מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

פרוטוקול זה מספק שיטה כללית למדידת קצב האנדוציטוזה של מרבית חלבוני ממב冉 הפלזמה באמצעות סוכני חדירה לממברנה הניתנים לרדוקציה; בהליך זה, חלבוני שטח התא המכילים ליזינים חוץ-תאיים או המסומנים קוולנטית ב-4 °C באמצעות sulfo-NHS-SS-biotin מוצגים כאן בירוק. לאחר מכן, התאים מחוממים ל-37 °C כדי לאפשר אנדוציטוזה של חלבוני השטח. לאחר מכן, התאים מוחזרים ל-4 °C כדי לעצור את תעבורת הממברנה, והביוטין שנותר על פני השטח מוסר באמצעות סוכן מחזר שמפרק את קשר הדיסולפיד.

לפיכך, החלבונים הביוטיניליים היחידים שנותרו הם אלו שמקורם על פני השטח של התא, שעברו הפנמה והוגנו מפני הליך ההסרה (stripping). לבסוף, התאים מומסים וחלבונים ביוטיניליים מבודלים באמצעות strep avid וכרומטוגרפיית זיקה. שלום, אני לוק גבריאל מהמעבדה של Heli Milk Ian במחלקה לפסיכיאטריה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס.

היום נדגים לכם פרוצדורה למדידת קצבי אנדוציטוזה או הפנמה באמצעות טכניקת הסרה הפיכה של ביוטין. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי למדוד את קצב ההפנמה של נשא הדופמין. אז בואו נתחיל.

יום אחד לפני הניסוי, הכינו את התאים והמצעים לשימוש ביום למחרת. סוגי התאים והמצעים ישתנו, אך אם תאי הניסוי אינם נצמדים בעוצמה, השתמשו במצע היצמדות תאים מתאים, כגון פלטות לתרבית רקמות מצופות פוליליזין בלוח של שישה בארות. סמנו ארבע בארות בסך הכל באמצעות שתי פלטות נפרדות.

עבור כל חלבון שנבדק, יעשה שימוש בשתי בארות בלוחית הביקורת עבור חלבון פני השטח הכולל ובקרות השטיפה (stripping). הכין בארה בלוחית הניסוי עבור כל תנאי הפנימיזציה (internalization) שנבדק. זרע 1×10⁶ תאים בשני מיליליטר של תרבית תאים, כך שהתאים יגיעו לכ-80% התמזגות (confluency) עד למחרת.

לאחר גידול התאים, הכין את התמיסות הבאות ואחסן אותן בטמפרטורה של 4°C לשימוש ביום השני. תמיסת PBS 2+ מוכנת מ-phosphate buffered saline ב-pH 7.4 ומועשרת ב-1.5 mM magnesium chloride וב-0.2 mM calcium chloride. תמיסת tonation quench מוכנה באמצעות PBS 2+ המועשר ב-100 mM glycine. באפר NT מוכן עם 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.2% BSA ו-20 mM triss ב-pH של 8.6. באפר Ripa מוכן באמצעות 10 mM triss ב-pH של 7.4, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% trite x 100 ו-0.1% sodium deoxy coate.

בשלב הבא, הכין תמיסת סטוק של SULF N-H-S-S-S biotin על ידי המסה ב-SULFOXIDE או DMSO עד לריכוז של 200 milligrams per milliliter. הכן אליקוטים של 500 microliter ואחסן אותם בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. האליקוטים יכולים לעבור מספר מחזורי הקפאה והפשרה לאחר שלב זה.

מכינים תמיסת סטוק של Two carboxy ethyl phosphine hydrochloride או TCEP בריכוז של 500 millimolar המומס ב-50 millimolar tris, ומכוונים את ה-pH ל-7.4. מכיוון ש-TCEP הוא חומצי מאוד, יהיה צורך לכוון את ה-pH של התמיסה ל-7.4; מכסים את ה-TCEP בנייר אלומיניום לפני האחסון בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. ביום השני, מכינים PBS two plus מועשר ב-0.18% glucose ו-0.2% IgG protease free bovine serum albumin, או PBS two plus GBSA, ומחממים מראש ל-37 degrees Celsius במקלחית.

המיס את תמיסת המלאי של SFO N-H-S-S-S biotin בטמפרטורת החדר. הכן תמיסת sulfur N-H-S-S-S biotin טרייה מיד לפני השימוש. ערבב את התמיסה במערבל וורטקס בעוצמה כדי להמיס את ה-DMSO.

הניחו את שתי הפלטות באמבט קרח בחדר קר ושטפו כל באר שלוש פעמים עם 2 mL של PBS 2+ קר מאוד, תוך השארת הפלטות בזווית קלה לניקוז מלא של הבופר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו לכל באר 0.75 mL של תמיסת sulfo-NHS-SS-biotin טרייה. הדגירו למשך 15 דקות ב-4 °C באמבט קרח עם ניעור חזק על מכשיר ניעור (platform shaker) רגע לפני סיום ההדגרה.

הכינו תמיסת SUHO N-H-S-S-S biotin טרייה נוספת, ולאחר 15 דקות החליפו את התמיסה הישנה בתמיסה הטריה. דגרו למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius עם ניעור חזק על מכשיר ניעור פלטפורמה (platform shaker). לאחר הדגירה השנייה, שטפו את התאים שלוש פעמים במהירות עם שני מיליליטר של תמיסת כיבוי (quenching solution) כדי לכבות את כל מולקולות ה-NHS biotin שאינן מגיבות. לאחר מכן, דגרו בשני מיליליטר של תמיסת כיבוי למשך 15 דקות.

החליפו לתמיסת כיבוי (quenching solution) טרייה לאחר 15 דקות והדגירו למשך 15 דקות נוספות. שמרו את הפלטות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין על מכשיר ניעור (platform shaker) במהלך כל דגירה, בעוד פלטת הביקורת נשארת בתמיסת הכיבוי על שולחנת העבודה בחדר הקירור. הוציאו את פלטת הניסוי מחדר הקירור אל אמבט קרח בנקודה זו.

במידה ונבדקים טיפולים תרופתיים, יש להוסיף ריכוזים מתאימים של התרופה ל-PBS 2 חמים מראש פלוס GBSA. כאן אנו משתמשים בנשאי אתנול או ב-1 µM של PMA כדי להפעיל את מסלול ה-PKC. שטפו כל באער בלוח הניסוי שלוש פעמים עם 2 mL של PBS 2 חמים מראש פלוס GBSA, והוסיפו את הטיפולים התרופתיים המתאימים לאחר השטיפה האחרונה.

הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסות PBS two plus GBSA המתאימות ומלאו באגרי פנויות במצע שחומם מראש כדי להבטיח טמפרטורה אחידה ברחבי הפלטה. העבירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות מיד לפני סיום הדגירה. הכינו תמיסת stripping טרייה באמצעות תמיסת TCEP בריכוז 50 millimolar בבופר NT ושמרו על קרח.

הכינו כמות מספיקה עבור מיליליטר אחד לכל באר. לאחר דגירה של 10 דקות, העבירו במהירות את לוחת הניסוי לאמבט קרח והחזירו לחדר הקירור. שטפו במהירות את בארות הניסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר לכל באר של NT buffer קר מאוד כדי לעצור את האנדוציטוזה.

לאחר מכן, שטפו את באר בקרת ההסרה (stripping control) שלוש פעמים עם 2 mL של תמיסת NT קרה מאוד. השאירו את בארי הבקרה הכוללת (total control) בתמיסת ההשבתה (quench solution). הוסיפו 1 mL של תמיסת הסרה (stripping solution) לכל אחת מבארי הניסוי ובאר בקרת ההסרה, והדגירו דגירה על קרח למשך 15 דקות.

ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין לפני סיום האינקובציה. שוב, הכין את אותו נפח של תמיסת stripping טרייה כפי שנעשה קודם לכן. לאחר 15 דקות, החלף את תמיסת ה-strip הישנה בתמיסה טרייה והדגר למשך 15 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין כדי לליית את התאים תחילה.

שטפו את כל הבארות שנחשפו לתמיסת הסרה (stripping solution) שלוש פעמים עם 2 mL של NT buffer. לאחר מכן, שטפו את כל הבארות, כולל הביקורות החיוביות (total controls), שלוש פעמים עם 2 mL של PBS קר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 300 µL של RIPPA buffer המכיל מעכבי פרוטאיז טריים לכל בארה, ובצעו ליזה של התאים על ידי ניעור למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

העבירו את הליזט למבחנות מיקרו של 1.5 milliliter והסִירו את השאריות התאיות באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-18, 000 GS בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. השתמשו בבדיקת חלבון התואמת את תנאי הליזיס שלכם, לדוגמה, BCA protein assay מבית Pierce, כדי לקבוע את ריכוז החלבון בליזט בהשוואה לעקומת סטנדרט של bovine serum albumin. לאחר מכן, הכינו את הליזטים לסטריפ ולכרומטוגרפיית זיקה (affinity chromatography).

מלאו מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר בכמויות שוות של חלבון מכל דגימה. בניסוי זה, אנו מבודדים חלבונים ביוטינאציה מ-50 מיקרוגרם של ליזאט תאים. הוסיפו באפר RIPA המכיל מעכבי פרוטאוז עד לנפח סופי של 200 מיקרוליטר לכל דגימה.

בשלב הבא, ערבבו ב-vortex את ה-strep avid ואת ה-agro beads בעוצמה לפני השימוש. באמצעות פיפטור של 200 microliter עם טיפ קטום, העבירו 20 microliters של stripped avid וחרוזים לתוך כל מבחנה. ערבבו את המבחנות ב-vortex והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על רוטטור למבחנות. למחרת, אספו את החרוזים על ידי סבוב של הדגימות בצנטריפוגה ב-18,000 Gs למשך שתי דקות בטמפרטורה של החדר. שאבו את הליזאט, תוך הקפדה לא להתקרב עם השואב למשקע החרוזים, והוסיפו 0.75 milliliters בטמפרטורה של החדר.

הוסיפו Rip buffer לכל מבחנה וערבבו ב-vortex במהירות מקסימלית לשטיפת החרוזים. סובבו בצנטריפוגה ב-18,000 GS למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר אספו את החרוזים וחזרו על מחזור השטיפה, הערבוב והצנטריפוגה פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות לאחר השטיפה הסופית.

שאבו כמה שיותר מהבופר מבלי להפריע למשקע החרוצים. לאחר מכן, הוסיפו 20 עד 25 µL של בופר Laemmli מחזר בריכוז 2x לכל מבחנה. החומר המחזר ינתק את קשר הדיסולפיד של ה-N-H-S-S-S biotin, ובכך ישחרר את החלבונים המבודדים אל התמיסה.

מכיוון שרוב חלבוני הממברנה אינם עמידים לרתיחה, דגרו את המבחנות על רוטטור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שלבי הרדוקציה והדנטורציה להפרדת החלבונים. באמצעות SDS-PAGE סטנדרטי, העבירו את החלבונים מהג'ל לממברנה לצורך אימונו-בלוטינג (immuno blotting) ובצעו בלוט עם נוגדן מתאים. בניסוי זה, השתמשנו בנוגדן rat anti DAT מחברת Checon (מספר 3609) בדילול של 1:2000. תעו את הפסים האימונוראקטיביים באמצעות מערכת תיעוד ג'לים עם מצלמת CCD, תוך וידוא שאין פיקסלים רוויים. בניסוי זה, השתמשנו במערכת הדמיה BioRad VersaDoc ובתוכנת Quantity One כדי לכמת את צפיפותו של כל פס.

כאן מוצג בלוק אימונו-בלוט מייצג מהליך הפיכות הקישור של נשא הדופמין. האות החזק ביותר הוא הכמות הכוללת של חלבון פני השטח לפני הפנמנה, כפי שנראה בנתיב הכולל (Total) או T. בקרת השטיפה (Strip) או S אמורה להיות באופן אידיאלי קרובה לריק ולהפגין יעילות שטיפה גבוהה. יעילות השטיפה מחושבת באמצעות מדידות צפיפות הפסים בנוסחה הבאה.

רצועה זו בניסוי הייתה יעילה ב-99.8%. רצועות עם יעילות של 90% ומעלה נחשבות לאופטימליות, ותוצאות מתחת לרמה זו יש להשליך. דוגמה זו של רצועת נקבים מראה פס גלוי בנתיב הרצועה עם יעילות רצועה של 34%. כאן, הפסים בעלי העוצמה הנמוכה יותר הם נתיבי ההפנמה מהפלטה הניסויית. התאים טופלו בממס או ב-PMA בריכוז של 1 µM במהלך הפנמה של 10 דקות, ונמדדו שיעורי ההפנמה של נשאי הדופמין.

שיעור ההפנמה מחושב באמצעות מדידות צפיפות הפסים באופן הבא, כפי שניתן לראות בגרף זה, 10.4% מ-DAT השטח הופנמו לאורך 10 דקות בתנאי טיפול ב-vehicle. עם זאת, טיפול ב-PMA העלה את שיעורי הפנמת ה-DAT ל-23.2% מכלל ה-DAT השטח. כך ראיתם כיצד למדוד שיעורי הפנמה של חלבון ממברנת הפלזמה באמצעות טכניקת biotinylation הפיכה.

חשוב לזכור שני דברים: יש להכין את ריאגנט ה-bio tonation ואת ה-TCP באופן טרי ממש לפני השימוש. אם תגלו שאתם מאבדים תאים רבים במהלך הפרוטוקול, השתמשו בתשתית להיבטאות תאים (cell adhesion substrate) בצלחות שלכם. זהו כל הסיפור.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.