Name: Denaturing גל אלקטרופורזה Gradient (DGGE) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למד פרופיל קהילות חיידקיות בביופילמים באמצעות DGGE ורצפי 16S rRNA. שיטה זו מאפשרת לחקור שינויים בקהילות מיקרוביאליות לאורך זמן ומקום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה gradient (dgge)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

שלום, שמי סלסט פיטרסון ואני עמיתה באוניברסיטת הרווארד, שם אני חוקרת קהילות של ביופילם מיקרוביאלי. אני מאפיינת את הקהילות החיידקיות על ידי בחינת רצף ה-16S rRNA שלהן וכיצד רצף זה משתנה לאורך זמן ובמרחב. כדי לעשות זאת, אני משתמשת ב-DGGE.זו אינה הרצה רגילה של הבאר שלי; יש לשמור אותה בטמפרטורה של 60 מעלות בזמן ההרצה, ויש להזרים את התמיסת הבאפר באופן רציף. לכן, נחמם את הבאפר במשך כשעה עד שיגיע ל-60 מעלות, ולאחר מכן נוכל להריץ את הנייר. כעת אשטוף את הפלטה הזו עם תמיסת uc מדוללת, תוך כדי בדיקה של זיהומים, ואז נדליק את זה.כל דבר כזה עלול לגרום לאי-סדירויות. חשוב להסיר את כל המים. לכן, בעת הרכבת הג'ל, אני אמקם את השבב בחלק החיצוני של הג'ל.כך הג'ל יהיה בין שתי פיסות הזכוכית הללו והצ'יפ יהיה בחלק החיצוני ולא ישפיע על הג'ל שביניהן. כעת אני אספיק את הג'ל בתוך התפסנים הללו, אלחץ אותם יחד ואהדק אותם על ידי סיבוב ימינה. כפי שקורה בכל ג'ל, חשוב לוודא שהחלק התחתון ישר ומיושר.כדי למנוע דליפות, נהפוך כעת את הג'ל ונניח אותו כאן כדי שייחתם עם האטם. לכן, חשוב בעת ביצוע פעולה זו שהלוחיות יהיו מיושרות עם האטם כאן. לאחר מכן, מחברים את התפסים שבצד ולוחצים כלפי מטה כדי להדק את האטם.זוהי מזרק של 30 mil. חלק זה וחלק זה מגיעים עם ערכת ה-bio red והם פשוט מורכבים כך. זה נועד פשוט כדי להוציא את עודפי המים מהצינורות.כעת נניח את הצינוריות על הג'ל כדי להטעין אותו. ראשית, מחברים מתאם לצינורית ולאחר מכן מחברים מחט למתאם הקטן ומניחים אותה בדיוק במרכז הג'ל, כך שתהיה מעט מתחת לזכוכית התחתונה. לאחר מכן, מחברים את מתאם התיל לצינורית הארוכה, אשר תחבר בין שתי מזרקים המכילים את התמיסה בעלת הצפיפות הגבוהה והתמיסה בעלת הצפיפות הנמוכה.אלו הם תמיסות שהוכנו מראש. לתמיסה הכחולה הוספתי צבע שרק מציין שזוהי התמיסה הדנטוריזית ביותר, וזוהי התמיסה הדנטוריזית הפחותה ביותר, זו בעלת הצפיפות הנמוכה. הן מכילות את כל הרכיבים.ועכשיו אני עומד להכין, למעשה, כמות כפולה מהשבוע. ברגע שהגעתם לטמפרטורה הרצויה, יש לכם כחמש עד שבע דקות למלא את הג'ל לפני שהעמודות יתרוממו. כעת נמלא את המזרק עם התמיסה.כעת אמלא אותה בכ-15 µL מהתמיסה. לאחר מכן, כדי להיפטר מבועות אוויר, אהפוך אותה ואלחץ בעדינות עד שבועת האוויר העליונה תיעלם. כעת, הבורג הקטן הזה ייכנס לחריץ.מתאם זה ייוצב מול תסבך זה, ויסגור באמצעות תסבך C בחוזקה. לאחר מכן, צינור זה יחובר למזרק. אותו תהליך יבוצע בצד השני עם המטריצה בעלת הצפיפות הגבוהה, שם יתבצע ההגשה.כעת אסובב את הגלגל בתנועה שעונה קבועה עם כיוון השעון. ראשית, התמיסה הכחולה תצא ראשונה כיוון שהיא בעלת הריכוז הגבוה ביותר, והיא תהווה את החלק התחתון של הג'ל. לאחר זמן קצר, התמיסה השקופה תתחיל למלא את הג'ל והמדרג (Gradient) ייווצר.החזיקו את המבחנה בזווית עדינה, וברגע שתסיימו למזוג את הג'ל, שטפו את המבחנות מיד מכיוון שהן יפולימריזו. תעבירו את הקבוצה שם, ואז לחצו למטה. כך את החלק הקטן הזה, ובצד השני אעשה את אותו הדבר. אוקיי.שלום, שמי סלסט פטרסון ואני עמיתה באוניברסיטת הרווארד, שם אני חוקרת קהילות מיקרוביאליות ביולוגיות. אני מאפיינת קהילות חיידקים על ידי בחינת רצף ה-16S rRNA שלהן וכיצד הרצף משתנה לאורך זמן ובמרחב. כדי לעשות זאת, אני משתמשת ב-DGGE.DGE היא אלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה (Denaturing gel electrophoresis). הרעיון הבסיסי הוא שקיים מדרג (gradient), וה-DNA, בעודו נע במורד המדרג, עובר דנטורציה. כתוצאה מכך, רצפים שונים יעצרו בנקודות שונות לאורך המדרג.וכך זה הופך להיות מעין טביעת אצבע של מיני ה-sexiness השונים בקהילה. לכן, מטרת הניסוי שלי היא לראות מי נמצא בקהילה וכיצד היא משתנה לאורך זמן ובמרחב. אני יכול להריץ את ג'ל ה-sexiness DDD, ולאחר מכן לגזור את הפסים ולזהות את המינים המיוצגים בכל קהילה.אחד האתגרים הגדולים ביותר בעת ביצוע ג'ל DDG הוא קביעת הגרדיאנט המיטבי. זהו פשוט עניין שדורש התנסות כדי להבין איזה סוג גרדיאנט מתאים לקהילה ספציפית. הגרדיאנט שאני משתמש בו היום הוא 35 עד 55% urea.אחת הבעיות המשמעותיות שעלולות להתרחש בטכניקה זו היא הופעת מריחות (smears) בנתיבים. מצאתי כי מסיבה כלשהי, אחת הדרכים הטובות ביותר לטיפול בכך היא להריץ את הג'לים למשך זמן רב מאוד, ואז המריחות נעלמות. כיום אני משתמש בשיטה עבור קהילות חיידקים כלליות, אך ניתן להשתמש בה גם עבור משפחה ספציפית של חיידקים כדי לבחון כיצד הם משתנים לאורך זמן, ובמקרים אלו הג'לים נוטים להיות נקיים מאוד.ניתן להשתמש ב-DDGE גם לבחינת מוטציות בגנים בודדים.

denaturing-gradient-gel-electrophoresis-dgge

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ"א או רנ"א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ​​ג'ל לפי משקל מולקולרי שלהם.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

סרטון זה מדגים את ההפרדה הדו-ממדית המבוססת על אלקטרופורזה של סיבי עמילואיד, ג'ל אגרוז. הטכניקה מפרידה את צברי העמילואיד הפולימורפיים בהתבסס על גודלם ההטרוגני.

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

למד פרופיל קהילות חיידקיות בביופילמים באמצעות DGGE ורצפי 16S rRNA. שיטה זו מאפשרת לחקור שינויים בקהילות מיקרוביאליות לאורך זמן ומקום.

Denaturing ג'ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

גלה סרטונים נוספים