שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם
2 בדצמבר 2009
בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד ללמוד In vivo. כאן, אנו מציגים רומן במבחנה גישה לחקור אינטראקציות חלבון-RNA באמצעות מאגר סינתטי אוליגו כי אריחים על פני אזורים נבחרים של mRNA מראש.
כדי למפות את אתרי הקישור של חלבונים גרעיניים ריבו על pre mRNAs התחל בריצוף על פני האזור המיועד של ה-prem NNA המעניין ב-30 חלונות נוקלאוטידים וסינתז את האוליגו המרוצף על מערך. האוליגו מבושלים מהמערך ומזרזים עם RNP מעניין. מאגר ההתחלה הכולל מסומן ב-SCI שלוש והמאגר המאוגד מסומן ב-SCI חמש, ושניהם מוחלים על מערך הזיהוי.
לאחר מכן המערך נסרק ותוכנת חילוץ התכונות משמשת לפירוש התוצאות. מלחי. היי, אני קייט ווטקינס מהמעבדה של האח וויל פייר במחלקה ל-MCB באוניברסיטת בראון. היום אראה לכם הליך מהיר וזול לקביעת המיקום המדויק של קומפלקס חלבון RNA על prem RA במעבדה, לסנתז מחדש prem A כמאגר של אוליגונוקלאוטידים חופפים.
לאחר מכן ניתן להפריד את המאגר הזה לשבר קשור ולא קשור על ידי משקעים חיסוניים משותפים ולאחר מכן לנתח אותו על ידי מיקרו-מערך. בעוד שלהליך זה יש יישומים רבים, אנו משתמשים בו כדי לחקור גורמי שחבור מרובים ותפקידם וחבור חלופי. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בדפדפן הגנום uc SC כדי להוריד גנים מסוימים, צמתים של חיבור או תחומי עניין אחרים שמהם ניתן לעצב את מאגר ה-prem A. בחר את החלונות המעניינים, ואז פרש אותם באופן חישובי עם אורך קריאה של 30 נוקלאוטידים וחפיפה של 20 נוקלאוטידים כך שכל אוליגו מוסט 10 נוקלאוטידים מהקודם. כעת, כשמוגדרים 30 אוליגוס ארוכים נוקלאוטידים מאגפים כל אחד עם רצפי פריימר אוניברסליים.
שלח את האוליגו ל-Agilent להדפסה על מיקרו-מערך אוליגונוקלאוטידים מותאם אישית. לאחר שהמיקרו-מערך מגיע, התחל לשחזר את אוליגוס ה-DNA מפני השטח שלו על ידי הנחת שקופית כיסוי המערך בתא הכלאה של מערך והזרמת בעדינות של 500 מיקרוליטר של מים נטולי יונים על המגלשה. הנח את שקופית המיקרו-מערך עם הפנים כלפי מטה על גבי שקופית הכיסוי כך שהתוויות בכל שקופית פונות זו לזו והקפידו להימנע מבועות אוויר שעלולות לשבש את תהליך התאוששות האוליגו.
סגור את תא ההכלאה וסובב אותו למשך הלילה ב-99 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה למחרת, הסר בזהירות את המערך מהתא ושאב את המים, המכילים כעת את האוליגו ששוחררו משטח המערך. הנח את מאגר האוליגו המשוחרר בצינור איינור של 1.5 מיליליטר וסוניקט כדי לפרק גושים פוטנציאליים באמפליטודה של 50% שלוש פעמים למשך שלוש עד חמש פעימות שניות בכל פעם. לאחר מכן, הגבר את המאגר על ידי PCR במחזור נמוך באמצעות פריימרים אוניברסליים עם מקדם T המצורף לקצהו.
מספר המחזורים הנדרשים עשוי להשתנות בהתאם ליעילות התאוששות האוליגו. הימנע מהגברת יתר, הנראית כרצועה מרוחה על ג'ל אקרילאמיד. לבסוף, השתמש בערכת הסקריפט הקצר מבית Amon כדי לתמלל RNA.
סיים את תגובת השעתוק על ידי מיצוי פניל כלורופורם של ה-RNA, ואחריו משקעי אתנול באמצעות נתרן אצטט וגם גליקו כחול כנשא. Resus משהה את כדור ה-RNA ב-105 מיקרוליטר של מאגר TE. כדי לקבוע במדויק את ריכוז ה- RNA.
השתמש בירוק ריבו כדי ליצור עקומה סטנדרטית. לאחר מכן מדוד באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. מאגר ה-RNA מוכן כעת למשקעים חיסוניים משותפים כדי להתחיל במשיכה.
ראשית, הכינו את החרוזים המגנטיים על ידי שילוב חרוזי דינה של חלבון A וחלבון G ביחס של אחד לאחד לנפח סופי של 50 מיקרוליטר לתגובה. רכזו את החרוזים במקום אחד באמצעות מעמד הפרדה מגנטי על מנת להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים בנפח שווה של קור אחד XPBS לאחר הכביסה השנייה.
Resus, השעו את החרוזים בנפח שווה של XPBS קר והוסיפו שני ננוגרם של הנוגדן פריון. כמות זו עשויה להשתנות בהתאם לנוגדן, ולכן ייתכן שיהיה צורך בניסויים כדי למצוא את התנאים האופטימליים לקשירת הנוגדן לחרוזים. דגרו את התערובת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת.
בבוקר, הוסף שני מיקרוגרם לכל תגובה של RNA כולל של שמרים סוניקציה כדי לחסום קשירה לא ספציפית וסובב במשך 30 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר סיום שלב החסימה, השתמש שוב במדף המגנטי כדי להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את החרוזים פעמיים בקור אחד XPBS והשאירו את ה-PBS מהכביסה השנייה בצינור 50 מיקרוליטר מתערובת החרוזים לצינורות חדשים.
צינור אחד לכל תגובת IP משותפת. החרוזים מוכנים כעת ל-co-ip. לאחר מכן, הכינו את תערובת המאסטר על ידי שילוב מאגר ה-RNA oligo עם תמצית תאים גרעיניים.
כמקור RNP, קח 50 מיקרוליטר של תערובת המאסטר כהגנה כוללת על הדגימה ניתן להוסיף פריימרים, שהם גרסאות RNA של הפריימרים האוניברסליים כדי למנוע קשירת חלבון לרצף הפריימר או הכנסת מבנה משני ל-RNA. כדי להתחיל את המשקעים החיסוניים, הסר את הסופרנטנט מעליית החרוזים והשהה מחדש את החרוזים ב-120 מיקרוליטר מתערובת המאסטר שנותרה. נדנד את התגובות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.
בסוף הדגירה, ניתן להסיר Eloqua קטן, כולל החרוזים, מכל קו-איפ. לבדיקה נוספת של יעילות או ספציפיות קשירה, הנח את שארית התגובות על המגנט והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן יש שטיפה אחת או שתיים עם XPDS קר.
ה-RNA הקשור לנוגדנים על החרוזים דרך ה-RNP הוא דגימת ה-IP. השעו מחדש את חרוזי ה-IP ב-50 מיקרוליטר של 1%SDS במאגר 0.1 XTE וחממו את הדגימות ב-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי לסלק את ה-RNA, הסר את הסופרנטנט, המכיל כעת את ה-RNA שהיה קשור בעבר לחרוזים ונקה על ידי מיצוי פניל כלורופורם, ואחריו משקעי אתנול, השהה מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר 0.1 XT.
לאחר מכן, תמלל הפוך את הדגימות באמצעות פריימרים אוניברסליים הפוכים. לאחר מכן PCR מגביר את הדגימות עם הפריימרים האוניברסליים, שאחד מהם אמור להכיל מקדם T 7. מספר המחזורים הנדרשים להגברת הבריכה יהיה תלוי ביעילות ה- co ip.
השתמש בערכת התסריט של מגה קצרים מאמביון, תמלל שוב את הדגימות, אך הפעם הוסף שני מיקרוליטר של אלל אמינו UTP במקום ה-T שבע UTP שמגיע עם הערכה. האמינו אלל UTP ישמש מאוחר יותר לתיוג ה-RNA בעיניים הצדדיות. לאחר השלמת התמלול.
תמצית פניל כלורופורם ואתנול מזרזים את הדגימות. אין להשתמש בגליקו כחול או אמוניום אצטט, מה שעלול להפריע להכלאה של הדגימות למערך. Resus משהה את הגלולה ב-4.5 מיקרוליטר של 0.1 נתרן פחמתי מולרי.
כדי לתייג את הדגימות תחילה, הוסף 2.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לדגימה הכוללת. הוסף שלושה מיקרוליטר של S3 ולדגימת ה-IP בשלושה מיקרוליטר של SCI חמש. דגירה בחושך למשך שעה.
בטמפרטורת החדר, יש לסיים את התגובה על ידי הוספת שישה מיקרוליטרים של ארבעה הידרוקסיל לאמין HCL מולארי לכל דגימה, לערבב היטב ולסובב. דגירה קצרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, טהר את הדגימות המסומנות על ידי מיצוי פניל כלורופורם, ואחריו משקעי אתנול. רוב הצבע נמשך כלפי מטה לתוך הפאזה האורגנית עם הנוקלאוטידים החופשיים, כך שהכדורים עשויים שלא להיות צבועים באופן גלוי.
Resus משהה כל כדור ב-50 מיקרוליטר של 0.1 XTE. עקוב אחר הוראות ערכת ההיברידיזציה של מערך Agilent כדי להכין את דגימת המיקרו-מערך עם החריג הבא. אל תפצל את ה- RNA לאחר הוספת מאגר הפיצול הוסף מיד את מאגר ההכלאה על מנת לעצור את הפיצול.
הניחו את הדגימות על המערך והיברידיו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות בזמן שהמערך מסתובב. הכן את התמיסות הבאות של 50 מיליליטר בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. צינור אחד של שני מאגר SC עודף, שני צינורות של מאגר ים עודף אחד וצינור אחד של מים נטולי יונים.
לאחר שלוש שעות הדגירה, פתחו בזהירות את כריך שקופיות המערך והניחו בשני מאגרי ה-XSSC. בעזרת פינצטה. הפרד בעדינות את המערך משקופית הכיסוי.
הסר בעדינות את שקופית הכיסוי, הקפד לא לגעת במערך. כאשר המגלשה נשלפת החוצה, סגור את החרוט והפוך בעדינות למשך 60 שניות. בעזרת הפינצטה, העבר את המערך לפתרון XSSC אחד.
יש לסגור את השפופרת ולהפוך בעדינות למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את המערך לפתרון XSSC השני ושוב, הפכו בעדינות למשך דקה נוספת. לבסוף, העבירו את המערך לצינור המים נטולי היונים והפכו בעדינות למשך 30 שניות.
יבש את המערך על ידי הנחת שולי השקופית על מגבון קים. המשך לסובב את המערך על המגבון, הקפד לא להפריע לצד המכיל את האוליגו. הנח את המערך בצינור חרוטי ריק והמשך לסרוק את המערך.
המשך לסרוק את המערך. הנה מערך מייצג. כל תכונה או אוליגו צבועים בירוק עבור המאגר הלא מועשר הכולל או באדום עבור המאגר המועשר ב-IP.
האות בכל תכונה מנורמל לעוצמה הכוללת באותו ערוץ. הפלט הסופי הוא יחס היומן של הערוץ האדום על פני הערוץ הירוק. בכל תכונה במערך, הציון הממוצע בכל קואורדינטה גנומית ממופה למיקום הנתון.
המחשה של שלב ממוצע זה ניתנת עבור שלושה אוליגוס נוקלאוטידים חופפים עם ציונים של שתיים, ארבע ו-0.5, כאשר מוצג ציון ההעשרה הממוצע עבור כל חלון של 10 נוקלאוטידים. הנה דוגמה לתוכנית קשירה עבור חלבון הקישור העווקב אחר פולי פרין PTB בגן CLTA תכונות הגן ניתנות לאורך החלק התחתון וציוני ההעשרה הממוצעים עבור ה-S הקשור ל-PTP מיוצגים על ידי פסים אנכיים אדומים כהים. פסים אדומים בהירים מציגים אזורים שאינם מועשרים עבור כריכת PTP.
זה עתה הראיתי לכם כיצד ליצור במהירות וביעילות מאגר אוליגונוקלאוטידים שמתפרס על פני אזורים מעניינים, כגון אקסונים חתוכים לחלופין. אנו מנתחים את המאגרים שלנו על ידי מיקרו-מערך, אך ניתן גם לרצף אותם על ידי ריצוף אור, לקסי או ריצוף סנגר מסורתי יותר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שיצירת המאגר פתוחה לשינוי ברמת ה-RNA או החלבון.
ברמת ה-RNA, אנו יכולים להכניס אזורים אוטולוגיים, מוטציות מחלה, פולימורפיזמים או מוטציות אקראיות לרצף האוליגונוקלאוטיד. ברמת החלבון, ניתן לשנות את גורם קשירת ה-RNA על ידי זרחון או שינויים אחרים לאחר התרגום. כמו כן, ניתן לתמרן את סביבת הקישור כדי להגדיל או להקטין את הרמות של גורמים נוספים המתחרים או מקיימים אינטראקציה עם חלבון קושר ה-RNA המעניין.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מהירה וחסכונית במשאבים למשקוף (mapping) ברזולוציה גבוהה של אתרי קישור של ריבונוקלאו-חלבון (RNP) על pre-mRNA באופן in vitro. באמצעות סינתזה של מאגר מותאם אישית של אוליגנוקלאוטידים חופפים המכסים את האזורים הרלוונטיים, הפרוטוקול מאפשר זיהוי מדויק של אינטראקציות חלבון-RNA, ובכך מתגבר על הטיות המובנות בגישות מסורתיות של co-immunoprecipitation (co-IP) ו-SELEX.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של RNA
- ביולוגיה מולקולרית
- שחוץ אלטרנטיבי
רקע
- גישות מסורתיות של co-IP וריצוף מוטות לטובת RNA בשפע גבוה, מה שמגביל את חקרם של מיני pre-mRNA חולפים.
- מיקום ההיקשרות של חלבוני קישור ל-RNA (RBPs) קובע לעיתים קרובות את תפקידם בבקרת השבביה (splicing).
- שיטות קיימות מתקשות במיפוי אינטראקציות RNP על RNA בשפע נמוך או על RNA חולף.
- ניתן לתכנן מאגרי אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישית כדי להכווין לאזורי pre-mRNA ספציפיים, דבר המאפשר מחקרים מותאמים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לאחيانة, בעלת רזולוציה גבוהה ונטולת הטיות, למיפוי אתרי קישור של RNP על pre-mRNA.
- מתן אפשרות למחקר של גורמים מבניים וגורמים תלוי-רצף המשפיעים על קישור RNP.
- אספקת פלטפורמה גמישה לבחינת השפעות של מוטציות או פולימורפיזמים על אינטראקציות של RNP.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וסינתזה של אוליגוניוקלאוטידים חופפים באורך 30 נוקלאוטידים המכסים אזורים נבחרים של pre-mRNA.
- השבה והגברה של אוליגואים ממערך זעיר (microarray) מותאם אישית, ולאחריה תמלול in vitro ל-RNA.
- שיקוע חיסוני משותף (co-IP) של מאגר ה-RNA עם ה-RNP הרלוונטי באמצעות חרוזי מגנט מצומדים לנוגדנים.
- הפרדה של פראקציות RNA קשורות ולא קשורות, סימון פלואורסצנטי והibridiזציה למערך זעיר לזיהוי.
- סריקה וניתוח של נתוני המערך ליצירת מפות קישור ברזולוציה גבוהה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מייצרת מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי קישור של RNP על pre-mRNA.
- היא מאפשרת זיהוי של מאפיינים רצפיים ומבניים המשפיעים על קישור RNP.
- הגישה מונעת הטיית דגימה כלפי mRNAs שמימם גבוה, כפי שניתן לראות בשיטות IP ו-SELEX מסורתיות.
- גמישות בתכנון מאגר האוליגוז מאפשרת מחקרי מטרה של אזורים ספציפיים, מוטציות או פולימורפיזמים.
מסקנות
- טכניקת המיפוי in vitro זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות RNP של מיני pre-mRNA זמניים או כאלה המצויים בריכוז נמוך.
- השיטה מהירה, זולה וניתנת להתאמה לצרכים ניסויים שונים.
- היא מאפשרת ניתוח רחב היקף של ספציפיות קישור RNP וההשפעה הפונקציונלית של וריאציות ברצף.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיפוי אתרי קישור של ריבונוקלאו-פרוטאין (RNP) על pre-mRNA ברזולוציה גבוהה הוא קריטי להפחתת סיכונים באימות מטרות ולהבנת תפקודי גורמי שחבור (splicing factors) בשלבי הגילוי המוקדמים. שיטה מהירה זו, בעלת תפוקה גבוהה ובביצוע in vitro, מאפשרת בחינה בלתי מוטה של אינטראקציות RNA-חלבון, תוך התגברות על הטיות דגימה הנובעות משכיחות החומרים ותמיכה בביטחון ניבוי במחקרי מנגנונים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול פורטפוליו על ידי מתן אפשרות לניתוח שיטתי של קובעי מבנה ורצף ספציפיים בקישור RNP.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי מדויק של אתרי קישור של RNP כדי להבהיר את מנגנוני גורמי השחזור (splicing factors).
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי זיהוי גורמים רצפיים ומבניים הקובעים את הקישור.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרות על ידי הפחתת הטיות דגימה כלפי RNA שכיחים.
- מאפשר בחינה רחבה של השפעת מוטציות או פולימורפיזמים על אינטראקציות של RNP בקנה מידה גדול.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין סובסטראטים מאוששים של RNA לצורך סריקה של חלבונים נקשרי-RNA במקומים הבאים.
- מספק נתוני העשרה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר מיפוי רחב-היקף (high-throughput) הניתן להרחבה וניתן להסתגלות לאזורי RNA שונים ולצרכים ניסיוניים מגוונים.
- תומך בהערכה אמינה של השפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות על קישור RNP.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אירועי שחבור הרלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למיפוי ממוקד של אזורים בעלי משמעות קלינית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במחקרים פונקציונליים של וריאנטים ברצף.
- מפחית סיכונים בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי הבהרה של ספציפיות האינטראקציה של RNP.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים דרך זיהוי מובילים (leads) ומחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות מונחה-השערות ובפיתוח בדיקות (assays).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי ספציפיות קישור של RNP והבהרה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת פלטי העשרה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של המערך.
- אנליטיקה: מייצרת מפות קישור ברזולוציה גבוהה ומדדי העשרה של יחס לוגריתמי (log-ratio) לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תומכת במיפוי של מוטציות או פולימורפיזמים רלוונטיים למחלה המשפיעים על אינטראקציות RNP.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה אישית לשימוש חוזר במטרות ובאזורי RNA מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי אינטראקציה בין RNA לחלבון.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי מיפוי סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים יעילה של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות המכוונות ל-RNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון אוליגו-נוקלאוטידים, טיפול במערכים של מיקרו-מערכים (microarrays) וביוכימיה של RNA-חלבון.
- דורש גישה לתשתיות של סינתזת מיקרו-מערכים בהתאמה אישית, סימון פלואורסצנטי וסריקת מערכים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנון מאגרי אוליגו-נוקלאוטידים ושל צינורות עיבוד נתונים.
- ניתן להתאמה לאזורי RNA שונים, מוטציות ומודיפיקציות של חלבונים בהתאם להתפתחות הצרכים הניסיוניים.
- תלוי באופטימיזציה של הנוגדן ומקור ה-RNP לצורך ספציפיות קישור מוגדרת.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:17
Pool Design and Oligo Recovery
3:53
Co-immunoprecipitation of the Oligo Pool with an RNP of Interest
7:50
Labeling the Samples and Hybridizations to the Microarray
10:50
Mapping RNPs on Pre-mRNAs Representative Results
11:56
Conclusion
