חוט השדרה Electrophysiology
18 בינואר 2010
הפגנה של בידוד של חוט השדרה בילוד עכבר ללימודי אלקטרו.
שלום, שמי אלן מאייר ואני עוזר מחקר במעבדת faf במכון סאלק. היום אראה לכם כיצד לבצע לaminectomy ונטראלי כדי לבודד את חוט השדרה של עכבר, ובנוסף, אראה לכם כיצד לחבר את חוט השדרה לאלקטרודה. כדי להקליט את הפעילות העצבית שלו, עליכם להכין שני תמיסות עבור חוט השדרה, אחת עבור הניתוח והשנייה עבור אמבט ההקלטה.
ההבדל היחיד בין שני התמיסות יהיה ריכוז סידן כלוריד. ראשית תצטרך להכין תמיסה של 10 X-A-C-S-F. לשם כך יידרשו הרכיבים המפורטים להלן.
התחל על ידי הוספת 100 milliliters של 10 X-A-C-S-F לבקבוק מדידה של ליטר אחד. לאחר מכן, מלא את הבקבוק במים, אך השאר מקום כדי למנוע גלישה. בעת הגזורה, השתמש בתמיסות עם ריכוז גז של 5%CO2 ו-95%O2.
כדי להוריד את ה-pH ולהחמצן את התמיסה, הוסף 1 mL של מגנזיום סולפט בריכוז 1 M. לאחר מכן, הוסף 1 mL של תמיסת סידן כלוריד בריכוז 1 M לתמיסת הנתיחה, והוסף 2 mL של סידן כלוריד בריכוז 1 M לתמיסת ההקלטה. ניתן להשתמש בניסיינים מגיל E 16.5 עד P 4 בניסויים אלו.
התחילו בהנתיחה של העכבר תחילה על ידי עקיצה מהירה וניתוק ראשו בעזרת מספריים חדים. לאחר מכן, גזרו לאורך קו האמצע הגחוני עד להגעה לזנב. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הוציאו את האיברים הפנימיים של העכבר ושטפו עם תמיסת A CSF.
השתמשו בתמיסת CSF עם סידום כלורי 1 millimolar לצורך הניתוח. הניחו את העכבר בצלחת הניתוח וקבעו אותו באמצעות סיכות בארבע כפות הרגליים ובבסיס הזנב. המטרה בשלב זה תהיה לבודד את חוט השדרה על ידי חיתוך לאורך הקו המקווקו באדום, תוך הפרדת עמוד השדרה מהלוחיות (lamina) העוטפות את חוט השדרה.
פעולה זו תאפשר לכם לחשוף את חוט השדרה. לאחר מכן, עקבו אחרי הקו כדי לגזור את הקרומים (meninges) ואת שורשי העצבים, ובכך לשחרר את חוט השדרה. אתרו את עמוד השדרה והשתמשו ביד אחת עם פינצטה כדי לתפוס בחוזקה את עמוד השדרה וביד השנייה במספריים קטנים.
כדי להוציא את חוט השדרה, החזיקו את המספריים בזווית נמוכה. כדי למנוע דקירה של חוט השדרה עם קצות המספריים, נבצע כעת דיסקציה של חוט השדרה. בעקבות הקו האדום, גזרו את הקרומיות (meninges) ואת שורשי העצבים של חוט השדרה.
כדי להוציא את חוט השדרה, ניתן לגזור לאורך שני צדי החוט ולאחר מכן לגזור לאורך קו האמצע הגחוני (ventral midline). חשוב להחזיק את המספריים בזווית נמוכה כדי לא לנקב את חוט השדרה. חשוב להימנע מגזירה של השורשים קרוב מדי לחוט השדרה.
בשלב הבא, העבירו את חוט השדרה לאמבט ההקלטה וחברו את האלקטרודות לשורשי העצבים של חוט השדרה. מקמו את האלקטרודה בקרבת השורש. לאחר מכן, השתמשו ביניקה כדי למשוך בעדינות את העצב אל תוך האלקטרודה.
תודה שצפיתם, ואני מקווה שסרטון זה יסייע לכם בניסוייכם העתידיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את בידודו של חוט השדרה של עכבר מולד לצורך מחקרים אלקטרופיזיולוגים. ההליך כולל ביצוע למינקטומיה ונטראלית (ventral laminectomy) וחיבור של חוט השדרה לאלקטרודה להקלטת פעילות עצבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- בידוד של חוט השדרה הוא קריטי לחקר פעילות עצבית.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מאפשרות מדידה של אותות עצביים.
- ריכוז Calcium chloride הוא חשוב עבור תמיסות הניתוח וההקלטה.
מטרת המחקר
- להדגים את הטכניקה לבידוד ไขสันหลัง של עכבר רך-ולוד.
- להראות כיצד לחבר את ไขสันหลัง לאלקטרודה.
- להקל על הקלטה של פעילות עצבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הליך למינקטומיה ונטרלית (Ventral laminectomy) לבידוד חוט השדרה.
- הכנת תמיסות לניתוח ולהקלטה.
- שימוש באלקטרודות להקלטת פעילות עצבית.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של חוט השדרה מעכבריו של תקופת היילוד.
- חיבור יעיל של חוט השדרה לאלקטרודות.
- הדגמה של הקלטת פעילות עצבית.
מסקנות
- הטכניקה מתאימה למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
- הכנת התמיסות היא קריטית להשגת תוצאות מוצלחות.
- ניתן ליישם שיטה זו בהקשרי מחקר שונים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פרוטוקול זה מאפשר בידוד של חוט שדרה מעכבר רך-גב (neonatal) לצורך הערכה אלקטרופיזיולוגית של מעגלי מחולל תבנית מרכזי (central pattern generating circuitry), ובכך תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) באישוש מטרה עבור הפרעות נוירו-מוסקולריות. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לבחינת תפקוד רשת הלוקומוטוריקה ולהערכת השפעות של תרכובות על סיגנלינג עצבי. היא מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות למדידה כמותית של תפוקים אלקטרופיזיולוגיים ממודל פרה-קליני מאושש.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות להתפתחות מעגלים מוטוריים ולמעורבות של מטרות נוירו-מוסקולריות.
- ערך תפעולי: מספק הכנה הדירה של רקמת חוט השדרה להקלטה אלקטרופיזיולוגית עקבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תמיסות דיסקציה מבוקרות וריכוזי calcium chloride מוגדרים ליציבות אמבט ההקלטה.
- ערך תפעולי: מסייע בהכנת מערכות ביולוגיות מתוקתקות עבור תהליכי סריקת תרכובות וזיהוי אותות בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה להערכת שינויים בפעילות עצבית התואמים פנוטיפים של תנועה (locomotor) במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני באמצעות אספקת תוצרי קריאה אלקטרופיזיולוגיים כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת דגימות מבודדות של חוט השדרה, התומכות בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור מטרות נוירו-שריריות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד מחוללי תבניות מרכזיים (central pattern generator) ו modulate של מעגלים עצביים.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות פתרונות ניתוח והקלטה סטנדרטיים בעלי הרכב יוני מוגדר.
- אנליטיקה: מייצר מדידות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות משורשי עצבים בטניים להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי אספקת פלט מדיד עבור מודולציה של מטרות הקשורות לתנועה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להכנת רקמה עצבית, הישימה במגוון תוכניות לגילוי נוירו-שרירי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכנית בתפקוד המעגל הלוקומוטורי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות הכנות תמיסה מוגדרות וטכניקות נתיחה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של השפעות התרכובות על הסיגנל העצבי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות נוירו-שריריות בהתבסס על פרופילי תגובה אלקטרופיזיולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של נתיחה של עכברים רכשיים והקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- תלוי בציוד עבור חיבור אלקטרודות יניקה ורכישת אותות עצביים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הנתיחה והכנת תמיסות ההקלטה.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על שלבים התפתחותיים שונים או מודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי הצורך בבקרה מדויקת של ריכוז calcium chloride לשמירה על חיוניות הרקמה במהלך ההקלטה.
