גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

הדבר הראשון שנעשה הוא לקחת בקבוק T 25 של תאי umsl שהגיעו למצב של התמסגות (confluency). אני פשוט אשטוף עם PBS ואוסיף מספר טיפות של Trypsin, ואני אמתין מספר דקות. אני יכול לראות שהתאים ניתקים מהפלטה, כך שהם מוכנים למעשה.

בשלב זה אסוף את תאי ה-trypsinized, ומומלץ לבצע trypsinization קצרה לתאי ה-trypsinized כדי לפרק את המושבות לפני העברתם לצלחת ה-UN. אלו יישארו באינקובטור למשך כ-30 עד 45 דקות. כעת אסבב את התאים במ centriuge כדי לאסוף אותם, ואז אבצע שאיבה.

אני עומד לבצע רספנדסיה (resus) בעוד מספר דקות כדי שאוכל לספור זאת. כעת, לאחר שביצעתי רספנדסיה וספירה, אני מוציא אליקוט ומדלל אותו ל-50 mils, מה שיעניק לי את הריכוז המתאים כדי להגיע למאה תאים לטיפה, וזאת כדי לוודא שהתאים תקינים. כעת יש לנו מאגר.

נניע את התמיסות מעט שוב, ונשפוך אותן אל תוך המאגר שלנו. אוקיי, זה כבר תוכנת. הנה זה קורה.

עכשיו זה די ישר. הפכו את המנה והניחו אותה בצד. בכל כמה מנות, אני פשוט מטה אותה מעט רק כדי שהנוזל ינוע מעט בפנים.

בסדר, אלו חמש צלחות. אני עומדת כעת להכניס אותן לאנקובטור. אלו הן טיפות התלייה שהנחנו לפני יומיים.

כדי לאסוף אותם, פשוט מנערים את הפלטות כדי לאסוף את הטיפות. אני פשוט אאסוף את הכל ואנסה לעשות זאת בעדינות כדי לא להפריע מדי ל-EVs; אני אקח חמישה או שישה מ"ל של PBS ואשטוף את הפלטות. לאחר מכן נשאיר אותן למשך 10 דקות לפחות, וה-EVs ישקעו על ידי כוח הכבידה.

לאחר שווידאתם חזותית שגופי העוברים (EBs) שלכם שקעו, הסירו את רוב המצע, אך לא את כולו, כדי לא להפריע להם. בסדר. כעת ננער אותם עד ליום השישי. אלו הם גופי עוברים שהוכנו לפני שישה ימים מתאי גזע עובריים של עכבר, ובדרך כלל כאשר אוספים אותם, אנו מסובבים מעט את הצלחות.

כאשר מסובבים את הפלטות, ה-eds נמשכים למעין מרכז הכלי וקל יותר לתקן אותם. כעת תניחו ל-eds לשקוע בעזרת כוח הכבידה לתחתית המבחנה, ולאחר מכן הסירו את המצע ושטפו פעם אחת עם 10 מ"ל, 10 עד 12 מ"ל של PBS. אוקיי, כעת נמתין דקה.

כעת אני פשוט אסיר את ה-P. כך אנו מוסיפים 250 µL מתערובת האנזימים שלנו, מוסיפים מילילטר ואז פשוט מניחים אותם במקלחית מים בטמפרטורה של 37 °C. מדי פעם, אולי פעמיים, אעבור ואנער אותם קלות רק כדי לערבב אותם, מכיוון שה-Ed שקע. כעת יש לנו את תמיחת הפירוק התאי (cell dissociation buffer) הזו, שהיא נטולת אנזימים, שאנו מקבלים מ-gpro.

נוסיף כ-8 mL מזה לכל מבחנה. לאחר מכן, נשתמש בפיפט של 5 mL כדי לערבב את התוכן; ככל שתערבבו, התמיסה תהפוך לעכורה מאוד. זהו סימן ויזואלי לכך שהתאים מתפזרים במצע ויוצרים עכירות. כעת אספור את התאים באמצעות שיטת tri exclusion; אם אתם מתכננים לבצע זיהום או מחשבים MOI, חשוב מאוד לבצע ספירה.

אני פשוט אכין מנה גדולה של נגיף בתוספת מדיום, תאים בריכוז המתאים וחלבון סולפייט. לאחר מכן, אני רק מוודא את התאים, ושוב, אני חושש שהתאים יצאו מהסספנסיון. לכן אני תמיד, וגם משתמש במכל קטן, אני מנסה להיזהר שלא ייווצרו יותר מדי נתזים, ואנחנו סבבים ב-2,500 rpm.

כעת אני אוסף את התאים שלנו מיום 10, ואני שומר את כל השטיפות. בעבר השתמשתי ב-PI (יודיד פרופידיום), אך 7 אינו בהיר באותה מידה. לכן הוא אינו מדליף לערוצים רבים כמו ה-PI, והוא נקי יותר.

כעת נגדיר את המשתנה, וזוהי דרך טובה למנוע איבוד בתוך המחט בשל הנפח. אני שאנון מקיני פרימן, פוסט-דוקטורנטית במעבדת ג'ורג' פמיליז בבית החולים לילדים בבוסטון.

היום נסקור כיצד להפיק אוכלוסיית תאים הניתנה להשתלה מתאי גזע עובריים של עכבר, למערכת ההמטופואטית. מדוע אנו מבצעים ניסוי זה? ובכן, אנו יודעים שבאמצעות מערכת זו ניתן להפיק – ראשית, הפרוטוקול הסופי פותח כדי להפיק אוכלוסיית תאים מתאי גזע עובריים בעלי פעילות של תאי גזע המטופואטיים, במובן זה שהם היו מסוגלים להציל עכברים מקרינה קטלנית, על ידי שיקום המערכת ההמטופואטית שלהם למשך זמן ממושך, לאורך כל חיי האורגניזם ובכל שושלות הדם הפריפריאלי.

זו הסיבה לפיה끔 פותח הפרוטוקול. כעת אנו עורכים ניסויים נוספים כדי להבין את הפנוטיפ של אוכלוסיית התאים בתוך האוכלוסייה המורחבת שהשגנו, אשר מתווכים בפועל את הפעילות של תאי גזע המטופואטיים אלו. זאת מכיוון שאיננו יודעים, ידוע לנו שהאוכלוסייה מאוד הטרוגנית וידוע לנו שהתא שמבצע למעשה את ההצלה של העכברים הוא נדיר ביותר בתוך אוכלוסיית תאים זו.

לכן אנו מנסים בעצם להגדיר את הפנוטיפ שלו כדי שנוכל לטהר אותו מתוך תאים הטרוגניים מאוד אלו. לאחר מכן, אנו מעוניינים בעיקר להבין כיצד הוא משתווה מבחינה תפקודית לתא גזע המטופואטי אמיתי שניתן להפיק ממוח עצם שלם. האם יש לו יכולת שיקום התפתחותית שווה, והאם נראה שהוא משקף HSC של מוח עצם בוגר?

או אולי זה עשוי להיות דומה יותר לתא גזע המטופואטי. ניתן למצוא התפתחות מוקדמת, למשל, ב-GM או בכבד העוברי. וזוהי בסופו של דבר הנקודה שאנו מנסים להבין, ואנו רוצים להבין את השאלות הללו מכיוון שבסופו של דבר, היינו רוצים שהפרוטוקול הזה יספק מידע לעבודות דומות שאנו מעוניינים לבצע עם תאי גזע עובריים אנושיים.

ואנו מרגישים שהמידע שנלמד באמצעות המערכת המתמטית יתניע, כפי שאתם יודעים, תועלת רבה לניסויים עתידיים אלו. אני חושב שישנם מספר דברים. ראשית, מדובר במודל in vitro טוב, וזהו מודל in feature טוב של התפתחות.

אנו מנסים להבין ראשית את התפתחותן של תאי גזע המטופואטיים. מדובר במערכת יעילה ומינימלית לבחינת ביטוי גנים אקטופי, ובדיקת האופן שבו גורמים אלו משפיעים על התפתחות תאי הגזע ההמטופואטיים. דבר זה מועיל מאוד מנקודת מבט של מדע בסיסי.

אך בסופו של דבר, אנו מעוניינים לגזור סוג של טיפול מבוסס תאים שניתן יהיה להשתמש בו באופן קליני להפקת תאי גזע מטבוליים שניתנים להשתלה מתאי אדם. אך הדבר הוא כנראה רחוק מההווה. למעשה, גילינו שהחלק הקשה ביותר אינווו השגת התאים עצמם, אלא מצאנו באמצעות ניסויים קפדניים, שהייתה תקופה שבה התקשנו לגרום לתאים לשקם את בעלי החיים המקבלים.

ומה שגילינו בסופו של דבר הוא שעלינו להקדיש תשומת לב רבה מאוד לאבלציה של הרסיפיינטים, מכיוון שתאים אלו אינם מסוגלים לכך. כך, בדרך כלל, כאשר מבצעים השתלה בעכברים עם bone marrow drive agec, נותנים 10 או 11 גרייס (grays) של קרינה כדי להקרין את העכברים, ותאי ה-bone marrow HSC מסוגלים למדי להציל את בעלי החיים מכך. ובכן, התברר שאוכלוסיית תאים זו שאנו מרביים אינה מסוגלת להציל בעלי חיים ממנה של קרינה גבוהה כל כך.

לכן, היה עלינו לכוון בזהירות רבה את מנת ההקרנה, תוך התחשבות בגודל בעלי החיים. זאת מכיוון שמצאנו כי אם בעלי החיים היו גדולים מדי וניסינו להשתמש באותה מנה, הם לא עברו אבלציה יעילה. אך שוב, אם לא מקרינים את בעלי החיים מספיק, התאים לא יהיו מסוגלים להתחרות במארחים בעלי עמידות גבוהה יותר.

לכן, ברגע שהבנו שזהו משתנה מרכזי המקשה עלינו לצפות בפעילות ה-ab של תאים אלו, וכשביצענו תיתוּר (titer) של מינון ההקרנה והבנו גם שגיל החיה ומשקלה משמעותיים מאוד, זה היה השלב שבו הניסויים שלנו החלו להניב תוצאות הניתנות לשחזור באופן עקבי. מה שגילינו הוא שאם משתמשים בבעלי חיים שמשקלם כ-20 גרם, בין 15 ל-20 גרם, ומבצעים להם אבלציה במינון של 9.25 gray, נראה שזהו המינון המושלם המעניק לתאים הללו את היתרון הדרוש להם כדי לשחזר את העכברים. כן, אני חושב שזה היה אחד המשתנים החשובים ביותר.

הדבר המשמעותי הנוסף הוא מספר התאים שאתם מזריקים. ביצענו גם תיתוּר (titer) תחת תנאים ספציפיים אלה עבור הקרנת אורגניזם המודל שלנו. כמו כן, תיתרנו את מספר התאים מהמאגר ההטרוגני והלא-מופרד שזרקנו לעכברים.

ומעשה למעשה מצאנו שנדרש מינון מינימלי של כ-2 מיליון עד 5 מיליון תאים כדי להציל את החיות. אם מזריקים פחות מכך, החיות אינן ניצלות. ואני חושב שזה מעיד על כך שסביר להניח שרק חלק קטן מהתאים הוא זה שמתווך את ההצלה בתוך המדגם ההטרוגני הזה.

לכן אני חושב שהמשתנים החשובים ביותר הם מספר התאים שאתם מזריקים, וההבטחה שבכל מודל השתלה שבו אתם משתמשים, אתם מקרינים אותם באופן מספיק כדי להעניק לתאים את היתרון הדרוש להם כדי להתרגש, אך לא באופן כה חזק עד שהם פשוט לא יהיו מסוגלים להציל אותם. אלו היו המשתנים המרכזיים והעיקריים.