מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS

עבור ביולוג, התא הוא אבן הבניין של החיים המכיל מספר אבנים שונות, שכל אחת מהן מבצעת משימות ספציפיות ויחד הן מאפשרות לתא לבצע את תפקודיו החיוניים. מנקודת מבט חשמלית, עם זאת, המבנה הפנימי אינו חשוב במיוחד, וניתן להתבונן בתא כציטופלזמה מוליכה העטופה בממברנה מבודדת ומוקפת בסביבה חיצונית מוליכה. חוסר איזון קטן בריכוזים של יונים, כאשר היונים העודפים מצטברים סמוך לממברנה, מוביל למתח הממברנה במצב מנוחה.

הצבת תא בשדה חשמלי גורמת להפצה מחדש של המטען המקומי משני צידי הממברנה. התוצאה היא מתח ממברנה מושרה, המתווסף למתח המנוחה ונעלם לאחר כיבוי השדה. בצורות תא פשוטות, ניתן לחשב את מתח הממברנה המושרה באופן אנליטי עבור תא כדורי.

ערך זה ניתן על ידי משוואת שוואן (Schwan's equation), הקובעת כי המתח פרופורציונלי לעוצמת השדה ולגודל התא, ועוקב אחר פונקציית הקוסינוס לאורך הממברנה. עבור צורות תא מורכבות יותר, המתח המושרה עשוי לסטות באופן משמעותי מפונקציית הקוסינוס ויש לקבעו באופן נומרי באמצעות מחשב חזק או באופן ניסיוני באמצעות צבע פוטנציומטרי. אחד הצבעים הפוטנציומטריים הנפוצים למטרה זו הוא diet AIPs.

צבע מהיר עם ספקטראי עירור ופליטה התלויים במתח הממברנה, AIPs הופך פלואורסצנטי בעוצמה כאשר הוא נקשר לממברנה, כאשר השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה פרופורציונלי לשינוי במתח הממברנה. סרטון זה מציג את הפרוטוקול למדידת מתח הממברנה המושרה באמצעות D AIPs. בדוגמה זו, נעשה שימוש בתאי שחלה של המסטר העצמי של סין (China's hamster ovary cells), כאשר התאים נזרעים בתאים בריכוז של 100,000 תאים לתא.

בתרבית HAMF 12, במצע מועשר בסרום עגל עוברי, L glutamine ואנטיביוטיקה, דגרו את התאים במצע התרבית למשך שעתיים עד ארבע שעות כדי לקבל תאים צמודים בצורה כדורית, או למשך 16 עד 20 שעות כדי לקבל תאים צמודים בודדים בעלי צורות מורכבות יותר. הכינו תמיסת מלאי בריכוז 10 million MO של diet aaps המומסים ב-DMSO בתוך הבקבוק המקורי. חלק מסוגי התאים עשויים לדרוש תוספת של onic כדי להקל על שילוב הצבע בממברנה. העבירו מיליליטר אחד של spinners, modification of the minimum essential medium SMEM לתוך מבחנת EOL, והוסיפו 2.5 microliters של 20%onic ושלושה מיקרוליטרים של 10 millimolar diet aaps.

פעולה זו מניבה תמיסת טעינה המכילה בקירוב 30 µM של diet aaps ו-0.05% של onic. החליפו את מצע התרבית בתא בתמיסת הטעינה. העבירו את התא למקרר למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

ההחדרה של הצבע דרך ממבנה הפלסמה נבלמת במידה רבה לאחר הצביעה, לכן יש לשטוף בזהירות את הצבע העודף מספר פעמים עם SMEM טהור. לבסוף, השאירו 1.5 milliliters של SMEM בתא. התאים נצפים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם עדשת שקיעה בשמן, מונוכרומטור ומצלמת CCD.

בתוכנת הרכישה, הגדירו את אורך גל העירור ל-419 nanometers ובחרו במסנן Band Pass המכוון לכ-605 nanometers, אם כי לא נעשה בו שימוש כאן. Diet aaps מאפשרת גם מדידות רציומטריות של מתח הממברנה. הניחו את התא עם התאים על משטח המיקרוסקופ, מקמו את האלקטרודות בתחתית התא וחברו אותן למחולל הפולסים.

בדוגמה זו, נוצר פולס מרובע עם אמפליטודה של 35 volts ומשך של 50 millisecond. באמצעות ספק מתח DC וממתג הנשלט על ידי מיקרו-מעבד, הפולס מועבר לזוג אלקטרודות, דבר היוצר שדה חשמלי ביניהן ומשרה את מתח הממברנה. העברת הפולס חייבת להיות מסונכרנת עם רכישת התמונה.

אתרו את התאים הרלוונטיים, והפילו פעימה חשמלית אחת או רצף של פעימות עבור כל פעימה. רכשו שתי תמונות פלואורסצנציה: תמונת ביקורת מיד לפני הפעימה ותמונת פעימה במהלך הפעימה, וזאת בשל התגובה הנמוכה של הצבע. השינויים בפלואורסצנציה קשים לזיהוי והופכים גלויים רק לאחר עיבוד התמונות עבור כל פעימה.

הפחיתו את הרקע הן בתמונת הביקורת והן בתמונת הפולס. בחרו תא והגדירו את אזור העניין (region of interest) כך שיתאים לממברנה. מדדו את הפלואורסצנציה לאורך אזור זה בתמונת הביקורת ובתמונת הפולס, והעבירו את הערכים לגיליון אלקטרוני עבור כל פולס.

חסרו את נתוני הבקרה מנתוני הפעימה וחלקו את התוצאה בנתוני הבקרה כדי לקבל את השינויים היחסיים בفلואורסצנציה. אם מוחל רצף של פעימות, ניתן לחשב ממוצע של ערכי השינוי היחסי שנקבעו עבור כל פעימה. כדי להשיג מדידה מהימנה יותר, המירו את השינויים היחסיים בفلואורסצנציה למתח ממברנה מושרה.

באמצעות עקום כיול, ניתן לקבל הערכה גסה של עקום זה מהספרות, אך לצורך דיוק גבוה יותר, יש למדוד אותו עבור כל מערך ספציפי. שרטט את המתח כפונקציה של אורך הקשת היחסי. ניתן להחליק את העקום באמצעות מסנן מתאים עבור תאים כדוריים.

הגרף המתקבל קרוב לקוסינוס, בהתאם למשוואת Schwan. עבור צורות תא מורכבות יותר, אותו הליך מניב התפלגויות מרחביות מורכבות יותר של מתח הממברנה.