Denaturing ג'ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

שלום, שמי סלסט פיטרסון ואני עמיתה באוניברסיטת הרווארד, שם אני חוקרת קהילות של ביופילם מיקרוביאלי. אני מאפיינת את הקהילות החיידקיות על ידי בחינת רצף ה-16S rRNA שלהן וכיצד רצף זה משתנה לאורך זמן ובמרחב. כדי לעשות זאת, אני משתמשת ב-DGGE.

זו אינה הרצה רגילה של הבאר שלי; יש לשמור אותה בטמפרטורה של 60 מעלות בזמן ההרצה, ויש להזרים את התמיסת הבאפר באופן רציף. לכן, נחמם את הבאפר במשך כשעה עד שיגיע ל-60 מעלות, ולאחר מכן נוכל להריץ את הנייר. כעת אשטוף את הפלטה הזו עם תמיסת uc מדוללת, תוך כדי בדיקה של זיהומים, ואז נדליק את זה.

כל דבר כזה עלול לגרום לאי-סדירויות. חשוב להסיר את כל המים. לכן, בעת הרכבת הג'ל, אני אמקם את השבב בחלק החיצוני של הג'ל.

כך הג'ל יהיה בין שתי פיסות הזכוכית הללו והצ'יפ יהיה בחלק החיצוני ולא ישפיע על הג'ל שביניהן. כעת אני אספיק את הג'ל בתוך התפסנים הללו, אלחץ אותם יחד ואהדק אותם על ידי סיבוב ימינה. כפי שקורה בכל ג'ל, חשוב לוודא שהחלק התחתון ישר ומיושר.

כדי למנוע דליפות, נהפוך כעת את הג'ל ונניח אותו כאן כדי שייחתם עם האטם. לכן, חשוב בעת ביצוע פעולה זו שהלוחיות יהיו מיושרות עם האטם כאן. לאחר מכן, מחברים את התפסים שבצד ולוחצים כלפי מטה כדי להדק את האטם.

זוהי מזרק של 30 mil. חלק זה וחלק זה מגיעים עם ערכת ה-bio red והם פשוט מורכבים כך. זה נועד פשוט כדי להוציא את עודפי המים מהצינורות.

כעת נניח את הצינוריות על הג'ל כדי להטעין אותו. ראשית, מחברים מתאם לצינורית ולאחר מכן מחברים מחט למתאם הקטן ומניחים אותה בדיוק במרכז הג'ל, כך שתהיה מעט מתחת לזכוכית התחתונה. לאחר מכן, מחברים את מתאם התיל לצינורית הארוכה, אשר תחבר בין שתי מזרקים המכילים את התמיסה בעלת הצפיפות הגבוהה והתמיסה בעלת הצפיפות הנמוכה.

אלו הם תמיסות שהוכנו מראש. לתמיסה הכחולה הוספתי צבע שרק מציין שזוהי התמיסה הדנטוריזית ביותר, וזוהי התמיסה הדנטוריזית הפחותה ביותר, זו בעלת הצפיפות הנמוכה. הן מכילות את כל הרכיבים.

ועכשיו אני עומד להכין, למעשה, כמות כפולה מהשבוע. ברגע שהגעתם לטמפרטורה הרצויה, יש לכם כחמש עד שבע דקות למלא את הג'ל לפני שהעמודות יתרוממו. כעת נמלא את המזרק עם התמיסה.

כעת אמלא אותה בכ-15 µL מהתמיסה. לאחר מכן, כדי להיפטר מבועות אוויר, אהפוך אותה ואלחץ בעדינות עד שבועת האוויר העליונה תיעלם. כעת, הבורג הקטן הזה ייכנס לחריץ.

מתאם זה ייוצב מול תסבך זה, ויסגור באמצעות תסבך C בחוזקה. לאחר מכן, צינור זה יחובר למזרק. אותו תהליך יבוצע בצד השני עם המטריצה בעלת הצפיפות הגבוהה, שם יתבצע ההגשה.

כעת אסובב את הגלגל בתנועה שעונה קבועה עם כיוון השעון. ראשית, התמיסה הכחולה תצא ראשונה כיוון שהיא בעלת הריכוז הגבוה ביותר, והיא תהווה את החלק התחתון של הג'ל. לאחר זמן קצר, התמיסה השקופה תתחיל למלא את הג'ל והמדרג (Gradient) ייווצר.

החזיקו את המבחנה בזווית עדינה, וברגע שתסיימו למזוג את הג'ל, שטפו את המבחנות מיד מכיוון שהן יפולימריזו. תעבירו את הקבוצה שם, ואז לחצו למטה. כך את החלק הקטן הזה, ובצד השני אעשה את אותו הדבר. אוקיי.

שלום, שמי סלסט פטרסון ואני עמיתה באוניברסיטת הרווארד, שם אני חוקרת קהילות מיקרוביאליות ביולוגיות. אני מאפיינת קהילות חיידקים על ידי בחינת רצף ה-16S rRNA שלהן וכיצד הרצף משתנה לאורך זמן ובמרחב. כדי לעשות זאת, אני משתמשת ב-DGGE.

DGE היא אלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה (Denaturing gel electrophoresis). הרעיון הבסיסי הוא שקיים מדרג (gradient), וה-DNA, בעודו נע במורד המדרג, עובר דנטורציה. כתוצאה מכך, רצפים שונים יעצרו בנקודות שונות לאורך המדרג.

וכך זה הופך להיות מעין טביעת אצבע של מיני ה-sexiness השונים בקהילה. לכן, מטרת הניסוי שלי היא לראות מי נמצא בקהילה וכיצד היא משתנה לאורך זמן ובמרחב. אני יכול להריץ את ג'ל ה-sexiness DDD, ולאחר מכן לגזור את הפסים ולזהות את המינים המיוצגים בכל קהילה.

אחד האתגרים הגדולים ביותר בעת ביצוע ג'ל DDG הוא קביעת הגרדיאנט המיטבי. זהו פשוט עניין שדורש התנסות כדי להבין איזה סוג גרדיאנט מתאים לקהילה ספציפית. הגרדיאנט שאני משתמש בו היום הוא 35 עד 55% urea.

אחת הבעיות המשמעותיות שעלולות להתרחש בטכניקה זו היא הופעת מריחות (smears) בנתיבים. מצאתי כי מסיבה כלשהי, אחת הדרכים הטובות ביותר לטיפול בכך היא להריץ את הג'לים למשך זמן רב מאוד, ואז המריחות נעלמות. כיום אני משתמש בשיטה עבור קהילות חיידקים כלליות, אך ניתן להשתמש בה גם עבור משפחה ספציפית של חיידקים כדי לבחון כיצד הם משתנים לאורך זמן, ובמקרים אלו הג'לים נוטים להיות נקיים מאוד.

ניתן להשתמש ב-DDGE גם לבחינת מוטציות בגנים בודדים.