מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

הליך זה מתבסס על צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים, אותם ניתן לבודד משאר תאי הצמח באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה או FACS. דוגמה זו משתמשת בשני קווי סמן המבטאים ביטוי בסוגי תאים ספציפיים של *Arabidopsis thaliana*. נבטי שורש גודלים במגשי phyto או בצלחות אגר.

שורשיהם נאספים ומטופלים באנזימים לעיכול דופן התא. לאחר שעה, התמיסה מסוננת כדי להסיר שיירי תאים גדולים. לאחר מכן התמיסה עוברת סנטריפוגציה והנוזל העליון מוסר.

פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP מופרדים לאחר מכן באמצעות fax. החומר הממוין יכול לשמש לאנליזה ספציפית לסוג תא, כגון פרופילים שגורתיים ברחב הגנום. שלום, אני Basian Barman מהמעבדה של Ken Birnbaum במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ניו יורק.

היום נדגים לכם פרוצדורה למיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של פרוטופלסטים מצמחים. בדוגמה זו, נמיין שני סוגי תאים ספציפיים בשורש של Arabidopsis. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פרופילים שעתוקיים ספציפיים לסוג התא.

אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו נבטים מסוג בר (wild type) וכן נבטים בעלי ביטוי של GFP ספציפי לסוג תא. הקידומת (promoter) של scarecrow המניעה את ה-GFP מסמנת את האנדודרמיס של השורש ואת המרכז השקט (quiescent center) בקבוצה אחת של נבטים.

ובקבוצה אחרת, מרכז השקיעה של השורש מסומן על ידי הקידום של walk5 המפעיל GFP. השתילים גודלים באופן הידרופוני במגשאי FIA על גבי מסנן ניילון, המאפשר לשורשים לגדול דרכו אל תוך מצע הגידול. לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי רשת ניילון ובצלחונות אגר 1% הממוקמים בצורה אנכית.

בנוסף לסיוע בקצירת השורשים, המסננים מאפשרים להעביר את השתילים באופן המוני לתבניות פיטו (phyto trays) חדשות או לצלחות אגר, שבהן ניתן להוסיף להם זרז רצוי. ניתן לעשות זאת כדי לחקור תגובות שעתוק ספציפיות לסוג תא למזינונים, הורמונים או טיפולי עקה. בדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לוודא שהסמן הפלואורסצנטי מובע כמצופה.

יש לוודא כי תבנית הביטוי של הסמן עקבית תחת תנאי הטיפול המיושמים, שכן היא עלולה להשתנות כתוצאה מהטיפול. המשיכו לקציר ולהכנת פרוטופלסטים. התחילו בהכנת תמיסת הפרוטופלסטים.

ערבבו במים דמינרליים cellulase בריכוז 1.25% weight per volume, maser zyme בריכוז 0.3% weight per volume, D mannitol בריכוז 0.4 molar, MES בריכוז 20 millimolar, ו-KCL בריכוז 20 millimolar, וכווןנו את ה-pH ל-5.7 באמצעות tris HCL בריכוז one molar ב-pH 7.5. תמיסה זו תהיה עכורה מעט. לאחר מכן, חממו את התמיסה ל-55 degrees Celsius למשך 10 דקות.

התמיסה תהפוך שקופה; יש להניח לה להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף BSA בריכוז 0.1% משקל לנפח, calcium chloride בריכוז 10 millimolar, ו-beta me capto ethanol בריכוז five millimolar. קצרו נבטים בני שבוע מתוך phyto tray אחד. במקרה של קו ה-scarecrow GFP, או שמונה צלחות של נבטי 5G FP בני ארבעה ימים. גרדו את השורשים מרשת הניילון באמצעות סכין מנתח, ולאחר מכן העבירו אותם למכל המכיל תמיסת protoplasts.

השתמש בכ-10 milliliters של תמיסת פרוטופלסטים לכל 1500 שתילים. נער את הבקבוקים בעדינות ב-75 RPM בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. זמן אינקובציה ממושך יותר עשוי להגדיל את תנובת הפרוטופלסטים, אך יעצים גם את ההשפעה של הפרוטופלסטים עצמם על ביטוי הגנים.

כעת, לאחר ששחררו את הפרוטופלסטים, השתמשו במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן את התמיסה וחלקו את תרחיף הפרוטופלסטים בין מבחנות קוניות של 15 מל. חשוב להפיק תרחיף פרוטופלסטים נקי ללא שאריות רבות כדי למנוע סתימה של המכשירים ולמזער את הזמן הדרוש למיון התאים. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה בעלת סלים נדנדים (swing bucket centrifuge) ב-500 G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

שימו לב כי מהירות הצנטריפוגציה תלויה בהרכבו של חלק הצמח ממנו מופקים הפרוטופלסטים ובכמות פסולת התאים הנוצרת במהלך הטיפול האנזימטי. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את רוב הנוזל העליון ושחזרו בעדינות את המשקע המכיל את הפרוטופלסטים בנפח הקטן של תמיסת הפרוטופלסטים שנותרה. לבסוף, ספרו את הפרוטופלסטים באמצעות המוציטומטר וקבעו את צפיפותם כדי לחשב את התנובה ולהחליט על פרמטרי ההרצה של המיון בתאי זרימה (FACS).

לאחר הספירה, בחנו את הפרוטופלסטים. בדקו את שלמותם, את רמת ביטוי ה-GFP ואת כמות שיירי התאים המזהמים. לאחר מכן, המשיכו ל-fax.

אם לא ממשיכים ישירות למיון. ניתן לשטוף, לתלה שוב ולשמור את הפרוטופלסטים בתמיסת דגירה, כגון תמיסת proto plating ללא האנזימים המוספים או תמיסת W five. הפעילו את מיין התאים ואת מחשב תחנת העבודה.

כאן אנו משתמשים במכשיר fria המיוצר על ידי Becton Dixon and Company. השתמש ב-XPBS אחד כנוזל מעטפת (sheath fluid) והפעל את הליך אתחול הזרימה. התקן נחיר ברוחב 100 µm והגדר לחץ מעטפת של 20 PSI.

הקימו זרימה יציבה וכיילו את השהיית הטיפה (drop delay). שימו לב שהכיול אינו מוצג בהליך זה. ניתן למיין בהצלחה תרחיפי פרוטופלסטים בצפיפות גבוהה של עד 10 מיליון תאים למ"ל.

על מנת למנוע שקיעה של הפרוטופלסטים, השתמש באפשרות ערבול הדגימה במכשיר ה-facts. אם סתימה של ה-facts מהווה בעיה, קיימים שלושה שלבי פתרון תקלות אפשריים. ראשית, בצע שטיפה אחורית (back flush) של קו הדגימה.

שנית, דללו את תרחיף הפרוטופלסטים כדי להפחית את הצפיפות. שלישית, נקו את תמיסת הפרוטופלסטים על ידי חזרה על שלב הסינון לאחר סרכוז ותלייה מחדש של התרחיף. ארבעה פרמטרים בלבד משמשים להבחנה בין פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP לבין פרוטופלסטים שליליים ל-GFP ושאריות תאים לאחר עירור באמצעות לייזר של 488 nanometer: פיזור קדימה (forward scatter) משמש כאינדיקטור לגודל החלקיק, ופיזור צידי (side scatter) כאינדיקטור לגרנולריות של החלקיק.

פליטה ב-530 nanometers כמדד לפלואורסצנציה ירוקה ופליטה ב-610 nanometers כמדד לאוטופלואורסצנציה של הספקטרום האדום. התחילו בהגדרת תרשים פיזור (dot plot) של פיזור קדמי (forward scatter) לעומת פיזור צדי (side scatter). הגדירו את המתח כך שהאירועים הנמדדים יהיו ממורכזים בתרשים.

ניתן להבחין בין PROTOPLASTS חיוביים ל-GFP לבין אירועים עם פלואורסצנציה עצמית על ידי יחס גבוה יותר של פליטה ירוקה לעומת אדומה. הגדירו dot plot של פלואורסצנציה ירוקה לעומת פלואורסצנציה עצמית בספקטרום האדום. הגדירו את ערכי המתח כך שהאירועים הנמדדים יניבו אוכלוסייה אלכסונית אחת בגרף.

בבחינה של תרחיף פרוטופלסטים מסוג בר (wild type), פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP אמורים להפיק אוכלוסייה ברורה של אירועים פלורסצנטיים ירוקים שאינם נראים בדגימות מסוג בר. הגדירו הגבלות פיצוי (compensation constraints) כדי להתאים את החפיפה הספקטרלית בין פלורסצנציה ירוקה לאוטופלורסצנציה של הספקטרום האדום. בשימוש בתרחיף פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP, הגדרות נכונות של הגבלות הפיצוי יאפשרו הפרדה טובה יותר של הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP מהפרוטופלסטים שאינם חיוביים ל-GFP ומשאריות (debris); הגדירו שער (gate) לזיהוי אירועים חיוביים ל-GFP.

מומלץ להכין בכל פעם שאתם מכינים ניסוי מיון גם פרוטופלסטים שאינם GFP, כדי לסייע בהגדרת גבולות השער (gate boundaries). לבסוף, הגדירו סף חיתוך של פיזור קדימה (forward scatter) כדי להוציא שברים קטנים מהניתוח. ויזואליזציה של אירועים חיוביים ל-GFP בגרף של פיזור קדימה לעומת פיזור צדי תסייע בקביעת המקום שבו יש להגדיר את הסף.

ניתן להשתמש שוב בפרמטרים שהוגדרו בהרצת העובדות הראשונית זו עבור מינויים עתידיים. לשימוש יומיומי ב-facts יידרשו התאמות קלות. לצורך מיצוי RNA, הכינו מבחנות איסוף המכילות בופר למיצוי RNA; ככלל, השתמשו בנפח מיון של עד 100 µL עבור 350 µL של בופר למיצוי.

20,000 אירועי מיון מניבים נפח מיון כולל של כ-100 microliters. כעת, כאשר פרמטרי ה-fax ומצבי ההפעלה נקבעו ומבחנות האיסוף מוכנות, התחל במיון הפרוטופלסטים עד להשלמת המיון. ערבב את מבחנות איסוף הדגימות כיוון שתיתלהי תרחיף תאים עלול להצטבר בחלק העליון; ניתן להשתמש ב-500 אירועי מיון בודדים לצורך אנליזת microarray לאחר מיצוי RNA והגברה של CD NA.

כאן אנו משתמשים בערכה למיקרו-מיצוי RNEZ, במערכת להגברת RNA מסוג WT ovation PICO ובמודול biotin CD NA fl ovation גרסה 2. אלו הן תוצאות FACS טיפוסיות עבור פרוטופלסטים שהופקו מנבטים של non GFP Scarecrow, GFP ו-W 5G FP. בכל תרשים פיזור מוצגים 100,000 אירועים של פלואורסצנציה ירוקה בציר ה-x לעומת פלואורסצנציה אדומה. בציר ה-y, האירועים הנופלים בתוך שער המיון של ה-GFP מודגשים בירוק.

זהו סיכום של תנובת הפרוטופלסטים הטיפוסית מנבטים המבטאים או את scarecrow GFP המסמן את האנדודרמיס של השורש ואת המרכז השקט, או את walks 5G FP המסמן את המרכז השקט של השורש. ישנם פחות תאים במרכז השקט של השורש בהשוואה לאנדודרמיס של השורש. לכן, למרות התחלה עם מספר רב יותר של פרוטופלסטים, תנובת התאים המבטאים GFP קטנה יותר במיון של walks 5G FP בהשוואה למיון של scarecrow GFP. מוצגות כאן תוצאות טיפוסיות של מיצוי RNA מדגימות שנבצעו בשלוש חזרות.

כל דגימה תואמת ל-RNA שהופק מ-10,000 אירועים. ה-RNA המופק נסרק ב-bioanalyzer המציג את הפיקים הריבוסומליים עבור דגימות scarecrow GFP למעלה ודגימות walks 5G FP למטה. ניתן להשתמש ב-RNA המופק בהמשך לצורך ניתוח microarray. תרשים פיזור זה של רמות ביטוי log two מדגים את הדמיון בין שתי חזרות.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של פרוטופלסטים מצמחים לצורך אנליזה ספציפית לסוג התא. טכניקה זו ישימה עבור רקמות ומיני צמחים רבים ושונים. תנובות גבוהות עם תכולת פסולת נמוכה ופרוטופלסטים בריאים יניבו תוצאות טובות יותר בשלבים הבאים של אנליזות תעתוק ואנליזות אחרות.

זכרו גם כי חשוב לשמור על תנאי גידול זהים עבור החומר הצמחי לצורך השוואה בין הדגימות הממוינות. זהו כל הסיפור. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.