הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים
4 בדצמבר 2009
פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.
סרטון זה מדגים את הניתוח והדימות העוקב של דגימות ממערכת העצבים האנטרית שעברו גירוי חשמלי, תוך שימוש בצבע הרגיש למתח D-4A-NEPPDHQ. מקטע קטן של המעי נלקח מחזיר गिनी שהורדם והודר, ומנוsetח תחילה כדי לחשוף את הסובמוקוזה ובסופו של דבר את הפלקסוס המיאנטרי לצורך הקלטות אופטיות. לאחר לכידת תמונת רזולוציה גבוהה ראשונית, ממוקמים אלקטרודות על רקמה מותקנת שנצבעה ב-D-4A-NEPPDHQ.
שינויים אופטיים המעידים על פעילות חשמלית נרשמים באמצעות המצלמה המהירה. במהלך הרכישה המהירה, מופעל גירוי חשמלי. לאחר מכן, התמונה ברזולוציה הגבוהה מונחת על מפת הפיקסלים של המצלמה המהירה לצורך ניתוח באמצעות neuro plex.
שלום, אני בריאן סאלצברג, מנהל המעבדה לאופטיקה תאית, או loco, כפי שאנו אוהבים לקרוא לה, במחלקה למדעי העצבים באוניברסיטת פנסילבניה. שמי אנליהו אובידה. אני גם חברה במעבדה לאופטיקה תאית.
היום נציג בפניכם פרוצדורה להקלטת פעילות חשמלית מרשתות נוירונים של יונקים בשלומן תוך שימוש בצבעים רגישים למתח. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור את הקישוריות הנוירונלית בתוך ובין שתי הרשתות המרכיבות את מערכת העצבים האנטרנית, המכונה גם המוח השני או מוח המעי. אז בואו נתחיל.
התחילו בהכנת תכשירי תת-הרירית והפלקסוס האנטרי (enteric plexus) על ידי כריתת המעי הדק של חזיר ים מסוג Hartley במשקל 150 עד 200 גרם או בגיל שבועיים עד שלושה, שהורדם באמצעות שאיפת isof fluorine ועבר עריפת ראש. לאחר מכן, הסירו את תכולת המעי על ידי שטיפת הלומן עם תמיסת M1 99 DM חמה ומחומצנת. חתכו מקטע מעי באורך 8 עד 10 סנטימטרים, תוך הקפדה על שימור הפולריות.
העבירו זאת לצלחת זכוכית של 10 סנטימטרים מצופה ב-sard המכילה M1 99 DM בטמפרטורת החדר. הניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם תאורה בשדה חשוך. לאחר מכן, באמצעות מספריים, פתחו את השוליים המזנטריים והשתמשו בסיכות ביולוגיות כדי לקבע את מקטע המעי כאשר צד הרירית פונה כלפי מעלה.
חשוב מאוד לשמור על מתיחה אחידה, כך שלאחר הקיבוע תציג הרקמה צורה מלבנית עם שורות של mucosal vii מיושרות באופן סדיר, תוך החזקת פינצטת dumont דקה בעלת קצוות ישרים במצב כמעט אופקי. קלפו את הרירית על ידי תפיסת ה-VII בקצה אחד של מקטע המעי ומשיכה לאורך הציר האורכי של הרקמה. המשיכו להפריד רצועות של רירית כדי לחשוף את הסוב-מוקוזה (submucosa) המכילה את הגנגליונים התת-ריריים ואת כלי הדם התת-ריריים.
בשלב הבא, בעזרת מספריים עדינים מאוד, בצעו חתך בשכבה התת-רירית (submucosal layer) בהתאם לכיוון סיבי השריר המעגלי. לאחר מכן, הרימו את התת-רירית בעדינות רבה באמצעות פינצטה עדינה, תוך כדי דחיפה של השכבה השרירית המעגלית כלפי מטה באמצעות המספריים, וחתכו לאורך הקצוות האורכיים.
שחררו את תת-הרירית (submucosa) משאר הדגימה ככל שההפרדה מתקדמת. כעת בצעו חתך שני בהתאם לכיוון סיבי השריר המעגליים, במרחק של 1.5 עד שלושה סנטימטרים מהחתך הראשון, כדי לקבוע את הגודל הסופי של דגימת תת-הרירית; מקטע תת-הרירית שהתקבל הוא בעובי של 30 עד 50 µm ונראה דקיק ושקוף. העבירו אותו לכלי syl guard אחר המכיל M1 99 DM טרי, והסבירו אותו בעדינות וללא מתיחה.
לאחר מכן, מקם את הצלחת בתא מחומצן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. מקטע המעי המקורי אמור כעת להיות נטול רירית ותת-רירית, והשריר המעגלי צריך להיות חשוף. מקטע זה ישמש כעת להפקת תכשיר של הפלקסוס המיאנטרי (myenteric plexus) כדי לחשוף את הפלקסוס המיאנטרי.
הסיר ככל האפשר את שכבת השריר המעגלית באמצעות פינצטה עדינה בעלת קצה ישר כדי למשוך חבילות סיבים מכל צד של הדגימה. לא ניתן להפריד את הפלקסוס המיאנטרי (myenteric plexus) שנחשף משכבת השריר האורכית ומסביב ל-CI שמתחתיה. העבר את דגימת הפלקסוס המיאנטרי לכלי חדש מצופה בסרד (sard) המכיל M1 99 M מחומצן. לאחר מכן, קבע באופן רפוי את הדגימה המכילה שריר חי. מספר דקות לפני הניסוי האופטי, העבר את הדגימה לכלי קטן יותר מצופה ב-syl guard, הממולא מראש ב-M1 99 DM המכיל 2 µM nefe למניעת התכווצות שרירים, וקבע אותה היטב על ידי הצבת מספר סיכות עדינות מאוד מסביב להיקף הדגימה.
יש לוודא שהמתיחות מפוזרת באופן שווה ושהרקמה מונחת בצורה שטוחה לחלוטין על תחתית ה-sil guard. הכנת הרקמה מוכנה כעת לניסויים פיזיולוגיים. הכין בבקבוק זכוכית תמיסת מלאי של DAI four A-N-E-P-P-D HQ בריכוז של 5 עד 50 µg/mL בתוך M1 99 M עם 2 µM nifedipine, וכסה את הבקבוק בנייר אלומיניום.
אתנול מתמיסת המלאי צריך להוות פחות מ-0.5% מהתמיסה של M1 99 DM עם Nifedipine שכיסתה את הדגימה, ולהחליפה בתמיסת הצבע שהוכנה. לאחר הדגירה, יש להשתמש בנפח מספיק של הסולם כדי לכסות את הרקמה לחלוטין ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 30 דקות. יש לשטוף את הדגימה עם M1 99 M מחומצן בתוספת NEFE על ידי החלפת כל תוכן התא.
רישום אופטי של פעילות נוירונלית בהכנות שעברו גרייה חשמלית מבוצע באמצעות מערכת המורכבת ממיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-עומד (upright epi fluorescence microscope) המצויד במפצל תמונה, מצלמה מהירה ומדויקת ברזולוציה נמוכה, מצלמה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה, מחולל גירויים הנשלט על ידי מחשב, ומיקרו-מניפולטור. המערכת כולה מותקנת על שולחן בידוד רעידות אקטיבי ומוקפת בווילונות אקוסטיים כבדים וגג מיילאר (Mylar) כדי למזער רעידות נישאות באוויר. למרות שניתן לבצע רכישת תמונות משתי המצלמות באמצעות מחשב יחיד המריץ את NeuroPlex ו-Global Lab Image Two או כל תוכנה אחרת לרכישת תמונות, המערכת המוצגת כאן עושה שימוש בשני מחשבים, שכל אחד מהם שולט במצלמה נפרדת לצורך תחילת הניסויים האופטיים.
הנח את התא המכיל את הדגימה המקולטת והצבועה על משטח המיקרוסקופ. מכיוון ש-D four A ו-EPPD HQ הם צבעים שאינם נשארים בממברנה ופלוט פלואורסצנציה רק בסביבה ליפידית, נוירונים בריאים מהכנה צבועה של מערכת העיכול צריכים להיראות כבלונים ריקים בכל הגדלה הגבוהה מ-20 x בעת הצפייה. השתמש במסננים HQ 5 35 50 לעירור, HQ 5 72 LP לעגירה, ובמראה דיכרואית של 5 65 nanometer.
בשלב הבא, בעזרת בקרים של מיקרו-מניפולטור, מקיימים מיקום של מערך אלקטרודות מטריציוני לינארי רב-חלומי בקצה האוראלי של הרקמה, תוך וידוא שהאלקטרודה אינה נוגעת בעדשת המיקרוסקופ. מערך מטריציוני לינארי המכיל 10 אלקטרודות טונגסטן הפזורות על פני טווח של סנטימטר אחד מסוגל לעורר מספר מסלולים עצביים עצמאיים ומתאים מאוד לחקר מעגלים גנגליוניים מקושרים. עם זאת, עבור הנתונים המייצגים, השתמשנו באלקטרודת גירוי בעלת שני מוליכים שהוכנה במעבדה.
השתמשו בשעוות דבק (tacky wax) כדי למקם אלקטרודת הארקה בקצהו הנגדי של התא. לפני ביצוע הקלטה פונקציונלית, רכשו תמונה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה של האזור ממנו תוקלט הפעילות החשמלית כדי לסייע בוויזואליזציה. ניתן להפוך את סולם הגוונים כך שהפלורסצנציה תופיע ככהה. כדי להפעיל גירוי זרמי באמצעות מחולל הגירויים הנשלט במחשב, תכנתו תחילה את המכשיר על ידי בחירת העוצמה, המשך, התדר ומספר הגירויים המתאימים, וכן את ההשהיה ביחס לתחילת רכישת הנתונים האופטיים.
כדי להבטיח שהגירוי יתרחש בתוך גבולות רכישת הנתונים האופטיים, הגדירו את מחולל הגירויים כמכשיר הנשלט על ידי neuro plex. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי הרכישה בתוך neuro plex, כולל קצב הפריימים, מספר הפריימים והגבר המצלמה. כדי להשיג הגדרה מלאה של פוטנציאל פעולה, יש להגדיר את קצב הפריימים למינימום של 1 kHz.
מכיוון ש-D four A ו-E-P-P-G-H-Q מראים ירידה בפלואורסצנציה בעקבות דפולריזציה, אשר קשורה באופן לינארי לשינוי במתח, הפוך את תצוגת האותים האופטיים ב-neuro plex כך שפוטנציאלי הפעולה לא יופיעו הפוכים. התחל ברכישת הנתונים. זכור לרכוש תמונת שחור-לבן חדשה ברזולוציה גבוהה של כל שדה ראייה לפני ביצוע כל אחת מההקלטות הפונקציונליות.
לאחר השלמת הרכישה, השתמש ב-neuro plex כדי לנתח את התוצאות באופן לא מקוון. אזור במסך הנקרא page display מציג את התמונה הגולמית של הדגימה כפי שנלכדה על ידי המצלמה המהירה ברזולוציה של 80 על 80 כפריים בודד. כאשר מצב הדף הוא absolute frame, התמונה ברזולוציה הגבוהה שנרכשה עם המצלמה השנייה מונחת על מפת הפיקסלים של התמונה הגולמית באמצעות פקודות התצוגה של neuro plex.
פעולה זו דורשת שינוי של מצב הדף ממעקב מוחלט (absolute trace) למעקבים (traces) ובחירה של תמונה מולפפת (superimposed image) מתוך פקודת התצוגה. השתמשו בעכבר כדי לבחור פיקסלים בודדים או קבוצות של פיקסלים מהתמונה המוצגת בדף. הפלטים של אזורי עניין אלו יופיעו כמעקבים בחלון תצוגת המעקבים, ויחשפו את גדלי השינויים האופטיים שנרשמו על ידי אותם פיקסלים כפונקציה של הזמן.
היפוך סולם האפורים בתמונה ברזולוציה הגבוהה משפר את הוויזואליזציה בתצוגת דף מצב העקבה (trace mode), ומומלץ מאוד להציג פלט אנלוגי מהסטימולטור. בחרו את ערוץ הפלט האנלוגי להכללה בתוך חלון תצוגת העקבה. פלט זה מצביע על התזמון המדויק של הגירויים שיושמו במהלך הניסוי.
כדי לצפות בנתונים כסרטון, השתמש בפקודות הסרטון בתוך neuro plex להצגת פרמים עוקבים בתוך סט נתונים תוך שימוש בסולמי צבעי פסאודו המותאמים לשינוי המקסימלי והמינימלי בעוצמת הפלואורסצנציה. גנגליון מהכנה של רשת מיאנטרית שצבעה ב-DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q צולם באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה ועדשה של 60 x. במהלך רכישת הנתונים, ההכנה עוררה באמצעות רצף של חמישה פולסים בתדר של 40 hertz.
בכל פולס בעוצמה של 15 milliamps ובמשך 0.5 milliseconds, זוהו ארבעה אזורי עניין (ROIs) והופקו עקבות (traces) להצגת הנתונים האופטיים הממוצעים על פני האזורים הנבחרים ברצף פרמי הפסאודו-צבעוני; אזורי התגובה האופטית הראשונים של דפולריזציה של הממברנה, המעידים על פעילות עצבית, מופיעים בצבעים שבין צהוב לאדום. נתונים אלו מעידים כי פעילות המגורה על ידי הגירוי מתרחשת באזורים נפרדים בכל גנגליון, כאשר רובה מובל על ידי אקסונים של מעבר (axons of passage). ה-ROIs שניים, שלושה וארבעה מזהים נוירונים בודדים במרחקים שונים מ-ROI אחד.
איור שתיים ממחיש בהגדלה של 10x את הנתיבים האנטומיים שדרכם עשוי המידע להתפשט; החצים מצביעים על הכיוון שבו נע הגירוי להפעלת הגנגליון המיאנטרי שזוהה. acab הרגשנו להראות לכם את רכיבי המערך האופטי להקלטת פעילות חשמלית באמצעות צבעים רגישים למתח, וכיצד יישום טכנולוגיה זו על מערכת העצבים האנטרית פותח את האפשרות ללמוד על קישוריות תפקודית בתוך ובין שתי רשתות של יונקים שלמות תחת שדה המיקרוסקופ. בעת שימוש בטכנולוגיית הקלטה אופטית, תשומת לב לפרטים היא בעלת חשיבות מכרעת.
יש לשלוט בקפידה במקורות רעש אופטיים, מכניים וחשמליים, ויש לשמור בקפידה על תקינות הדגימה. לכן, שליטה בכל אחד מהשלבים הבודדים של פרוטוקול זה חיונית להשגת הצלחה בהקלטה אופטית. וזהו.
תודה רבה שצפיתם, ובהצלחה רבה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים כיצד צבעים רגישים למתח מאפשרים רישום אופטי של פעילות חשמלית מרשתות עצביות שלמות, כגון הפלקסוסים של מערכת העצבים האנטרית של חזיר ים, עם רזולוציה ניתנת להתאמה הנעה בין תאים בודדים למעגלים מולטי-גנגליוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- דימיון אופטי
רקע
- צבעים רגישים למתח חשמלי הם חיוניים לחקר הפעילות העצבית.
- מערכת העצבים האנטרית ממלאת תפקיד משמעותי בתפקוד מערכת העיכול.
- טכניקות של רישום אופטי מספקות תובנות לגבי מעגלים עצביים.
- חזירי ת--> गिनी הם מודלים נפוצים למחקרים אנטריים.
מטרת המחקר
- להדגמה של השימוש בצבעים הרגישים למתח בהקלטות אופטיות.
- לבחינת פעילות חשמלית במערכת העצבים האנטרית.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים.
שיטות שהשתמשו בהן
- ניתוח של מעי חזיר גינאה לחשיפת הפלקסוס המיינטרי (myenteric plexus).
- צביעת רקמה בצבע הרגיש למתח D-four A-N-E-P-P-D-H-Q.
- דימוי ברזולוציה גבוהה של הרקמה הצבועה.
- הפעלת גירוי חשמלי במהלך הדימוי לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- הקלטות אופטיות מוצלחות של פעילות חשמלית ברשתות עצביות.
- מצלמה מהירה לוכדת שינויים דינמיים בצבע רגיש למתח.
- שילוב של תמונות ברזולוציה גבוהה עם מפות פיקסלים לצורך ניתוח.
- הוכחת יעילות הפרוטוקול לחקר נוירונים אנטריים.
מסקנות
- צבעים רגישים למתח חשמלי יעילים לתיעוד פעילות עצבית.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של תפקודי מערכת העצבים האנטרית.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למחקרים שונים של רשתות עצביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הקלטה אופטית של פעילות חשמלית בהכנות של מערכת העצבים האנטרית באמצעות צבעים רגישים למתח מספקת שיטה לא פולשנית למיפוי קישוריות תפקודית ברשתות עצביות שלמות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בזמן אמת של תגובות עצביות להפרעות פרמקולוגיות או חשמליות, ובכך היא מפחיתה עמימות מכניסטית בשלבים מוקדמים של הגילוי. יכולת ההסתגלות של הטכניקה למספרי הגדלה שונים מאפשרת לחוקרי ביו-פארמה לעבור מרזולוציה של תא בודד לניתוח מעגלים ברמת הרשת, ובכך לשפר את רמת הביטחון החזויה במעורבות המטרה (target engagement) ובמודולציה של המסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין אירועים מולקולריים להתנהגות חשמלית ברשתות נוירונליות שלמות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות סינפטיות בתוך ובין גנגליונים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במודולציה של המטרה על ידי חשיפת האופן שבו פעילות חשמלית מופצת על פני פלקסוסים מקושרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפפות לסריקות המשך על ידי שימור מרכיבים בודדים של מסלולי רפלקס בהכנות חצי-שלמות.
- פלט כמותי: מייצר שינויים מדידים בפלוורסצנציה הקשורים באופן ליניארי לשינויים במתח, מה שמאפשר זיהוי סטנדרטי של פעילות נוירונלית.
- יכולת הרחבה: מאפשר התאמה של הרזולוציה המרחבית מרמה סוב-תאית (~2.5 μm) לרמות מולטי-גנגליוניות, ובכך תומך בתכנון גמיש של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומר על רלוונטיות משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים על ידי שימור מערכות האפקטורים של דופן המעי הנשלטות על ידי הפלקסוסים התת-ריריים והמיאנטריים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר תרומות ספציפיות למסלולים השונים בתוצריים פיזיולוגיים, ובכך מפחית את הסיכון בבחירת המטרה.
- הלימה של ביומרקרים: מסייע בזיהוי אותות תלויי-פעילות שעשויים לשמש כביומרקרים תרגומיים לתפקוד הרשת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות בשלבים מוקדמים של הביולוגיה, תומכת בפיתוח מערכי בדיקה באמצעות קריאות אופטיות הדירות, ומספקת מידע לקבלת החלטות תרגומיות באמצעות מיפוי פעילות ברמת הרשת.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי ויזואליזציה של דפוסי פעילות חשמלית בתגובה לגירוי.
- סריקה: מספק תכשירים מוכנים לבדיקה עם פרוטוקולי צביעה וגירוי סטנדרטיים לזיהוי עקבי של פעילות עצבית.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות זמניות ומרחביות של שינויים אופטיים, המאפשרות השוואה של תנאים בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור השלמות המבנית והתפקודית של מעגלים עצביים אנטריים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר דינמיקה של רשתות עצביות במגוון מחלקות מטרה ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתפקוד רשתות עצביות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של דגירה של צבע, תזמון גירוי וסנכרון תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה ברשתות רלוונטיות פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי קישור מודולציית מטרה לשינויים מדידים בפעילות החשמלית של הרשת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, טיפול בצבעים ואלקטרופיזיולוגיה אופטית.
- תלוי במיקרוסקופיית פלואורסצנציה במהירות גבוהה, מחוללי גירויים מנוהרי מחשב ומערכות לבידוד רעידות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, פרמטרי גירוי ובחירת אזורי עניין (ROI).
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הפרוטוקול לסוגי רקמות שונים או לאורגניזמי מודל אחרים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון פוטוטוקסיות של צבע בריכוזים גבוהים והצורך לשמור על חיות הרקמה במהלך דימות ממושך.
