מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ"א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

פלסמידי WRN מעובדים באמצעות אנזימי ההגבלה cell one ו-MLU one, והfragment-ים מופקים מהג'ל. וקטורי ביטוי אלה, המעובדים עם fragment-י WRN של cell one ל-MLU one, מולחמים לאחר מכן לאתרי cell one ל-MLU one של וקטור השמרים. הפלסמיד רב-העתקים מכיל גם סמן ברירה TRP one.

מבני W Rrn מותמרים לשמרים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים, והמומרים נבחרים על מצע גלוקוז סינתטי מלא (synthetic complete glucose media) חסר טריפטופאן. לאחר מכן, מומרים בודדים נמרחים על מצע גלוקוז סינתטי מלא חסר טריפטופאן, והצלחות מדגרו מתוך צלחת המאסטר. כדי לנתח את השחזור של פנוטיפ הצמיחה האיטית, מומרים של שלושת זני המוטנטים הכפולים המובילים של SGS one המותמרים ב-WRN נמרחים על צלחות המכילות גלוקוז או גלקטוז.

כדי לנתח את השפעת ביטוי WRN על רגישות ל-HU ו-MMS, מבוצע spotting כדי לקבוע את התפלגות מחזור התאים של תאי שמרים המבטאים WRN. מבוצע צביעת DAPI. ביטוי של WRN במארח הטרולוגי מנותח באמצעות Western Blot Analysis.

שלום, אני רוברט ברוך מהמחלקה למקרי DNA hela במעבדה לגרונטולוגיה מולקולרית במכון הלאומי להזדקנות, אחד המכונים של המכונים הלאומיים לבריאות. שלום, אני מוניקה אגרול, גם אני מהמחלקה למקרי DNA Heli במעבדה לגרונטולוגיה מולקולרית במכונים הלאומיים להזדקנות. הבנת תפקידם של חלבוני תיקון DNA אנושיים ומסלולים גנטיים היא אתגר משמעותי עבור חוקרים רבים.

מחקרים גנטיים במערכות של יונקים היו מוגבלים בשל היעדר כלים זמינים, כולל שורות תאים גנטיות מוטנטיות, מערכות ביטוי רגולטוריות וסמנים ברירables מתאימים. היום נדגים בפניכם פרוצדורות המשתמשות בשמרים כמערכת מודל לבדיקת התפקודים המולקולריים והתאיים של אנזים לפתיחת DNA, המכונה הליקאזה, במניעת הזדקנות מוקדמת. אנו משתמשים בפרוצדורות אלו במעבדתנו כדי לאפיין גנטית את תפקידו של תוצר הגן האנושי burner, הפגום בתיקון DNA ובשמירה על יציבות גנומית בהפרעה של הזדקנות מוקדמת.

תסמונת ורנר (Werner Syndrome) היא אחת מחמשת המקרים של משפחת הליקאזים (helicases) מסוג RecQ בבני אדם. קיים רק אחד בשם sgs1 שניתן להשתמש בו כדי לחקור את תפקידו של חלבון הוורנר האנושי בתגובה לעקה של השכפול. בחנו את השפעת הביטוי של חלבון וורנר ברקע של מוטציה בשמרים על נקודות קצה ביולוגיות שונות.

אם כן, בואו נתחיל. מכיוון שנשתמש בשמרים כמארח הטרולוגי, השלב הראשון שלנו יהיה לשבט את הגן Werner האנושי או את הגרסה המשתנה שלו לתוך וקטור שמרים. פלסמידי Werner עוברו עיכול באמצעות האנזימים למקטע Sal I ו-Mlu I, והפרגמנטים המופקים טיהרו ולאחר מכן הוקשרו לאתרי Sal I ו-Mlu I של וקטור ביטוי לשמרים, הנמצא תחת בקרה של פרומוטור הניתן להשראה על ידי גלקוז.

הפלסמיד בעל העותקים המרובים מכיל גם סימן לבחירה TRP1. פלסמידי ביטוי אלו של Werner מועברים לאחר מכן בטרנספורמציה למאבקי שמרים מתאימים שאינם מסוגלים לסנתז טריפטופן (tryptophan tropic) המשמשים במחקר זה. והטרנספורמנטים נבחרים על ידי פריסת התרחף על מצע גלוקוז סינתטי מלא (synthetic complete glucose media).

במדיה חסרה בטריפטופן, דגרו את הצלחותיות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך שלושה עד ארבעה ימים עד להופעת מושבות. לאחר צמיחת המושבות, בצעו ריסוס של טרנספורמנטים בודדים על מדיה סינתטית מלאה עם גלוקוז ודגרו את הצלחותיות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים. זני השמרים המוטנטיים המבטאים את הגן האנושי weer וגרסאותיו נבדקים לאחר מכן לפנוטיפים תאיים באמצעות הטכניקות המוצגות בסעיפים הבאים.

שלושת המוטנטים המובילים מראים פגם חמור בצמיחה. עם זאת, מוטציה בגן SGS1 מדכאת את פנוטיפ הצמיחה האיטית של שלושת המוטנטים המובילים. כדי לבחון את השפעת הביטוי של Werner על הצמיחה של זני wild type, SGS1 או SGS1 עם שלושת המוטנטים המובילים, פזרו את הזנים המתאימים עם הווקטור או עם פלסמיד ביטוי Werner על מצעי synthetic complete חסרי טריפטופאן, אך המכילים 2% glucose או 2% galactose כביקורת חיובית. השפעת ביטוי SGS1 נקבעה לאחר דגירה של המצעים ב-30 °C למשך יומיים.

זנים של טיפוס בר ומוטציה ב-SGS1 שהועברו וקטור או Werner אינם מראים כל הבדל בדפוס הגדילה שלהם. עם זאת, זני מוטציה כפולה של SGS1 top three שהועברו Werner גדלים באופן משמעותי לאט יותר מאשר זני מוטציה כפולה של SGS1 top three שהועברו וקטור, זאת כדי להעריך את הדרישות הפונקציונליות של Werner לשחזור פנוטיפ הגדילה האיטית. ברקע של sgs1 top three, פזרו זני sgs1 top three שהועברו מוטציות של הדומיין הקטליטי של Warner על מצעי synthetic complete חסרי טריפטופן המכילים 2% glucose או 2% galactose, ולאחר יומיים.

דגמיו של מוטנט Werner Exonuclease המסומן כ-E 84 A מחזירים את פנוטיפ הצמיחה האיטית בדומה ל-Werner, ובכך הם מראים כי פעילות exonuclease אינה נדרשת להשבת פנוטיפ הצמיחה האיטית של השלושה הראשונים. מוטנט Werner Helicase גדל היטב, ובכך הוא מדגים כי פעילות Werner helicase נדרשת להשבת פנוטיפ הצמיחה האיטית של השלושה הראשונים. כדי לקבוע את היכולת של Werner להשפיע על קצב הצמיחה של sgs.

פספסו זן אחד מהשלושה המובילים ברמות נמוכות של ביטוי חלבון, וכן את שלושת הזנים המובילים שהועברו עם הווקטור Werner או sgs1, עלו למונאות של מצע סינתטי מלא (synthetic complete) החסר טריפטופן, אך מכיל ריכוזים עולים של גלקטוז. דגרו את כל המוןאות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. Werner ומוטנט של Werner Exonuclease מחזירים את הפנוטיפ של top three slope בכל רמות הגלקטוז.

עם זאת, מוטציות ב-Werner Helicase אינן גורמות לכך. הוכח כי המוטינט הכפול SGS1 top3 רגיש פחות מהמוטנט הבודד top3 לסוכן האלקיליציה של DNA, methyl methane SULFONATE (או MMS), או למעכב השכפול hydroxyurea (או HU). כדי לקבוע את השפעת הביטוי של Werner על הרגישות ל-MMS ול-HU של זני SGS1 או SGS1 top3, גדלו זני שמרים שעברו טרנספורמציה עם וקטור או Werner במצע synthetic complete raffinose חסר טריפטופאן בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כביקורת.

השתמשו בזן הורה מסוג בר (wild type) שעבר טרנספורמציה עם וקטור, זרעו מחדש את כל התרביות במצע synthetic complete raffinose חסר טריפטופן וגדלו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עד לשלב הלוגי המוקדם. כאשר התרביות נמצאות בשלב הלוגי המוקדם, הכינו דילול סדרתי של פי עשרה עד פי 10,000 של זנים אלו באמצעות מצע synthetic complete חסר טריפטופן; טפטפו ארבע microliters מכל דילול על צלחות synthetic complete GAL חסרות טריפטופן המכילות 10 millimolar HU או 0.0025% MMS. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך ארבעה ימים. מוטנט כפול SGS1-TOP3 שעבר טרנספורמציה עם sgs מסוג בר.

עיכוב בשלב ה-SG two המאוחר של מחזור התא מוביל למורפולוגיה בצורת משקולת. לעומת זאת, שמרים מסוג בר (wild type) משלימים את חלוקת התא, מה שמותיר פחות תאים בצורת משקולת לצורך בדיקת התפלגות מחזור התא של זן sgs one top three שעבר טרנספורמציה של ורנר. ראשית, גדלו תרביות בצמיחה לוגריתמית של הזנים הבאים במצע synthetic complete RAF ללא טריפטופן בטמפרטורה של 30 °C למשך לילה.

העבירו תרביות של SGS one מהשלוש העליונות שותפרו עם וקטור Werner, או SGS one וזן הורי Wildtype שותפר עם הווקטור, ל接הסנקה מחדש בריכוז OD 0.05. לאחר ההסנקה מחדש, גדלו את התרביות עד ל-OD 0.5 וקצרו באמצעות צנטריפוגציה. ביטוי Werner יושרה לאחר מכן על ידי הוספת גלקטוז בריכוז של 2%. אפשרו לתרביות לגדול בטמפרטורה של 30 °C למשך שש שעות.

לאחר שש שעות, קצרו את התרביות ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה. העבירו את התרביות למבחנות מיקרו-סנטריפוגה לאחר הסנטריפוגציה, ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, קבעו את התאים ב-70% ethanol למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר שטיפת התאים המקובעים פעמיים עם PBS, השעיקו מחדש את התאים ב-one XPBS.

הניחו את תרחיף התאים על שקופית והוסיפו Vector Shield. תמיסת קיבוע עם DAPI בריכוז של 1 µg/mL. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ XI Saxo vert כדי לחפש תאים עם גרעינים בצורת פלס, המאפיינים תאי שמרים בשלב G2 של מחזור התא.

על מנת לקבוע את הביטוי של חלבון Werner או את השונות שלו בזני שמרים מהסוג SGS one או SGS one top three שעברו טרנספורמציה. התחל בגידול הזנים במשך שש שעות במצע המכיל גלקטוז כדי להשרות את הביטוי של חלבון Werner. לאחר איסוף התאים על ידי סנטריפוגה, שטוף אותם ב-PBS ותלה אותם מחדש.

בופר ליזיס בסיסי. הרתח את התאים למשך חמש דקות, לאחר מכן הבהר באמצעות צנטריפוגציה ונטרל עם חומצה כלורית בריכוז one molar. ליזטים אלו מוכנים כעת לאלקטרופורזה בגלים של 8% עד 16% poly acrylamide SDS כדי לקבוע את רמת הביטוי של חלבון Warner תחת השפעת ריכוזים משתנים של גלקטוז.

ראשית, השרו את התרביות בריכוזים משתנים של גלקטוז למשך שש שעות. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה ותלו אותם מחדש בבופר המכיל מעכבי פרוטאז. הוסיפו לתערובת חרוזי זכוכית בגודל 425 עד 600 מיקרון ושברו את התאים באמצעות ערבול במכשיר vortex במהירות גבוהה למשך דקה, ולאחריהו קירור על קרח למשך דקה.

חזור על הפעולה שמונה פעמים בסך הכל. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה את ההומוגנאט שהתקבל למשך חמש דקות ב-15,000 Gs ואסוף את פלגמי העל (supernatant). לאחר מדידת כמות החלבון בפלגמי הליזאט בשיטת Bradford, הפרד ריכוזים שווים של חלבון על ג'לי Polyacrylamide SDS בריכוז של 8% עד 16%. ביטוי של Werner נקבע לאחר מכן באמצעות Western blot של ביטוי Werner ב-sgs.

SGS1-TOP3 משחזר את הפנוטיפ של צמיחה איטית של TOP3, כפי שמוצג בתצלומים אלו. זני sgs1-top3 שהועברו טרנספורמציה עם וקטור Werner או sgs1 נמרחו על צלחת SC tryptophan המכילה 2% glucose או 2% galactose. ביטוי של Werner המושרה על ידי galactose גורם למשטר sgs1-top3 לצמוח לאט יותר.

בניגוד לכך, זן ההורה מסוג הפראי או זן SGS one שהועבר אליו Werner אינו מושפע בצמיחתו, מה שמעיד כי הצמיחה האיטית שנגרמה על ידי Werner ספציפית לרקע של SGS one top three. כאשר זני SGS one top three שהועברו אליהם וריאנטים של Werner נמסרו על מצעי SC tryptophan המכילים 2% glucose או 2% galactose בלבד.

גרסת ה-Werner חסרת הפעילות אקסונוקלאזית עדיין הייתה מסוגלת לשחזר את פנוטיפ הצמיחה האיטית. הדבר מוכיח כי פעילות ה-ATPase helicase של Werner, אך לא הפעילות האקסונוקלאזית שלה, נדרשת כדי לשחזר את פנוטיפ הצמיחה האיטית של top three. ברקע של SGS one top three, Werner שחזר את פנוטיפ הצמיחה האיטית של SGS one top three לאורך כל טווח ריכוזי ה-GAL.

תוצאות אלו מעידות כי שחזור של פנוטיפ הצמיחה האיטית ברקע מוטנטי של sgs one top three מתרחש ברמות ביטוי נמוכות של חלבון Werner. כאשר תרבימי תרבויות בצמיחה לוגריתמית של זני sgs, one top three שעברו טרנספורמציה עם Werner או וריאנטים שלו הונחתו בדילול סדרתי של פי עשרה על מצעי SC trytophan המכילים גלוקוז או גלקטוז, וכן MMS או HU. צפינו כי ביטוי של Werner הגביר את הרגישות ל-MMS ול-HU של זן ה-SGS one top three. יתרה מכך, השפעה זו על הרגישות ל-MMS ו-HU ברקע של SGS one top three דורשת את פעילות ההליקאז של Werner ATP, אך לא את פעילות ה-exon clease.

לבסוף, ביטוי של Werner משחזר גם את העכבה המאפיינת את SG two של top three, כפי שמעידה האוכלוסייה המוגברת של תאים בעלי תחתית רחבה (large butted cells). תאי מוטנט sgs one top three המבטאים Werner. בהשוואה אליהם, תאי sgs one top three שהועברו טרנספורמציה עם וקטור נצבעו ב-Dabi.

כדי להדמיאן את הגרעינים, החיצים מצביעים על ביטוי של Werner בגרעינים שלא חולקו. בתאי sgs שעברו טרנספורמציה, שלושת התאים העליונים הושרים על ידי הוספת ריכוזי גלקטוז מצוינים, והתאים נאספו שש שעות לאחר ההשראה. כמויות שוות של ליסאט תאי כולל הועמסו על ג'לי poly acrylamide SDS בריכוז של 8% עד 16%, ולאחריהן בוצע זיהוי ב-western blot באמצעות נוגדן anti Warner.

הדגמנו כיצד לחקור פנוטיפים תאיים הקשורים לרקעי מוטציה מוגדרים של שמרים, כדי להבהיר את התפקודים התאיים והמולקולריים של גן הלומד האנושי המתווכים על ידי פעילותו הקטליטית ואינטראקציות חלבון. ניתן להשתמש בשמרים כאורגניזם מודל לחקר תפקודי הגן במסלולים מוגדרים. בעת ביצוע נהלים אלו, חשוב לבחור רקע מוטציה מתאים של שמרים כדי להבחין בתפקידו של הגן הנחקר במסלולים מוגדרים.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.