב האופטימלי. קיצור אורך הנתיב מבטל את הצורך לבצע דילולים עבור רוב דגימות החלבון, המדידה מתרחשת תוך שניות ותוצאות הספקטרום מוצגות. היי, אני לין קלהורן במעבדות NanoDrop של Thermo Fisher Scientific.
היום נציג נוהל לקביעת ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח חדשני. הספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C משתמש במערכת שימור דגימות חדשנית המסתמכת על מתח הפנים של נוזלים כדי להחזיק ולמדוד דגימות מיקרו נפח בין שני כנים אופטיים ללא שימוש בקובטות או נימים. דגימת המיקרו מונחת ישירות על גבי משטח הזיהוי, ונוצר עמוד נוזל בין קצות הסיבים האופטיים על ידי מתח פנים.
עמודה נוזלית זו יוצרת נתיב אופטי אנכי. מנורת הבזק קסנון מספקת את מקור האור וספקטרומטר המשתמש במערך CCD ליניארי משמש לניתוח האור העובר דרך הדגימה. להסרת מכשירי בלימה מסורתיים כמו קובטות מהמערכת יש כמה יתרונות.
יש צורך בכמויות קטנות מאוד של דגימה למדידה. ניקוי של מיקרוליטר אחד עד שניים פשוט דורש ניגוב של המשטחים האופטיים במגבון מעבדה ואורך הנתיב משתנה אוטומטית בזמן אמת במהלך המדידה. בנוסף, קיצור אורך הנתיב מאפשר מדידה של ריכוזים גבוהים יותר, מה שמבטל למעשה את הצורך בביצוע דילול עבור רוב דגימות החלבון.
במקרים בהם יש צורך בווטרינר, כגון מחקרים קינטיים, ה-NanoDrop 2000 C מספק אפשרות vete באותו ספקטרופוטומטר. עבור פרוטוקול זה, נשתמש באפשרות הדום של נפח מיקרו כדי לקבוע את ריכוז החלבון. שיטת החלבון A Two 80 ישימה לחלבונים מטוהרים המכילים שאריות טריפטופן טירוזין ופניל אלנין או קשרי ציסטאין ציסטאין דיס סולפיד ומציגים ספיגה ב -280 ננומטר.
כדי להתחיל בהליך זה, בחר את החלבון A two 80 יישום מהתפריט הראשי. אם מופיע חלון אימות אורך הגל, ודא שהזרוע למטה, בחר את סוג הדגימה שיש למדוד מהרשימה הנפתחת. הגדרת ברירת המחדל מומלצת עבור רוב תערובות החלבון הלא ידועות שבהן ספיגה אחת שווה למיליגרם אחד למיליליטר.
אם מודדים חלבון מטוהר שאופיין בעבר, ניתן להזין את מקדם ההכחדה ההמונית או מקדם ההכחדה המולרית. כדי לקבוע את ריכוז החלבון בצורה מדויקת יותר, בחר את יחידות הריכוז מהרשימה הנפתחת הסמוכה לתיבה המקודדת בצבע. לאחר מכן, קבע ריק.
באמצעות מאגר מתאים, חשוב להשתמש במאגר שבו החלבון מושעה. המאגר המשמש צריך להיות בעל אותו pH וחוזק יוני דומה לתמיסת הדגימה. בשל השונות במתח הפנים בין חלבונים שונים, אנו ממליצים לטעון שני מיקרוליטרים של דגימות כדי להבטיח היווצרות עמודה תקינה.
כדי לטעון גע בקצה הפיפטה בעל האחיזה הנמוכה למשטח הכן התחתון תוך הוצאת התמיסה כדי למנוע מהתמיסה להיצמד לחלק החיצוני של קצה הפיפטה, הוצא פחות מכמות הדגימה המלאה כדי למנוע פיצוץ והחדרת בועות לדגימה. לאחר טעינת הדגימה, הורד את הזרוע, לחץ על ריק. לאחר השלמת הריקון, נגב את התמיסה הריקה מהכן התחתון והעליון.
באמצעות מגבון מעבדה יבש לפני לקיחת מנה למדידה, חשוב לוודא שהדגימה הומוגנית. מערבבים את הדגימה בעדינות אך ביסודיות על ידי מערבולת עדינה באמצעות סל"ד בינוני כדי למנוע הכנסת מיקרו-בועות לנוזל. הזן מזהה לדוגמה בשדה המתאים.
טען שני מיקרוליטר מהדגימה הראשונה כפי שהוצג קודם לכן עבור הריק, הורד את הזרוע ולחץ על המדידה לאחר השלמת המדידה, נגב את הדגימה מהכן התחתון והעליון. בעזרת מגבון מעבדה יבש, מדוד את כל הדגימות האחרות באותו אופן באמצעות מדגם טרי של שני מיקרוליטר לכל מדידה. מגבון מעבדה רגיל נטול מוך מספיק לרוב לניקוי הכן האופטי בין המדידות.
הממס היחיד שאינו תואם ואסור להשתמש בו הוא תמיסות חומצה הידרופלואורית וריאגנטים המכילים חומרים פעילי שטח עלולים לבטל את משטחי הדום המדידה לאורך זמן ולמנוע היווצרות עמודת נוזל הדגימה. השטחה של הטיפה על הכן התחתון מעידה על כך שהמשטח האופטי הופך לבלתי מותנה לשיפוץ. משטחי הכן מלטשים אותם במרץ באמצעות מגבון מעבדה או שהשיטה המועדפת היא להשתמש בתרכובת שיפוץ הדום NanoDrop PR אחת לפי ההוראות.
אם הדגימה היא תמיסת חלבון לא מאופיינת, ליזאט תאים או תמצית חלבון גולמי, אנו ממליצים להשתמש באחת מהשיטות הקולורמטריות המוגדרות מראש הזמינות ב-NanoDrop 2000 C. שיטות קולומטריות אלו כוללות מבחני BCAP 60 Bradford ו-Lowy. בדיקת ה-BCA תוצג כאן. הריאגנטים הנדרשים לבדיקת BCA כלולים בערכה התואמת לחומר הפחתת פירס מדעי תרמוס BCA, מגיב A, B, C, A, מגיב B ותקני אלבומין בסרום בקר.
אנו נשתמש בערכת האלבום המדולל מראש של פירס מכיוון שהסטנדרטים שלנו מתייחסים לספרות ה-BCA של פירס כדי לקבוע אילו תקני בדיקה מתאימים לנסיבות שלך. כדי להכין את הריאגנטים, ראשית יש לאזן את כל החלבונים ותקני החלבון הלא ידועים לטמפרטורת החדר ולערבב היטב על ידי מערבולת עדינה. השתמש בסל"ד בינוני כדי להימנע מהכנסת מיקרו-בועות לנוזל.
מכיוון שבועות עלולות להשפיע לרעה על הקריאות. הכן מספיק מגיב עבודה טרי לתקנים ולדגימות שיימדדו באמצעות יחס של 50 לאחד של מגיב A עד B.In דוגמה זו, נכין שלושה מיליליטר של מגיב עובד כדי לכסות את הייחוס חמישה תקנים ושש דגימות. בדיקת ה-BCA הרגילה מכסה טווח דינמי רחב יותר ומשתמשת ביחס של 20 ל-1 מגיב לחלבון, בעוד שבדיקת המיקרו-BCA רגישה יותר ובעלת טווח דינמי צר יותר באמצעות יחס מגיב אחד לאחד לחלבון.
מכיוון שאנו מבצעים את בדיקת ה-BCA הרגילה, נכין יחס של 20 ל-1 של מגיב עובד לדגימה. הוסף 190 מיקרוליטר של מגיב עובד לכל צינור עם מספיק צינורות כדי לכסות את כל הדגימות והתקנים. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תקן או דגימה לכל אחד מהצינורות המכילים ריאגנט.
מערבבים היטב על ידי מערבולת עדינה. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, אפשר לתגובות להתאזן לטמפרטורת החדר למשך כ -10 דקות.
בניגוד לשיטת החלבון A Two 80, שיטת החלבון BCA דורשת ליצור עקומה סטנדרטית לפני שניתן יהיה למדוד את ריכוזי החלבון בדגימה. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, התחל בבחירת שיטת החלבון BCA מהתפריט הראשי. אם מופיע חלון אימות אורך הגל, ודא שהזרוע למטה.
הזן את הערכים עבור כל ריכוז סטנדרטי בטבלת החלונית הימנית. התוכנה מאפשרת התייחסות ועד שבעה תקנים נוספים. ניתן למדוד את הייחוס ו/או התקנים בשכפולים.
צור ריק באמצעות המאגר המתאים. הריק עבור בדיקות מטריות צבע הוא בדרך כלל דה-יוניזציה. פיפטת מים שני מיקרוליטר מים על הכן התחתון והורידו את הזרוע.
לחץ על ריק. יש צורך רק בריק אחד כדי לכסות את כל המדידות הבאות של ההתייחסות והתקנים. קבע את ההתייחסות על ידי פיפטינג של שני מיקרוליטר Eloqua של מגיב וחוצץ עובדים בלבד ללא חלבון על הכן התחתון.
הורד את הזרוע ולחץ על מדידה. תחת לשונית התקנים, הדגש את התקן הרצוי ופיפטה שני מיקרוליטר מהתקן הרצוי על הכן התחתון. הורד את הזרוע ולחץ על מדידה.
חזור על התהליך עבור כל התקנים. כדי להציג את העקומה הסטנדרטית, לחץ על הצג עקומה רגילה. לאחר מדידת כל התקנים, לחץ על כפתור הדוגמאות.
הזן את מזהה המדגם, טען שני מיקרוליטר של דגימה על הכן התחתון ולחץ על מדידה. יש להשתמש בדגימה טרייה של שני מיקרוליטר לכל מדידה. לאחר השלמת המדידה, נגב את הדגימה מהכן התחתון והעליון באמצעות מגבון מעבדה יבש.
לאחר מכן מתקבלת התוצאה כאשר הריכוז הסופי של הדגימה מחושב אוטומטית באמצעות העקומה הסטנדרטית. זה עתה הראינו שתי דרכים לקביעת ריכוז החלבון, או על ידי מדידה ישירה של 2 80 או על ידי שיטה מטרית צבע עקיפה כל אחת באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח NanoDrop 2000 C. זה הכל.
תודה שצפית.
סקירה
הספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C משתמש בטכנולוגיה חדשנית כדי למדוד דגימות מיקרו-נפח של חלבונים וחומצות גרעין ללא קוביות מסורתיות. שיטה זו משפרת את מהירות המדידה והטווח הדינמי, ומאפשרת קביעת ריכוז יעילה של חלבונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- ניתוח חלבונים
רקע
- הטכנולוגיה של NanoDrop משתמשת בסיבי אופטיקה ומתח פנים להחזקת הדגימות.
- היא מאפשרת מדידה ישירה של נפחי דגימות קטנים (1-2 µL).
- הסרת הקוביות מקטינה את דרישות הדגימות ואת זמן הניקיון.
- המערכת יכולה למדוד ריכוזים גבוהים ללא דילול.
מטרת המחקר
- להדגים את הנוהל לקביעת ריכוז חלבונים באמצעות ה-NanoDrop 2000 C.
- להדגיש את היתרונות של ספקטרופוטומטריה במיקרו-נפח.
- לספק הנחיות לשימוש יעיל במכשיר.
שיטות ששימשו
- פיפטוט דגימות ישירות על הדום האופטי.
- שימוש בריק לכיול עם מאגר מתאים.
- מדידת ספיגה ב-280 ננומטר לקביעת ריכוז חלבונים.
- שימוש בבדיקות קולורימטריות כמו BCA לחלבונים לא מאופיינים.
תוצאות עיקריות
- ה-NanoDrop 2000 C מספק מדידות מהירות ומדויקות של ריכוז חלבונים.
- מתח הפנים שומר באופן יעיל דגימות מיקרו-נפח לניתוח.
- התאמת אורך נתיב בזמן אמת משפרת את דיוק המדידה.
- ניקיון מינימלי של הדגימות נדרש בין מדידות.
מסקנות
- ה-NanoDrop 2000 C הוא כלי חשוב לניתוח חלבונים בסביבות מחקר.
- העיצוב שלו מפשט את תהליך המדידה ומפחית את בזבוז הדגימות.
- שיטות קולורימטריות מרחיבות את תחום היישום שלה לסוגים שונים של דגימות חלבונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
