מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול

הליך זה מסתמך על צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים, שלאחר מכן יכולים להיות מבודדים משאר תאי הצמח באמצעות מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים או עובדות. דוגמה זו משתמשת בשני קווי סמן המתבטאים בסוגי תאים ספציפיים של Arabidopsis. שתילי שורש אליאנה גדלים במגשי פיטו או על צלחות אגר.

שורשיהם נקצרים ומטופלים באנזימים המעכלים את דופן התא. לאחר שעה מסננים את התמיסה כדי להסיר פסולת גדולה. לאחר מכן התמיסה עוברת צנטריפוגה ומסירים את הסופרנטנט.

פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP מופרדים לאחר מכן על ידי פקס. החומר הממוין יכול לשמש לניתוח ספציפי לסוג התא כגון פרופילי שעתוק רחבים בגנום. היי, אני Basian Barman מהמעבדה של קן בירנבאום במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ניו יורק.

היום נראה לכם נוהל למיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים של פרוטופלסטים צמחיים. בדוגמה זו, נמיין שני סוגי תאים ספציפיים במסלול Arabidopsis. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פרופילי שעתוק ספציפיים לסוג התא.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, גדל שתילים מסוג בר כמו גם שתילים בעלי ביטוי ספציפי לסוג התא של GFP. מקדם הדחליל המניע GFP מסמן את אנדודרמיס השורש ואת המרכז השקט בקבוצה אחת של שתילים.

ובקבוצה אחרת, המרכז השקט של השורש מסומן על ידי מקדם הטיולים החמישי המניע GFP. השתילים גדלים באופן הידרופוני ומגשי FIA על גבי מסנן ניילון, המאפשר לשורשים לצמוח לתוך מצע הגידול. לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי רשת ניילון ולמקם אנכית צלחות אגר של 1%.

בנוסף לסיוע בקציר השורשים, המסננים מאפשרים להעביר את השתילים במסה למגשי פיטו חדשים או לצלחות אגר שם ניתן להשלים אותם עם זרז מעניין. זה עשוי להיעשות כדי לחקור תגובות שעתוק ספציפיות לסוג התא לחומרים מזינים, הורמונים או טיפולי מתח. בדוק תחת מיקרוסקופ הקרינה כדי לוודא שהסמן הפלואורסצנטי מתבטא כצפוי.

ודא שדפוס הביטוי של הסמן עקבי בתנאי הטיפול המיושמים מכיוון שהוא יכול להשתנות כתוצאה מהטיפול. המשך לקטיף והכין פרוטופלסטים. התחל בהכנת תמיסת הפרוטופלסטים.

שלב 1.25% משקל לנפח צלולאז 0.3% משקל לנפח, זיים מייזר 0.4 מניטול D מולארי 20 מילימולר, MES ו-20 מילי-מולר KCL במים דה-מינרליים והתאם את ה-pH ל-5.7 עם טריס HCL מולארי אחד ב-pH 7.5. פתרון זה יהיה מעט עכור. לאחר מכן מחממים את התמיסה ל 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

התמיסה תתבהר, תיתן לה להתקרר לטמפרטורת החדר ואז תוסיף 0.1% משקל לנפח BSA 10 מילי-מולרי סידן כלורי, וחמישה מילי-מולרית בטא מי קפטו אתנול קוטפים שתילים בני שבוע ממגש פיטו אחד. במקרה של הדחליל קו GFP או שמונה צלחות של הליכות בנות ארבעה ימים שתילי FP 5G. מגרדים את השורשים מרשת הניילון בעזרת אזמל, ואז מפקידים אותם במיכל עם תמיסת פרוטופלסטים.

השתמש בכ -10 מיליליטר תמיסת פרוטופלסטים לכל 1500 שתילים. יש לנער את הצלוחיות בעדינות בחום של 75 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעה. זמן דגירה ארוך יותר עשוי להגדיל את תפוקת הפרוטופלסטים, אך גם יוסיף להשפעה של הפרוטופלסטים עצמם על ביטוי הגנים.

כעת, לאחר שחרור הפרוטופלסטים, השתמש במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן את התמיסה ולחלק את מתלה הפרוטופלסטים בין צינורות חרוטיים של 15 מיל. חשוב לייצר תרחיף פרוטופלסטים נקיים ללא יותר מדי פסולת כדי למנוע סתימת העובדות ולמזער את הזמן הדרוש למיון התאים. צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה של דלי נדנדה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

שימו לב שמהירות הצנטריפוגה תלויה במבנה קטע הצמח המניב את הפרוטופלסטים ובכמות פסולת התאים המיוצרת במהלך הטיפול האנזימטי. לאחר הצנטריפוגה, הסר את רוב הסופרנטנט והשהה בעדינות את הגלולה המכילה את הפרוטופלסטים בנפח הקטן של תמיסת הפרוטופלסטים שנותרה. לבסוף, ספרו את הפרוטופלסטים באמצעות ציטומטר המו וקבעו את צפיפותם כדי לחשב את התשואה ולהחליט על פרמטרי ריצת העובדות.

לאחר הספירה, בדוק את הפרוטופלסטים. בדוק את תקינותם, את רמת ביטוי ה- GFP ואת תכולת פסולת התאים המזהמת. לאחר מכן, המשך לפקס.

אם לא ממשיכים ישירות לפקס. ניתן לשטוף, לתלות ולאחסן פרוטופלסטים בתמיסת דגירה כגון תמיסת ציפוי פרוטו ללא תוספת האנזימים או תמיסת W five. הפעל את סדרן התאים ואת מחשב תחנת העבודה.

כאן אנו משתמשים בפרייה המיוצרת על ידי בקטון דיקסון ושות'. השתמש ב-XPBS אחד כנוזל נדן והפעל את הליך ההפעלה הנוזלית. התקן זרבובית של 100 מיקרומטר והגדר לחץ נדן של 20 PSI.

הגדר זרם זרימה יציב וכיול את עיכוב הירידה. שים לב שהכיול אינו מוצג בהליך זה. ניתן למיין בהצלחה מתלי פרוטופלסטים בצפיפות של עד 10 מיליון תאים למיל.

על מנת למנוע שקיעה של הפרוטופלסטים, השתמש באפשרות התסיסה לדוגמה על העובדות. אם סתימת העובדות היא בעיה, ישנם שלושה שלבי ירי אפשריים. ראשית, בצע שטיפה לאחור של קו מדגם.

שנית, דלל את מתלי הפרוטופלסטים שלך כדי להפחית את הצפיפות. שלישית, נקה את תמיסת הפרוטופלסטים על ידי חזרה על שלב הסינון לאחר צנטריפוגה והשעיית החייאה. רק ארבעה פרמטרים משמשים כדי להבחין בין פרוטופלסטים חיוביים של GFP לבין פרוטופלסטים שליליים של GFP ופסולת תאים לאחר עירור על ידי לייזר 488 ננומטר פיזור קדימה הוא אינדיקטור לגודל החלקיקים, פיזור הצד כאינדיקטור לגרעיניות החלקיקים.

פליטה ב-530 ננומטר כמדד לפלואורסצנציה ירוקה ופליטה ב-610 ננומטר כמדד לאוטופלואורסצנציה בספקטרום אדום. התחל בהגדרת תרשים נקודות לפיזור קדימה לעומת פיזור צדדי. החל את הגדרת המתח כך שהאירועים הנמדדים יתרכזו בעלילה.

ניתן להבחין ב-PROTOPLASTS חיוביים ל-GFP על ידי היחס המוגבר שלהם בין פליטה ירוקה לאדום בהשוואה לאירועים עם אוטופלואורסצנטיות. הגדר רק תרשים נקודות עם פלואורסצנציה ירוקה לעומת אוטופלואורסצנציה בספקטרום אדום. החל הגדרות מתח בצורה כזו שהאירועים הנמדדים יובילו לאוכלוסייה אלכסונית אחת בחלקה.

כאשר מסתכלים על תרחיף פרוטופלסטים מסוג בר, פרוטופלסטים חיוביים של GFP אמורים לייצר אוכלוסייה ברורה של אירועי פלואורסצנט ירוקים שמעולם לא נראו בדגימות מסוג בר. הגדר אילוצי פיצוי כדי להתאים לחפיפה ספקטרלית בין פלואורסצנציה ירוקה לספקטרום אדום. באמצעות מתלה PROTOPLASTS חיובי GFP, הגדרות אילוצי פיצוי מתאימות יאפשרו הפרדה טובה יותר של הפרוטופלסטים החיוביים של GFP מהפרוטופלסטים שאינם GFP ופסולת הקימה שער לזיהוי אירועים חיוביים של GFP.

רצוי לקחת איתך PROTOPLASTS שאינם GFP בכל פעם שאתה מכין ניסוי מיון כדי לעזור להגדיר את גבולות השער. לבסוף, הגדר ניתוק סף פיזור קדימה על מנת להשאיר פסולת קטנה מחוץ לניתוח. ההדמיה של אירועים חיוביים של GFP בתרשים הפיזור קדימה לעומת פיזור הצד תעזור לקבוע היכן יש להגדיר את הסף.

ניתן לעשות שימוש חוזר בפרמטרים שהוגדרו בריצת העובדות הראשונית הזו למיונים עתידיים. יידרשו התאמות קלות לשימוש היומיומי בעובדות. למיצוי RNA הכינו צינורות איסוף המכילים מאגר מיצוי RNA לכל היותר השתמשו בנפח מיון של 100 מיקרוליטר עד מאגר מיצוי של 350 מיקרוליטר כמדריך.

20,000 אירועי מיון מניבים נפח מיון כולל של כ-100 מיקרוליטר. כעת, לאחר שפרמטרי הפקס ומצבי ההפעלה מוגדרים וצינורות האיסוף מוכנים, התחל למיין את הפרוטופלסטים בסיום המיון. מערבבים את צינורות איסוף הדגימה שכן מתלה תאים יכול להצטבר בחלק העליון ניתן להשתמש בכמה מ-500 אירועים ממוינים לניתוח מיקרו-מערך לאחר מיצוי RNA והגברת CD NA.

כאן אנו משתמשים בערכת מיצוי המיקרו RNEZ, במערכת הגברת ה-RNA של WT ovation PICO ובמודול הביוטין של fl ovation CD NA V two. להלן תוצאות פקס אופייניות עבור פרוטופלסטים שמקורם בדחליל שאינו GFP, שתילי GFP ו-W 5G FP 100,000 אירועים מוצגים בכל חלקת נקודות של פלואורסצנציה ירוקה על ציר x לעומת פלואורסצנטי אדום. בציר Y, האירועים הנופלים בתוך שער המיון של GFP מודגשים בירוק.

זהו סיכום של תפוקת הפרוטופלסטים האופיינית מהשתילים המבטאים דחליל GFP המסמן את אנדודרמיס השורש ומרכז השקט או הליכות 5G FP המסמנות את מרכז השקט של השורש. ישנם פחות תאים במרכז השקט של השורש בהשוואה לאנדודרמיס השורש. לכן, למרות ההתחלה עם יותר פרוטופלסטים, התשואה של תאים המבטאים GFP קטנה יותר במיון 5G FP בהשוואה למיון GFP של הדחליל המוצג כאן הם תוצאות מיצוי RNA טיפוסיות של דגימות משולשות.

כל דגימה תואמת את ה-RNA שהופק מ-10,000 אירועים. ה-RNA המופק מנותח על ביו-אנלייזר המציג את הפסגות הריבוזומליות עבור דגימות GFP של הדחליל למעלה וניתן להשתמש בדגימות 5G FP מתחת ל-RNA המופק לניתוח מיקרו-מערך. תרשים פיזור זה של שתי רמות ביטוי לוג מדגים את הדמיון בין שני שכפולים.

זה עתה הראינו לך כיצד לבצע מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של פרוטופלסטים צמחיים לניתוח ספציפי לסוג התא. טכניקה זו ישימה לרקמות ומינים רבים של צמחים שונים. תשואות טובות עם תכולת פסולת נמוכה ופרוטופלסטים בריאים יתנו תוצאות טובות יותר במורד הזרם בניתוחי שעתוק כמו גם אחרים.

זכור גם שחשוב לשמור על תנאי גידול זהים של החומר הצמחי לצורך השוואה בין דגימות ממויינות. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.