Name: הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: למדו כיצד לתעד פעילות חשמלית ברשתות עצביות שלמות במערכת העצבים המעיים של חזירי גינאה באמצעות צבעים רגישי מתח. הפרוטוקול מדגים ניתוח רקמות, צביעה אופטית וניתוח תמונות ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות התובע קולטר (CHOP) עבור ומאפשר לנו להשתמש מיקרוסקופ 2-פוטון שלו לרכוש את 2-פוטון מהתמונות המוצגות בתחילתו של וידאו, וה &#39;טאקאנו לשיתוף איתנו המומחיות הטכנית שלו.

<ol><li>Johnson, L. eonard R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCosta%2C+Marcello+%22in+Physiology+of+the+Gastrointestinal+Tract%2C+edited+by+Leonard+R%22">in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R</a>. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).</li>
<li>Obaid, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+activity+in+an+intact+mammalian+network+with+single-cell+resolution%3A+optical+studies+of+nicotinic+activity+in+an+enteric+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus.</a> J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).</li>
<li>Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+naphthylstyryl-pyridinium+potentiometric+dyes+offer+advantages+for+neural+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).</li>
<li>Hirst, G. D., McKirdy, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+potentials+recorded+from+neurones+of+the+submucous+plexus+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine.</a> J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+in+Cellular+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Current Methods in Cellular Neurobiology.</a> Barker, J., McKelvy, J. , John Wiley and Sons, Inc. New York. 139-139 (1983).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-stable+non-coherent+light+source+for+optical+measurements+in+neuroscience+and+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+studies+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+in+the+guinea-pig+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system.</a> J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+with+single+cell+resolution+from+a+simple+mammalian+nervous+system%3A+Electrical+activity+in+ganglia+from+the+submucous+plexus+of+the+guinea-pig+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum.</a> Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).</li>
<li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).</li>
</ol>

פרוטוקול זה נכתב עם שני שערים בראש. הראשון הוא לשכנע חוקרים אחרים, בזכות ההתקדמות הטכנולוגית הרבה של העשור האחרון, הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית באמצעות מתח רגיש צובעת הפך אחד, מתודולוגיות החזק ביותר אמינה ובמחיר סביר ללימוד רשתות נוירונים שלמים, ואכן , זה יכול להיות מיושם בקלות גם במעבדה לאחר משאבים צנועים. המטרה השנייה היא לקדם את מערכת העצבים enteric כמודל ניסיוני ייחודי בו כדי לקשר בין אירועים מולקולריים הסלולר עם ההתנהגות החשמלית של שני plexuses העצבית ותפוקות הביולוגי שלהם...

<table><tbody><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769</td><td>עם מלחים של Earle&amp;rsquo;, ללא L-Glutamine, Phenol Red ו-Sodium Bicarbonate</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>ערכה של silicone elastomer 184</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים לה dissection</td><td>F.S.T.</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>פינצטות Dumont</td><td>F.S.T.</td><td>11203-23 או 11200-33</td><td></td></tr><tr><td>מספרי קפיץ Moria MC19/B Pascheff-Wolff</td><td>F.S.T.</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>סיכות להחזקת הרקמה במהלך הניסוי</td><td>Seirin Corp.</td><td>Seirin Spinex</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0773</td><td></td></tr><tr><td>Protease IX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6141</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10439-016</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPDHQ</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D36802</td><td></td></tr><tr><td>מחולל גירויים בעל 4 ערוצים</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>סדרה 2000</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Rainin</td><td>Dinamax RP-1 בעל 2 ערוצים</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>מקטן 1:10 / עדשת ממסר</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אנכי</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61TRF</td><td></td></tr><tr><td>במה קבועה Gibraltar עם מתרג X-Y ממוטור</td><td>Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada</td><td>PSSG--BX2</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות מטריצה ליניאריות</td><td>FHC, Inc.</td><td>הזמנה מיוחדת</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות אקטיבי</td><td>Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA</td><td>Micro 60</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח מיוצב עם משוב בעל רעש נמוך במיוחד (Ultra-low-ripple)</td><td>Kepco, Flushing, NY</td><td>ATE 75-15M</td><td></td></tr><tr><td>מסנן חום</td><td>Schott AG</td><td>KG-1</td><td></td></tr><tr><td>מסנן התאבכות High-Q</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ530/50</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואיים</td><td>Chroma Inc.</td><td>565 nm (50% transmission)</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מעבר ארוך (Long-pass filter)</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ572LP</td><td></td></tr><tr><td>וילונות אקוסטיים</td><td>Acoustical Surfaces, Inc.</td><td>BSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Neuroplex</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה, עם בקר מצלמה ייעודי</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frame-grabber למצלמה ברזולוציה גבוהה</td><td>Data Translation</td><td>DT3120K-1</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת דימות למצלמה ברזולוציה גבוהה</td><td>Data Translation</td><td>Global Lab Image/2</td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצמאי המזוהה עם פונקציות, מסוגל לבצע התנהגויות מורכבות בבידוד. הנוירונים שלה (10-25 מיקרומטר קוטר) מסודרים plexuses כי מוגבלים מטוסים שונים של דופן המעי<sup&gt; 1</sup&gt;; מקלעת myenteric ניתן למצוא בין שכבות השריר האורך מעגליות, ואת מקלעת submucous בין שכבת השריר עגולים רירית. מאז מערכות עבור מפעיל plexuses אלה (הובלת אפיתל, תאים האנדוקרינית, אלמנטים החיסונית, כלי דם ושרירים חלקים) כלולים גם בתוך קיר הבטן, חצי שלם ההכנות יכול להיות גזור כי לשמר רכיבים בודדים של רפלקס מסלולים שונים. ההתנהגות של מערכות מפעיל נשלטת על ידי plexuses submucous ו myenteric הפועל קונצרט. לכן, ידע מפורט של אינטראקציות הסינפטית בתוך ובין הגרעינים, ואת התקשורת בין plexuses, הוא חיוני להבנת תפקוד תקין של מערכת העיכול. ENS, כמו מערכת העצבים תמים, הוא מודל ניסיוני ייחודי שבו ניתן לתאם אירועים מולקולריים הסלולר עם ההתנהגות החשמלית של הרשת העצבית ותפוקות הפיזיולוגי שלה. בגלל ארגון מעין דו מימדי של plexuses שלה, ENS הוא גם מתאים במיוחד ללימוד רשתות עצביות באמצעות מספר רב של טכניקות הקלטה אופטית אתר המעסיקות מתח רגיש צבעים<sup&gt; 2,7,8,9</sup&gt;. נדגים כאן את השימוש חדש יחסית naphthylstyryl-pyridinium צבען (di-4-ANEPPDHQ)<sup&gt; 3</sup&gt; זה מציע יתרונות רבים על פני קודמיו, כולל phototoxicity נמוך מאוד, קצב איטי של הפנמה, ואת היציבות הכימית מדהים. הפועל בשיתוף עם מצלמה המאפשרת משנה אלפית שנייה זמן רזולוציה, צבע זה מאפשר לנו לנטר את הפעילות החשמלית של כל הנוירונים בתחום של נוף עם רזולוציה מרחבית מקסימלית של ~ 2.5 מיקרומטר בהגדלה 100x. בהגדלה נמוכה (10X או 20X), להקריב את ההחלטה תא בודד הוא פיצוי לזכות בפרספקטיבה, חושף את המורכבות של המעגלים בין ganglionic.

פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.

מערכת העצבים האנטרية (ENS) היא רשת עצמאית בעלת תפקודים מזוהים, המסוגלת לבצע התנהגויות מורכבות באופן מבודד. הנוירונים שלה...

סרטון זה מדגים את הניתוח והדימוג העוקב של דגימות ממערכת העצבים האנטרית שעברו גרייה חשמלית, תוך שימוש בצבע רגיש למתח D-4ANEPPDHQ. מקטע קטן של המעי נלקח מחזיר גינאה שהורדמה והופרד בניתוח כדי לחשוף תחילה את הסובמוקוזה ובסופו של דבר את הפלקסוס המיאנטרי לצורך הקלטות אופטיות. לאחר לכידת תמונה ראשונית ברזולוציה גבוהה, אלקטרודות מונחות על רקמה מקובעת שנצבעה ב-D-4ANEPPDHQ.שינויים אופטיים המעידים על פעילות חשמלית נרשמים באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. במהלך הרכישה במהירות גבוהה, מוחל גירוי חשמלי. התמונה ברזולוציה הגבוהה מונחת לאחר מכן על מפת הפיקסלים של המצלמה במהירות גבוהה לצורך ניתוח באמצעות neuro plex.שלום, אני בריאן זלצברג, מנהל המעבדה לאופטיקה תאית, או loco כפי שאנו אוהבים לקרוא לה, במחלקה למדעי העצבים באוניברסיטת פנסילבניה. שמי אנליה אובידה, אני גם חברה במעבדה לאופטיקה תאית.היום נציג בפניכם פרוצדורה להקלטת פעילות חשמלית מרשתות נוירונליות של יונקים בשלמותן באמצעות צבעים רגישים למתח. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור את הקישוריות הנוירונלית בתוך ובין שתי הרשתות המרכיבות את מערכת העצבים האנטרית, המכונה גם "המוח השני" או "מוח המעי". אז בואו נתחיל.התחילו בהכנת תכשירים של תת-הרירית (sub mucus) והפלקסוס האנטרי (enteric plexus) על ידי כריתת המעי הדק של חזיר ים מסוג Hartley השוקל 150 עד 200 גרם או בן שבועיים עד שלושה שבועות, אשר הורדם באמצעות שאיפת isof fluorine ועבר עריפת ראש. לאחר מכן, הסירו את תכולת המעי על ידי שטיפת הלומן בפתרון M1 99 DM חמים ומחומצן. גזרו מקטע מעי באורך 8 עד 10 סנטימטרים, תוך הקפדה על שימור הפולריות.העבירו זאת למנתקי זכוכית בני 10 סנטימטרים מצופים ב-sard, המכילים M1 99 DM בטמפרטורת החדר. הניחו את המנתקי על מיקרוסקופ דיסקציה עם תאורת שדה אפל. לאחר מכן, באמצעות מספריים, פתחו את השוליים המזנטריים והשתמשו בסיכות לחרקים כדי לקבע את מקטע המעי כאשר צד הרירית פונה כלפי מעלה.חשוב מאוד לשמור על מתיחות אחידה כדי שלאחר הקיבוע תהיה לרקמה צורה מלבנית עם שורות של vili ריריים המיושרות באופן סדיר, תוך החזקת פינצטת Dumont עדינה בעלת קצוות ישרים במצב כמעט אופקי. קלפו את הרירית על ידי תפיסת ה-VII בקצה אחד של מקטע המעי ומשיכה לאורך הציר האורכי של הרקמה. המשיכו להפריד רצועות של רירית כדי לחשוף את הסוב-מוקוזה (submucosa) המכילה את הגנגליונים התת-ריריים ואת כלי הדם התת-ריריים.בשלב הבא, בעזרת מספריים עדינים מאוד, בצעו חתך בשכבת התת-רירית (submucosal layer) בהתאם לכיוון הסיבים השריריים המעגליים. לאחר מכן, הרימו בעדינות רבה את התת-רירית בעזרת פינצטה עדינה, תוך כדי דחיקה של השריר המעגלי כלפי מטה באמצעות המספריים, וחתכו לאורך השוליים האורכיים.שחרר את הסוב-מוקוזה (submucosa) משאר הדגימה ככל שההפרדה מתקדמת. כעת בצע חתך שני בהתאם לכיוון סיבי השריר המעגליים, במרחק של 1.5 עד שלושה סנטימטרים מהחתך הראשון, כדי לקבוע את הגודל הסופי של דגימת הסוב-מוקוזה; מקטע הסוב-מוקוזה המתקבל הוא בעובי של 30 עד 50 micrometers ונראה דמוי רשת דקה. העבר אותו לכלי syl guard אחר המכיל M1 99 DM טרי, וקבע אותו בעדינות וללא מתיחה באמצעות סיכות.לאחר מכן, הניחו את הצלחון בתא מחומצן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. מקטע המעי המקורי אמור כעת להיות נטול רירית וסב-רירית, והשריר המעגלי אמור להיות חשוף. מקטע זה משמש כעת להפקת תכשיר של הפלקסוס המיאנטרי (myenteric plexus) כדי לחשוף את הפלקסוס המיאנטרי.הסיר ככל האפשר את שכבת השריר המעגלית באמצעות פינצטה דקה בעלת קצה ישר, על ידי משיכת צרור סיבים מכל צד של הדגימה. לא ניתן להפריד את הפלקסוס המינטרי (myenteric plexus) החשוף משכבת השריר האורכית ומסביב ל-CI שמתחתיה. העבר את דגימת הפלקסוס המינטרי לכלי חדש מצופה ב-sard המכיל M1 99 M מחומצן. לאחר מכן, קבע באופן רפוי את הדגימה המכילה שריר חי באמצעות סיכות. מספר דקות לפני הניסוי האופטי, העבר את הדגימה לכלי קטן יותר מצופה ב-syl guard, המלא כבר ב-M1 99 DM המכיל 2 µM של nefe למניעת התכווצות השריר, וקבע אותה בבטחה על ידי הצבת מספר סיכות דקות מאוד בזהירות מסביב להיקף הכלי.וודאו שהמתיחה מפוזרת באופן שווה ושהרקמה מונחת בצורה שטוחה לחלוטין על תחתית ה-sil guard. הכנת הרקמה מוכנה כעת לניסויים פיזיולוגיים. הכינו מבחנה מזכוכית המכילה תמיסה עומדת של 5 עד 50 µg/mL של DAI four A-N-E-P-P-D HQ ב-M1 99 M עם 2 µM nifedipine, וכסו אותה בנייר אלומיניום.אתנול מהתמיסה המרוכזת צריך להוות פחות מ-0.5% מהתמיסה של M1 99 DM עם Nifedipine שכיסתה את הדגימה, ולהחליפה בתמיסת הצבע שהוכנה. באמצעות נפח מספיק של הסולם כדי לכסות לחלוטין את הרקמה, יש להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 30 דקות לאחר ההדגירה. שטוף את הדגימה עם M1 99 M מחומצן פלוס NEFE על ידי החלפה של כל תוכן התא.הקלטה אופטית של פעילות נוירונלית בדגימות שעברו גירוי חשמלי מבוצעת באמצעות מערכת המורכבת ממיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) זקוף המצויד במפצל תמונה, מצלמה מהירה בעלת דיוק ורזולוציה נמוכה, מצלמה בשחור-לבן בעלת רזולוציה גבוהה, מחולל גירויים הנשלט באמצעות מחשב, ומיקרו-מניפולטור. המכשירים כולם מורכבים על שולחן בידוד רעידות פעיל ומוקפים בווילונות אקוסטים כבדים ובגג מיילר (Mylar) כדי למזער רעידות נישאות באוויר. על אף שניתן לבצע רכישת תמונות משתי המצלמות באמצעות מחשב בודד המריץ את תוכנות neuro plex ו-Global Lab image two או כל תוכנה אחרת לרכישת תמונות, המערך המוצג כאן משתמש בשני מחשבים, כאשר כל אחד מהם שולט במצלמה נפרדת לצורך תחילת הניסויים האופטיים.הנח את התא המכיל את הדגימה המקומית הצבועה על משטח המיקרוסקופ. מכיוון ש-D four A ו-EPPD HQ הם צבעים שאינם קבועים בממברנה הפלואורסצנציה שלהם מופיעה רק בסביבה ליפידית, נוירונים בריאים מהכנה צבועה של מערכת העיכול צריכים להיראות כבלונים ריקים תחת כל הגדלה הגבוהה מ-20 x בעת הצפייה. השתמש במסננים HQ 5 35 50 לעירור, HQ 5 72 LP four לפליטה ובמראה דיכרואי של 5 65 nanometer.בשלב הבא, בעזרת בקרים של מיקרו-מניפולטור, מקמיאו מערך אלקטרודות ליניארי רב-חורי בקצה הפה של הרקמה, תוך וידוא שהאלקטרודה אינה נוגעת בעדשת המיקרוסקופ. מערך ליניארי המכיל 10 אלקטרודות טונגסטן המפוזרות על פני טווח של סנטימטר אחד מסוגל לעורר מספר מסלולים עצביים בלתי תלויים, והוא מתאים מאוד לחקר מעגלים גנגליוניים מקושרים. עם זאת, עבור הנתונים המייצגים, השתמשנו באלקטרודת גירוי ביתית בעלת שני מוליכים.השתמשו בשעווה דביקה (tacky wax) להצבת אלקטרודת הארקה בקצה הנגדי של התא. לפני ביצוע הקלטה פונקציונלית, רכשו תמונה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה של האזור ממנו תוקלט הפעילות החשמלית כדי לסייע בוויזואליזציה. ניתן להפוך את סקאלתי הגוונים כך שהפלואורסצנציה תופיע ככהה. כדי להחיל גירוי זרם באמצעות מחולל הגירויים הנשלט במחשב, תכנתו תחילה את המכשיר על ידי בחירת העוצמה, משך הזמן, התדר ומספר הגירויים המתאימים, וכן את השהיית הזמן ביחס לתחילת רכישת הנתונים האופטיים.כדי להבטיח שהגירוי יתרחש בתוך גבולות רכישת הנתונים האופטיים, הגדירו את מחולל הגירויים כהתקן הנשלט על ידי neuro plex. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי הרכישה בתוך neuro plex, כולל קצב פריימים, מספר פריימים והגבר מצלמה (camera gain). כדי להשיג רזולוציה מלאה של פוטנציאל פעולה, יש להגדיר את קצב הפריימים למינימום של 1 kHz.מכיוון ש-D four A ו-E-P-P-G-H-Q מראים ירידה בפלואורסצנציה בעת דפולריזציה, הקשורה באופן ליניארי לשינוי במתח, הפוך את תצוגת האותים האופטיים בתוך neuro plex כך שפוטנציאלי הפעולה לא יופיעו הפוכים. התחל ברכישת הנתונים. זכור לרכוש תמונה חדשה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה של כל שדה ראייה לפני ביצוע כל אחת מההקלטות הפונקציונליות.עם השלמת הרכישה, השתמשו ב-neuro plex כדי לנתח את התוצאות באופן לא מקוון (offline). אזור במסך הנקרא page display מציג את התמונה הגולמית של הדגימה כפי שנתפסה על ידי המצלמה המהירה ברזולוציה של 80 על 80 כפריים בודד. כאשר מצב הדף הוא absolute frame, מופעלת superimposed של התמונה ברזולוציה הגבוהה שנרכשה עם המצלמה השנייה על גבי מפת הפיקסלים של התמונה הגולמית באמצעות פקודות התצוגה של neuro plex.שלב זה דורש שינוי של מצב הדף מ-absolute trace ל-traces ובחירה של superimposed image מתוך פקודת התצוגה. השתמש בעכבר כדי לבחור פיקסלים בודדים או קבוצות של פיקסלים מהתמונה המוצגת בתצוגת הדף. הפלטים של אזורי עניין אלה יופיעו כעקומות (traces) בתוך חלון תצוגת העקומות, ויחשפו את עוצמת השינויים האופטיים שנרשמו על ידי אותם פיקסלים כפונקציה של הזמן.הפיכה של סולם האפורים בתמונה ברזולוציה הגבוהה משפרת את הוויזואליזציה בתצוגת דף מצב העקבה (trace mode), ומומלץ מאוד להציג פלט אנלוגי מהסטימולטור. בחרו את ערוץ הפלט האנלוגי להכללה בתוך חלון תצוגת העקבה. פלט זה מצביע על התזמון המדויק של הגירויים שהוחלו במהלך הניסוי.כדי לצפות בנתונים כסרטון, השתמש בפקודות הסרטון בתוך neuro plex להצגת פרמים עוקבים בתוך סט נתונים, תוך שימוש בסולמי פסאודו-צבע המותאמים לשינוי המקסימלי והמינימלי בעוצמת הפלואורסצנציה. גנגליון מהכנה של רשת מינטרית שצבעה ב-DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q צולם באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה ועדשה של 60x. במהלך רכישת הנתונים, ההכנה עוררה באמצעות רצף של חמישה פולסים בתדר של 40 hertz.כאשר לכל פולס הייתה אמפליטודה של 15 milliamps ומשך של 0.5 milliseconds, זוהו ארבעה אזורי עניין (ROI) והופקו עקבות להצגת הנתונים האופטיים הממוצעים על פני האזורים שנבחרו ברצף פרמי הפסאודו-צבע; אזורי התגובה האופטית הראשונים של דפולריזציית ממברנה המעידה על פעילות נוירונלית מופיעים בצבע צהוב עד אדום. נתונים אלו מעידים כי פעילות שגורמה על ידי גרייה מתרחשת באזורים נפרדים בכל גנגליון, ומועברת בעיקר על ידי אקסוני מעבר. ה-ROIs שני, שלישי ורביעי מזהים נוירונים בודדים במרחקים שונים מ-ROI ראשון.איור שתיים ממחיש בהגדלה של 10x את המסלולים האנטומיים שדרכם עשוי מידע להתפשט; החיצים מצביעים על הכיוון שבו נע הגירוי כדי להפעיל את הגנגליון המיenteric שזוהה. הראינו לכם כעת את רכיבי ההערכה האופטית להקלטת פעילות חשמלית באמצעות צבעים רגישים למתח, וכיצד יישום טכנולוגיה זו על מערכת העצבים האנטרנית פותח את האפשרות לחקר הקישוריות התפקודית בתוך ובין שתי רשתות יונקיים שלמות תחת השדה של המיקרוסקופ. בעת שימוש בטכנולוגיית הקלטה אופטית, תשומת לב לפרטים היא חשובה ביותר.יש לשלוט בקפידה במקורות רעש אופטיים, מכניים וחשמליים, ויש לשמור בקפידה על תקינות הדגימה. לפיכך, שליטה בכל אחד מהשלבים הבודדים של פרוטוקול זה היא חיונית להשגת הצלחה בהקלטה אופטית. זהו כל התהליך.תודה רבה שצפיתם, ובהצלחה רבה בניסויים שלכם.

optical-recording-electrical-activity-guinea-pig-enteric-networks

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים את המתודולוגיה של מהיר הדמיה ברזולוציה גבוהה פלואורסצנטי מתח רגיש צבען של פעילות מפורט של נוירונים הגנגליון stomatogastric סרטן.

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים הליך לצפייה בשינויים בפעילות העצבית בפרוסת מוח המוכתמת בצבע רגיש למתח. הצבע משקף שינויים בפוטנציאל הממברנה של תא העצב על ידי שינוי עוצמת הפלואורסצנטיות שלו. באמצעות יישום גירויים חשמליים וטכניקות הדמיה מתקדמות, תהליך זה מאפשר מעקב חזותי אחר שינויים בזמן אמת בפוטנציאל הממברנה העצבית בהתבסס על פלואורסצנטיות VSD.

הקלטה אופטית של פעילות עצבית בפרוסות מוח מוכתמות בצבע רגיש למתח

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד הפעילות של עצבי המעי הגס במעי גס של חולדה ex-vivo, מקופלים בשני הקצוות ומוחדרים במי מלח כדי להגביר את הלחץ התוך-לומינלי. ככל שהלחץ עולה, האות העצבי עולה, ומציין את הגירוי שלו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מעצבי המעי הגס במעי הגס Ex Vivo Rat

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

אנו מציגים שיטת הקלטה אופטית ויציבה לפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. המאמר מתאר מכתים צבע רגיש מתח והקלטה של אותות אופטיים באמצעות הכנה היפוקמאל הפרוסות המקובלת.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם ולבצע הקלטות מרובות סיבים, כיצד לתקן את הפריטים שאינם תלויים בסידן, ושיקולים חשובים עבור הדמיה צבעונית כפולה.

מולטי-סיב פונסה להקליט פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים באופן חופשי

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

כאן, אנו מציגים שיטה להערכת ביצועים ובטיחות ארוכת טווח של מערכי אלקטרודות תת-דוראליות רכות במודל מיני-חזיר, המתארת שיטות וכלי ניתוח, דימות תהודה מגנטית לאחר הניתוח, אלקטרופיזיולוגיה של קליפת המוח השמיעתית, תכונות אלקטרוכימיות של השתל ואימונוכימיה לאחר המוות.

השתלת מערך אלקטרוקורטיקוגרפיה רכה תת-דוראלית (ECoG) ורישום קליפת המוח לטווח ארוך במיני-חזירים

למדו כיצד לתעד פעילות חשמלית ברשתות עצביות שלמות במערכת העצבים המעיים של חזירי גינאה באמצעות צבעים רגישי מתח. הפרוטוקול מדגים ניתוח רקמות, צביעה אופטית וניתוח תמונות ברזולוציה גבוהה.

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

גלה סרטונים נוספים