Name: מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-19T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: למד מדידת מתח ממברנה מושרה בתאים באמצעות הצבע di-8-ANEPPS. פרוטוקול זה מדגים שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לחקר דינמיקת הממברנה בחיידקי CHO.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר סלובנית עם הפרויקט Z2-9229 תוכנית P2-0249. וידאו זה מייצג את חומר משלים עבור &quot;electroporation מבוססי טכנולוגיות וטיפולים&quot; סדנה מדעית קורס אקדמי, מאורגן פעמיים בשנה באוניברסיטת לובליאנה, סלובניה על ידי הפקולטה להנדסת חשמל.

חלק א: צעדים ראשונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי זה סינית התא אוגר השחלה שורה (CHO-K1) משמש. תאים הם מצופה במעבדה-Tek II לתאי (2 בארות, 4 ס&quot;מ 2 כל אחד) (Nalge Nunc, גרמניה) ב ~ 0.7x10 5 תאים / מ&quot;ל במדיום HAM-F12 תרבות בתוספת 8% עוברית עגל בסרום, 0.15 מ&quot;ג / מ&quot;ל L-גלוטמין, 16 מ&quot;ג / מ&quot;ל גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה), ו - 200 יחידות / מ&quot;ל Crystacillin (Pliva, זאגרב, קרואטיה), ו מודגרות ב 5% CO 2 ב 37 ° C. לחלופין, תאים יכולים גם להיות מצופה על # 1 מכסה מחליק זכוכית (0.13-0.16 מ&quot;מ עובי), מצופה דבק הסלולר כגון polylysine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בינוני התרבות שלהם. הדגירה שנמשך 2-4 שעות התשואות תאים שעדיין כדורית בקירוב, אך מחובר היטב אל פני השטח עם חלק קטן של הממברנה שלהם. לחלופין, לאחר 16 עד 20 שעות של דגירה, תאים מחוברים באופן מלא על פני השטח ויש להם צורות מורכבות יותר, אבל רובם עדיין אינם מתחלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;מ מניות פתרון של di-8-ANEPPS (Invitrogen, יוג&#39;ין, אורגון, ארה&quot;ב) על ידי הוספת 843 μl של DMSO (סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה) עד 5 מ&quot;ג הצבע שעל הבקבוקון Invitrogen המקורי. הפתרון המניה ניתן לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. לפני שמתחילים את הניסויים, לחמם את התמיסה עד גבישים של DMSO להתמוסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה שורות תאים עשויים לדרוש את השימוש pluronic כדי להקל על שילוב צבע לתוך קרום התא. Pluronic ניתן לרכוש פתרון המניה 20% DMSO (F-127, Invitrogen, יוג&#39;ין, אורגון, ארה&quot;ב), או פתרון המניות של ריכוז אותו ניתן להכין על ידי המסת pluronic ב DMSO. פתרון במלאי של pluronic ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. </li></ol> חלק שני: טעינת תאים עם di-8-ANEPPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 3 μl של 10 מ&quot;מ di-8-ANEPPS ו 2.5 μl של pluronic 20% ב 1 מ&quot;ל של השינוי ספינר (סידן מדולדל גרסה) של SMEM בינוני מינימום הכרחי (בינוני או M8167 M4767, סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה ) בתוך צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. זה מניב &quot;פתרון טעינת&quot; המכיל כ 30 מיקרומטר di-8-ANEPPS ו 0.05% pluronic. עבור סוגי תאים אחרים, התקשורת מולדתם התרבות יכול לשמש במקום SMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום תרבות בחדר Lab-Tek עם פתרון הטעינה. העברה לתא למקרר 10 דקות ב 4 ° C. בטמפרטורה זו, הפנמה של הצבע דרך הממברנה פלזמה היא בעיקר עכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים, לשטוף בעדינות את עודפי הצבע פעמיים עד שלוש פעמים עם SMEM טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עזוב 1.5 מ&quot;ל של SMEM בחדר. </li></ol> חלק שלישי: ניסוי רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss AxioVert 200, Zeiss, גרמניה) מצויד אובייקטיבי שמן טבילה (x63, NA 1.4), monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) מקורר מצלמת CCD (VisiCam 1280, Visitron, גרמניה). התמונות הן רכשה עם MetaFluor 7.1.1 ומעובד MetaMorph 7.1.1 (שני התקנים מולקולריים, Downingtown, פנסילבניה, ארה&quot;ב), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם. קבע את אורך הגל עירור בתוכנה רכישת 490 ננומטר לבחור מסנן פליטה מתאים ANEPPS, למשל, מסנן הלהקה עוברים מרוכז ב 605 ננומטר (605/55m, dichroic 565 DCXR, Chroma, Rockingham, ורמונט, ארה&quot;ב). אם monochromator אינו זמין, מסנן עירור מרוכז ב 490 ננומטר יכול לשמש במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר עם תאים לבמה מיקרוסקופ, מיקום האלקטרודות בחלק התחתון של החדר ולחבר אותם מחולל את הדופק. המדיום צריך לכסות את האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על כדאיות התא ולהפחית את החימום, הדופק צריך להיות של משרעת נמוכה מספיק זמן קצר. בניסוי זה דופק מרובע עם 35 V משרעת 50 ms המשך (נמוכה מספיק כדי למנוע electroporation) מופק באמצעות אספקת מתח DC ו מחוייט המיקרו שבשליטת מכשיר switcher. לחלופין, גנרטור הדופק מסחריים, כגון 33210A (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה&quot;ב) מחוברים למגבר או ממריץ מסחריים, כגון S88 (גראס, West Warwick, RI, ארה&quot;ב), ניתן להשתמש. הדופק מועבר לשני Pt / עיר אלקטרודות מקבילות חוט בקוטר 0.8 מ&quot;מ ו 4 מ&quot;מ המרחק ביניהם, יצירת שדה חשמלי של כ 88 V / ס&quot;מ בין אלקטרודות ΔΦ גרימת. הפצה השדה המדויק בין האלקטרודות השתמשו בניסוי הזה מתואר במקומות אחרים [1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התאים של עניין. החל דופק חשמלי יחיד או רצף של פולסים. במשך הדופק בכל, לרכוש שתי תמונות פלואורסצנציה: אחת מיד לפני הדופק (התמונה שליטה), ואחד במהלך הדופק (דופק את התמונה). בשל ההיענות הנמוכה של di-8-ANEPPS, השינויים הקרינה קשה להבחין בעין בלתי מזוינת ולהפוך onl לכאורהy לאחר עיבוד. משלוח דופק חייב להיות מסונכרן עם רכישת תמונה, אשר היא תכונה של התוכנה הרכישה. כדי להימנע photobleaching ואפשרי חימום, תאורה יכול להיות מוגבל משך הדופק. </li></ol> חלק ד &#39;: עיבוד תמונה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות בתוכנה MetaMorph. במשך הדופק כל, לחסר הרקע בשליטה והן את תמונת הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תא ולהגדיר את האזור עניין כל כך מתאים הממברנה. מדדו את עוצמות הקרינה לאורך האזור הזה בתמונה מלאה הדופק ולהעביר את הערכים לגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך הדופק בכל, מפחיתה את הנתונים לשלוט מהנתונים הדופק, ולחלק את התוצאה ב נתונים מלאה כדי לקבל את השינויים הקרינה היחסית. אם רצף של פולסים מוחל, ערכים של שינויים הקרינה היחסית שנקבע הדופק כל יכול להיות בממוצע כדי לקבל מדידה אמינה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה השינויים הקרינה היחסית לתוך ΔΦ באמצעות עקומת כיול. הערכה גסה של עקומה זו ניתן לקבל מן הספרות, אבל דיוק גבוהה יותר, הוא צריך להימדד להתקנה ומקרה. עבור תאים ההתקנה השתמשו בניסוי זה ירידה של 6% הקרינה המתאים גידול של 100 mV ב ΔΦ [2]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, העלילה מתח כפונקציה של אורך קשת יחסית חבילת תוכנה גרפים כגון Excel (מיקרוסופט, ברדמונד, וושינגטון, ארה&quot;ב), מגרש סיגמא (Systat Software Inc, בסן חוזה, קליפורניה, ארה&quot;ב), או מקור (OriginLab קורפ, Northampton, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב). עקומת יכול גם להיות מוחלק באמצעות מסנן מתאים, כגון מסנן הממוצע הנע. </li></ol>

<ol><li>Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+invasive+contact+electrodes+for+in+vivo+localized+cutaneous+electropulsation+and+associated+drug+and+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery.</a> J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).</li>
<li>Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+determination+of+transmembrane+voltage+induced+on+irregularly+shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells.</a> Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).</li>
<li>Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-gated+sodium-channel+blockers+by+electrical+stimulation+and+fluorescence+detection+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential.</a> Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).</li>
<li>Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+electric+potentials+in+soma+and+neurite+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct electric potentials in soma and neurite membranes.</a> Neuron. 13, 1187-1193 (1994).</li>
<li>Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+responses+of+transmembrane+potential+during+electric+field+stimulation+of+single+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells.</a> Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).</li>
<li>Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropermeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Del.+Rev%22%5BJournal%5D)">Electropermeabilization of cell membranes.</a> Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).</li>
<li>Sersa, G., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemotherapy+of+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrochemotherapy of tumours.</a> JoVE. 22, (2008).</li>
<li>Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+transmembrane+voltage+induced+by+applied+electric+fields+a+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem.+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis.</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).</li>
<li>Schwan, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+tissue+and+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of tissue and cell suspensions.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).</li>
<li>Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+electrical+modeling+of+single+and+multiple+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An approach to electrical modeling of single and multiple cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).</li>
<li>Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+studies+of+cell+response+to+ultrashort%2C+high-intensity+electric+fields+-+Implications+for+intracellular+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation.</a> IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).</li>
<li>Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+membrane+potential+changes+induced+by+applied+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields.</a> Biophys. J. 50, 339-348 (1986).</li>
<li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((membrane+binding%2C+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).</li>
<li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes%3A+measurement+of+membrane+potentials+induced+by+DC+and+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics+Suppl%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields.</a> Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).</li>
<li>Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+conductance+of+an+electroporated+cell+analyzed+by+submicrosecond+imaging+of+transmembrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential.</a> Biophys. J. 59, 209-220 (1991).</li>
<li>Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+medium+and+membrane+conductance+on+the+amplitude+and+kinetics+of+membrane+potentials+induced+by+externally+applied+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields.</a> Biophys. J. 56, 121-128 (1989).</li>
<li>Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electric+properties+by+combined+patch+clamp+and+fluorescence+ratio+imaging+in+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons.</a> Biophys. J. 74, 48-53 (1998).</li>
<li>Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurements+of+membrane-potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential.</a> Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).</li>
<li>Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometry+of+transmembrane+voltage-sensitive+fluorescent+dye+emission+in+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).</li>
<li>Pucihar, G., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-dependent+numerical+model+of+transmembrane+voltage+inducement+and+electroporation+of+irregularly+shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+T.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells.</a> IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).</li>
</ol>

מדידות של קרום המתח המושרה (הטרנסממברני), ΔΦ, יכול להיות חשוב במסגרות ניסיוניות שונות, כגון מחקרים של מתח מגודרת ערוצי הממברנה, התפשטות פוטנציאל פעולה, גירוי תא לב או קרום התא electroporation [3, 4, 5, 6 , 7]. עם צורות תאים פשוטים, ΔΦ ניתן לחשב אנליטית. לדוגמה, עבור תא כדורי, ΔΦ ניתנת על ידי המשוואה של והמתנות, אשר קובע כי מתח הוא יחסי כוח בשדה וגודל התא עוקב אחר פונקציה קוסינוס לאורך הממברנה [8, 9]. במשך יותר צורות תא מסובך, ΔΦ יכולים לסטות באופן משמעותי מן הקוסינוס ואת צריכה להיקבע גם מבחינה מספרית, באמצעות מחשב [2, 10, 11], או באופן ניסיוני, באמצעות צבע פוטנציומטרית [12, 13, 14, 15]. אחת צובעת פוטנציומטרית בשימוש נרחב למטרה זו היא די-8-ANEPPS (di-8-בוטיל-amino-naphthyl-אתילן-pyridinium-propyl-sulfonate), צבע מהיר עם עירור ופליטה ספקטרה תלוי מתח הממברנה, המאפשרת תצפיות פולשני של וריאציות של ΔΦ על קרום התא כדי למדוד את הערך שלו. בסרטון הזה, אנו מציגים גישה ניסויית לקביעת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS. לצבוע פותחה על ידי פרופ &#39;לסלי לייב ועמיתיו [13, 14] באוניברסיטת קונטיקט משתייכת של מהיר בתגובה צבעים. di-8-ANEPPS הוא nonfluorescent במים הופך ניאון חזק כאשר היא משלבת לתוך bilayer השומנים של קרום התא. שינוי בתוצאות ΔΦ לשינוי חלוקת תשלום intramolecular ושינויים המקביל פרופיל העוצמה הספקטרלית של הקרינה של צבע. עוצמת הקרינה של di-8-ANEPPS משתנה באופן פרופורציונלי לשינוי של ΔΦ; את תגובת הצבע הוא ליניארי עבור מתח הנעים בין 250 ל -280 mV mV [4, 16]. שינויים קטנים יחסית הקרינה של כתמים, צבע קרום אחיד, והפנמה לצבוע את di-8-ANEPPS פחות מתאים למדידות המוחלט של מתח הממברנה, למשל, מרכיב המנוחה שלה, למרות מאמצים אלה דווחו גם [17]. היא, לעומת זאת, מתאים למדידת שינויים גדולים יותר מתח הממברנה, כגון תחילתו של מתח הקרום המושרה בתאים nonexcitable להיחשף לשדות חשמליים חיצוניים [12, 13], או פוטנציאל פעולה בתאי להתרגש [4, 5]. למרות שלא חל כאן, di-8-ANEPPS גם מאפשר קביעת ΔΦ על ידי מדידות ratiometric של עירור הקרינה [18] או פליטה [19], אשר מגביר את הרגישות של התגובה ומקטין את ההשפעות הנ&quot;ל. כפי di-8-ANEPPS כתמים הממברנה, הוא יכול לשמש גם בבירור כסמן קרום [2]. אחד החסרונות של צבע היא כי הוא נוטה photobleaching, כך חשיפה ממושכת לאור חזק יש להימנע. כיול צבע מתבצע עם valinomycin (i) או ionophore אשלגן קבוצה של ריכוזי אשלגן שונות במדיום חיצוני [2,18], או (ii) תיקון-clamp במצב מהדק מתח [17]. לבסוף, עם מדידות של ΔΦ על תאים כדוריים תאים של צורות מורכבות יותר, הווידאו מדגים את ההשפעה של צורת התא על חלוקת משרעת המרחבי של ΔΦ. לכן עבור תאים כדוריים ΔΦ קרוב קוסינוס, בהסכמה עם המשוואה של והמתנות, ואילו תא מורכב יותר צורות הפריסה המרחבית של ΔΦ הוא מורכב יותר [20] ...

<table><tbody><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td>צבע פלואורסצנטי פוטנציומטרי</td></tr><tr><td>pluronic</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>יונופור לאיוני אשמורת</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>SMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8167 or M4767</td><td>מודיפיקציית Spinner של המצע המינימלי החיוני (Minimum Essential Medium)</td></tr><tr><td>Ham-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4888</td><td>מצע תרבית</td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td>תא</td></tr><tr><td>ספק מתח DC</td><td>Elektro-Automatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתג בבקרה מיקרו-מעבדית</td><td>Custom Made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

מדידת מתח ממברנה מושרה עם di-8-anepps

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

המיקום של תא לתוך שדה חשמלי חיצוני גורם אחראי המקומית חלוקה מחדש בתוך ומחוץ של התא בקרבת קרום התא, וכתוצאה מכך מתח על פני הממברנה. מתח זה, כינה את מתח קרום מושרה (מתח הטרנסממברני המושרה גם, או הבדל המושרה פוטנציאל הטרנסממברני) ו כונה על ידי ΔΦ, קיים רק כל עוד את השדה החיצוני הוא ההווה. אם מתח המנוחה נמצא על הממברנה, את המתח המושרה כופה (מוסיף) על זה. באמצעות אחד פוטנציומטרית צבעי ניאון, כגון di-8-ANEPPS, ניתן לצפות וריאציות של ΔΦ על קרום התא כדי למדוד את ערכו noninvasively. di-8-ANEPPS הופך ניאון חזק כאשר חייב bilayer השומנים של קרום התא, עם השינוי בעוצמת הקרינה ביחס לשינוי של ΔΦ. וידאו זה מציג את הפרוטוקול למדידת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS וגם מדגים את ההשפעה של צורת התא על המשרעת ואת הפריסה המרחבית של ΔΦ.

שדה חשמלי חיצוני משרה מתח על הממברנה של התא, כינה את מתח קרום מושרה (ΔΦ). באמצעות צבע פוטנציומטרית di-8-ANEPPS, אפשר למדוד את ΔΦ noninvasively. וידאו זה מציג את הפרוטוקול למדידת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS.

מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS

הצבת תא בשדה חשמלי חיצוני גורמת להפצה מחדש של המטען המקומי בתוך התא ומחוצה לו בסביבתו...

עבור ביולוג, התא הוא אבן הבניין של החיים המכיל מספר אבנים שונות, שכל אחת מהן מבצעת משימות ספציפיות ויחד הן מאפשרות לתא לבצע את תפקודיו החיוניים. מנקודת מבט חשמלית, עם זאת, המבנה הפנימי אינו חשוב במיוחד, וניתן להתבונן בתא כציטופלזמה מוליכה העטופה בממברנה מבודדת ומוקפת בסביבה חיצונית מוליכה. חוסר איזון קטן בריכוזים של יונים, כאשר היונים העודפים מצטברים סמוך לממברנה, מוביל למתח הממברנה במצב מנוחה.הצבת תא בשדה חשמלי גורמת להפצה מחדש של המטען המקומי משני צידי הממברנה. התוצאה היא מתח ממברנה מושרה, המתווסף למתח המנוחה ונעלם לאחר כיבוי השדה. בצורות תא פשוטות, ניתן לחשב את מתח הממברנה המושרה באופן אנליטי עבור תא כדורי.ערך זה ניתן על ידי משוואת שוואן (Schwan's equation), הקובעת כי המתח פרופורציונלי לעוצמת השדה ולגודל התא, ועוקב אחר פונקציית הקוסינוס לאורך הממברנה. עבור צורות תא מורכבות יותר, המתח המושרה עשוי לסטות באופן משמעותי מפונקציית הקוסינוס ויש לקבעו באופן נומרי באמצעות מחשב חזק או באופן ניסיוני באמצעות צבע פוטנציומטרי. אחד הצבעים הפוטנציומטריים הנפוצים למטרה זו הוא diet AIPs.צבע מהיר עם ספקטראי עירור ופליטה התלויים במתח הממברנה, AIPs הופך פלואורסצנטי בעוצמה כאשר הוא נקשר לממברנה, כאשר השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה פרופורציונלי לשינוי במתח הממברנה. סרטון זה מציג את הפרוטוקול למדידת מתח הממברנה המושרה באמצעות D AIPs. בדוגמה זו, נעשה שימוש בתאי שחלה של המסטר העצמי של סין (China's hamster ovary cells), כאשר התאים נזרעים בתאים בריכוז של 100,000 תאים לתא.בתרבית HAMF 12, במצע מועשר בסרום עגל עוברי, L glutamine ואנטיביוטיקה, דגרו את התאים במצע התרבית למשך שעתיים עד ארבע שעות כדי לקבל תאים צמודים בצורה כדורית, או למשך 16 עד 20 שעות כדי לקבל תאים צמודים בודדים בעלי צורות מורכבות יותר. הכינו תמיסת מלאי בריכוז 10 million MO של diet aaps המומסים ב-DMSO בתוך הבקבוק המקורי. חלק מסוגי התאים עשויים לדרוש תוספת של onic כדי להקל על שילוב הצבע בממברנה. העבירו מיליליטר אחד של spinners, modification of the minimum essential medium SMEM לתוך מבחנת EOL, והוסיפו 2.5 microliters של 20%onic ושלושה מיקרוליטרים של 10 millimolar diet aaps.פעולה זו מניבה תמיסת טעינה המכילה בקירוב 30 µM של diet aaps ו-0.05% של onic. החליפו את מצע התרבית בתא בתמיסת הטעינה. העבירו את התא למקרר למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.ההחדרה של הצבע דרך ממבנה הפלסמה נבלמת במידה רבה לאחר הצביעה, לכן יש לשטוף בזהירות את הצבע העודף מספר פעמים עם SMEM טהור. לבסוף, השאירו 1.5 milliliters של SMEM בתא. התאים נצפים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם עדשת שקיעה בשמן, מונוכרומטור ומצלמת CCD.בתוכנת הרכישה, הגדירו את אורך גל העירור ל-419 nanometers ובחרו במסנן Band Pass המכוון לכ-605 nanometers, אם כי לא נעשה בו שימוש כאן. Diet aaps מאפשרת גם מדידות רציומטריות של מתח הממברנה. הניחו את התא עם התאים על משטח המיקרוסקופ, מקמו את האלקטרודות בתחתית התא וחברו אותן למחולל הפולסים.בדוגמה זו, נוצר פולס מרובע עם אמפליטודה של 35 volts ומשך של 50 millisecond. באמצעות ספק מתח DC וממתג הנשלט על ידי מיקרו-מעבד, הפולס מועבר לזוג אלקטרודות, דבר היוצר שדה חשמלי ביניהן ומשרה את מתח הממברנה. העברת הפולס חייבת להיות מסונכרנת עם רכישת התמונה.אתרו את התאים הרלוונטיים, והפילו פעימה חשמלית אחת או רצף של פעימות עבור כל פעימה. רכשו שתי תמונות פלואורסצנציה: תמונת ביקורת מיד לפני הפעימה ותמונת פעימה במהלך הפעימה, וזאת בשל התגובה הנמוכה של הצבע. השינויים בפלואורסצנציה קשים לזיהוי והופכים גלויים רק לאחר עיבוד התמונות עבור כל פעימה.הפחיתו את הרקע הן בתמונת הביקורת והן בתמונת הפולס. בחרו תא והגדירו את אזור העניין (region of interest) כך שיתאים לממברנה. מדדו את הפלואורסצנציה לאורך אזור זה בתמונת הביקורת ובתמונת הפולס, והעבירו את הערכים לגיליון אלקטרוני עבור כל פולס.חסרו את נתוני הבקרה מנתוני הפעימה וחלקו את התוצאה בנתוני הבקרה כדי לקבל את השינויים היחסיים בفلואורסצנציה. אם מוחל רצף של פעימות, ניתן לחשב ממוצע של ערכי השינוי היחסי שנקבעו עבור כל פעימה. כדי להשיג מדידה מהימנה יותר, המירו את השינויים היחסיים בفلואורסצנציה למתח ממברנה מושרה.באמצעות עקום כיול, ניתן לקבל הערכה גסה של עקום זה מהספרות, אך לצורך דיוק גבוה יותר, יש למדוד אותו עבור כל מערך ספציפי. שרטט את המתח כפונקציה של אורך הקשת היחסי. ניתן להחליק את העקום באמצעות מסנן מתאים עבור תאים כדוריים.הגרף המתקבל קרוב לקוסינוס, בהתאם למשוואת Schwan. עבור צורות תא מורכבות יותר, אותו הליך מניב התפלגויות מרחביות מורכבות יותר של מתח הממברנה.

measuring-the-induced-membrane-voltage-with-di-8-anepps

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זוהי הפגנה של כמה ממברנות ביולוגיות ניתן להבין באמצעות מודלים חשמל. אנחנו גם מדגימים נהלים הקלטה פוטנציאל פעולה מחוט עצב הגחון של סרטנים עבור מעבדות סטודנט חוקיים.

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

, ייצור כיול ושימוש פולשני בדיקות רוטט למדוד הנוכחית bioelectric במערכות ביולוגיות שונות מתואר.

מדידת נוכחי Bioelectric עם בדיקה רטט

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

כאן אנו מציגים שיטת אלקטרו מבוססת על ממברנות נתמכות מוצקות עם דגש על היישומים שלה לאפיון של המובילים בממברנה electrogenic.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

אנו מתארים שיטה להכנת התאים בודדים טרי שרירים מבודדים או חלקה מתוך דגימות שלפוחית השתן של האדם העסקת שני צעדים הליך אנזימטי. תאים DSM שהתקבלו קיימא ניתן ללמוד על ידי שונים שיטות תא בודד כולל המתואר אמפוריטיצין-B תיקון מלחציים אלקטרופיזיולוגיה כדי לחשוף תכונות פיזיולוגיות ופרמקולוגית.

הכנה ושימוש בתאי השריר החלקים הרגילים של האדם הבודד לאפיון של 9-פניל-זרמים רגישים לקטיון

כאן, אנו מדגימים כיצד להגדיר וולט-אמפר-מונה זול עם תדר פלט מיתכנת שניתן להשתמש בו עם המקל מסחרית זמין אלקטרודות עבור transepi, מדידות התנגדות חשמלית החשמל.

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ניתנת לשחזור לייצור ממברנות מכלול מתכת-אורגני/פולימרי מעורבת במטריצות, ומדידה מדויקת של הולכת הפרוטונים במישור תחת טמפרטורה ולחות משתנות באמצעות ספקטרוסקופיית התנגדות אלקטרוכימית, שיכולה להיות שימושית לתאי דלק ממברנת החלפת פרוטונים (PEMFCs).

מדידת מוליכות פרוטונים בממברנות מטריצה מעורבות מבוססות MOF באמצעות ספקטרוסקופיית אימפדנס אלקטרוכימית

למד מדידת מתח ממברנה מושרה בתאים באמצעות הצבע di-8-ANEPPS. פרוטוקול זה מדגים שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לחקר דינמיקת הממברנה בחיידקי CHO.

מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS

גלה סרטונים נוספים