Name: מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: למד שיטה לבידוד סוגי תאים ספציפיים מ-Arabidopsis thaliana באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי (FACS). השיטה משתמשת בקווי סמן טרנסגניים המביעים חלבון GFP לזיהוי מדויק של תאים מטרה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק לא. DBI 0519984) לבין המכון הלאומי לבריאות (ללא מענק. 5R01GM078279) ..

1) הכנת חומר המפעל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Protoplasts ניתן להסיק הרבה מיני צמחים ורקמות שונים ובלבד התמהיל הנכון של אנזימי עיכול דופן התא משמש 1. לפני ניסוי בקנה מידה מלא נעשית, עיכול בקנה מידה קטן של החומר מומלץ על מנת להעריך את היעילות protoplasting של הרקמה, אנזימים, וכו ', כדי לאמוד את אחוז התאים החיוביים למיון התא. כאן, protoplasts נגזר שורשי שתילי thaliana ארבידופסיס כי תא מסוג במיוחד לבטא חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP) משמשים. Endodermis מרכז שקט מסומנים על ידי P SCR: GFP ומרכז שוקט על ידי P WOX5: GFP 2,3 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים בוגרים hydroponically ב phytatrays (סיגמא; איור 2 א) על מסנן ניילון (250 מיקרומטר רשת; NITEX) המאפשרת השורשים לצמוח דרך לתוך מדיום הגידול (0.22% w / v Murashige ובינוניים Skoog בסל [סיגמא], 1% w / v סוכרוז, 0.05% w / v MES [2 - (N-morpholino) חומצה ethanesulfonic], pH 5.7 עם KOH). לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי מסנן ניילון (100 מיקרומטר רשת) ב במאונך צלחות אגר 1% (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במסננים הנ"ל לא רק מסייע הקציר של השורשים, הוא גם מאפשר טיפול נוסף קל של שתילים, אם תרצה בכך. המסננים מאפשרים את השתילים שיועברו בהמוניהם phytatrays חדש או צלחות אגר השלים עם זרז של עניין. כך, למשל, להגדיר את phytatray למעלה נעשה שימוש לצורך ניתוח התא סוג ספציפי של התגובה תעתיק לטיפול חנקן שתילים ארבידופסיס 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו כי סמן פלורסנט מיקרוסקופית שלך באה לידי ביטוי בצורה נכונה (במיוחד בעת שימוש באפשרות הטיפול, כמו סוג התא הסמנים הספציפיים עצמם עשויים להיות מושפעים הטיפול). במקרה זה, שתילים נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, איור 1). שימו לב לסוג ספציפי שורות תאים פלורסנט סמן צריכה להיות מאופיינת בתחילה תחת מיקרוסקופ confocal כדי לקבוע בדיוק אילו סוגי תאים מסומנים ולקבוע השתנות בביטוי. </li></ol> 2) הכנת התמיסה protoplasting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1.25 w / v% cellulase (Yakult), 0.3% w / v Macerozyme (Yakult), 0.4 מ 'ד מניטול, 20 מ"מ ו - MES KCl 20 מ"מ (ממלאי M 1) במים demineralized ולהתאים את ה-pH ל 5.7 עם 1 מ טריס / HCl pH 7.5. פתרון זה יהיה עכור מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (הפתרון יהפוך ברור) ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני הוספת 0.1% w / v BSA (אלבומין בסרום שור), 10 mM CaCl 2, ו - 5 מ"מ β-mercaptoethanol . </li></ol> 3) קציר protoplasting החומר צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורשי נקצרים על ידי גירוד להם את רשת ניילון עם אזמל והפקידו לתוך בקבוקון המכיל את הפתרון protoplasting. באופן כללי, 10 מ"ל של תמיסת protoplasting משמש לכל 1,500 שורשי שתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את צלוחיות בעדינות (75 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. זמן הדגירה כבר עשוי להגדיל את התשואה protoplast אלא גם להוסיף אפקט של protoplasting עצמו על ביטוי גנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון protoplast עם מסננת תא 40 מיקרומטר (BD פלקון) ולחלק את הפתרון מעל חרוטי 15 צינורות מ"ל (BD פלקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות בצנטריפוגה הנדנדה דלי במשך 10 דקות ב הערה ג 500 זה מהירות צנטריפוגה יהיה תלוי בסוג של protoplasts בשימוש, השבריריות שלהם ואת כמות פסולת התא הנוצר במהלך הטיפול האנזימטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רוב supernatant, resuspend protoplasts בפתרון הנותרים ולבדוק אותם מיקרוסקופית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שימוש hemacytometer להעריך את מספר וצפיפות protoplasts. צפיפות התאים תקבע הזרקה מדגם מהירות, קצב האירועים לכל השני ולכן סך כל הזמן הדרוש כדי למיין את התאים ב FACS (ראה גם סעיף 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7) או להמשיך ישירות FACS או לרחוץ resuspend protoplasts בפתרון דגירה, כגון W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, KCl 5 מ"מ, 5 מ"מ MES, להתאים את pH עד 5.7 עם KOH) או פתרון protoplasting ללא הוסיף אנזימים. במיוחד כאשר מסתכלים שינויים תעתיק, יש חשיבות כדי למזער את החשיפה של הדגימות בתנאים שעשויים להשפיע על ביטוי גנים, כגון שינוי למאגר protoplasts נשמרים פנימה לכן מומלץ לשמור על protoplasts בפתרון protoplasting והמשך כדי FACS בהקדם האפשרי. </li></ol> 4) מיון פלואורסצנטי תא פעיל של protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ולהכין את סדרן התא. כאן, FACSAria (BD) משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זרם לזרום עם 100 &amp; mu; זרבובית מ 'לחץ נדן 20 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות התאים הזרקת מהירות מדגם ניתן להתאים את הניסוי מסוים בהתבסס על אם התשואה הטובה ביותר האפשרית או מהירות השגה המהיר ביותר הוא הרצוי. יש לנו מיון בהצלחה עם צפיפות של עד 10,000,000 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תסיסה מדגם אפשרות FACS כדי למנוע שקיעה של protoplasts. אם סתימת של FACS היא בעיה, ישנם שלושה שלבים לפתרון בעיות אפשריות: 1. בצע backflush מדגם-line. 2. מדולל ההשעיה protoplast שלך כדי להפחית את הצפיפות. 3. לנקות את הפתרון protoplast על ידי חזרה על השלב סינון (3.3) לאחר צנטריפוגה ו resuspension. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשיר למדידת פיזור קדימה (FSC), לצד פיזור (SSC) ופליטה ב 530/30 ננומטר עבור ה-GFP ו ננומטר 610/20 אדום עבור ספקטרום autofluorescence (RSA) לאחר עירור על ידי לייזר 488 ננומטר. אלה הם למעשה רק את הפרמטרים המשמשים לבודד GFP חיובי protoplasts. הנה, את הגדרות המתח היו כדלקמן: FSC - 60V, SSC 250V, 350V ו-GFP RSA 335V. שים לב כי הגדרות מתח אופטימלי יהיה שונה עבור כל FACS ויהיה גם צורך להתאים את אורך החיים של סדרן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי הגדרת dotplot עבור פיזור קדימה לעומת פיזור לוואי. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים הנמדדים הם התרכזו בעלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, ליצור עלילה נקודה של אותות פלואורסצנטי ירוק לעומת אדום. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים נמדדת התשואה אוכלוסייה אלכסוני מרוכז בעלילה כאשר מסתכלים השעיה (לא GFP) wild-type protoplast. ההשעיה protoplast נגזר משורת סמן GFP יפיק האוכלוסייה ברורה של אירועים פלואורסצנטי ירוק לעולם לא לראות wild-type דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת אילוצים פיצויים להתאים חפיפה בין ספקטרום ה-GFP ו-RSA. פרופר אילוץ הגדרות הפיצוי יאפשר הפרדה טובה יותר של ה-GFP חיובי protoplasts מ protoplasts הלא GFP ופסולת. האילוצים משמש כאן הן כדלקמן: RSA, GFP מינוס 17.91%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שער לזהות GFP חיובי אירועים, שליטה שלילי של אי - GFP protoplasts צריך לשמש כדי לסייע בהגדרת גבולות השער (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום הפסקת פיזור קדימה כדי להשאיר פסולת קטן מתוך ניתוח. דמיינו את ה-GFP חיובי אירועי העלילה מול SSC FSC כדי לקבוע את המיקום של הפסקת. הנה, הפסקת נקבע 5000. שים לב FACS יהיה לספור פסולת כאירועים למיין מדגם עם רמות גבוהות של פסולת ייתכן GFP שונה אחוזים אירועים חיוביים מהצפוי. זה לא בהכרח בעיה. עם זאת, פסולת יותר במדגם, ככל למיין את ייקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם הניסוי ואת שפע של סוג התא כדי להיות מנותח, להגדיר את מצב דיוק FACS או עבור תשואה אופטימלית או טוהר אופטימלי של תאים ממוינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת RNA, להכין אוסף צינורות (1.5 מ"ל צינורות microfuge) עם כמות מתאימה של חיץ מיצוי RNA. עם ההגדרה הזו, 20,000 אירועים מיון תניב בנפח כולל של כ 100 μl אשר מוינו ל 350 μl של חיץ החילוץ (RNeasy מיקרו בערכה, QIAGEN). מערבבים דגימות לאחר השלמת מהסוג כמו השעיה התא יכול בריכה בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות או להמשיך ישירות RNA החילוץ. מנתח microarray מוצלח כבר preformed עם RNA המופק קטנה כמו 500 אירועים מיון. הנה, השתמשנו ערכת חילוץ RNeasy מיקרו (QIAGEN), את WT-Ovation פיקו RNA מערכת הגברה ו FL-Ovation cDNA ביוטין Module V2 (NuGEN). </li></ol> נציג תוצאות אחת phytatray של כ -1,500 אחד בן שבוע P SCR: שתילים GFP הניבו כ -60,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 2.6% מכלל 65,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ב). שמונה צלחות של כ 1500 ארבעה ימים בת P WOX5:: כל השתילים GFP (12,000 סה"כ) הניבה כ - 30,000,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 0.063% של 16,000,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ג'). 10,000 אירועי מיון משמשים בדרך כלל עבור מיצוי רנ"א יכול להניב 20-140 ng סך רנ"א (איור 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סוג ספציפי Cell-GFP סמן שורות שורש ארבידופסיס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ו-GFP לסנן על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. שתי שורות סמן השתמשו בניסוי הזה חזותי מוצגים;א) P SCR: GFP ו-B) P WOX5: ה-GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. שתילים הצמח תנאי הגידול. גדלו בקר סביבתי hydroponically phytatrays ב (א) או על צלחות אגר במאונך (ב). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור 3. Protoplasts הצמח להביע GFP. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ומסנן GFP על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. החצים מצביעים על תא פרץ, פסולת תאים protoplast GFP חיובי. המרחק בין שני קווים לבנים הוא 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. מיון פלואורסצנטי תא פעיל של ה-GFP חיובי protoplasts Protoplasts נגזר סוג בר (א) SCR P:.: GFP (ב) או P WOX5: GFP (ג) קווי סמן נותחו מיון עם FACSAria (BD) מוגדר באמצעות שערים על dotplot של ירוק (530 / 30 ננומטר; ציר x) לעומת אדום (610 / 20 ננומטר; ציר Y) פלואורסצנטי. 100.000 אירועים מוצגים כל חלקה. האירועים נופלים בתוך השער מיון GFP מודגשים בירוק. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> איור 5. נציג RNA עקירות מ 10.000 תאים ממוינים. תאים מוינו ישירות RNA מיצוי חיץ (QIAGEN), RNA היה מטוהרים ובדק על טוהר ריכוז, שלמות על 2100 Bioanalyzer (Agilent). שלושה משכפל לשני קווי סמן מוצגים.

<ol><li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+fluorescent+selection+permits+precise%2C+rapid%2C+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li>
<li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
</ol>

Protoplasts יכול, באופן עקרוני, להיגזר במגוון של רקמות הצמח, אופטימיזציה תנאים נוחים יהיה מאוד לשפר את איכות וכמות RNA. הן פתרון protoplasting ואת חיץ הדגירה בחירה בשימוש ישפיעו על היבט זה. רבים חלבוני ניאון שונים יכול לשמש, בהתאם ליכולות של FACS משמש, למשל GFP, RFP, YFP, CFP או וריאנטים רבים שלהם נגזרים. הביטוי של סמנים יכול להיות מונע לא רק על ידי סוג מסוים היזמים לתא או מלכודות משפר, כפי שמוצג כאן, אל...

<table><tbody><tr><td>250 &amp;mu;רשת ניילון במידה m</td><td>סינון Sefar</td><td>NITEX 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;רשת ניילון m</td><td>סינון Sefar</td><td>NITEX 03-100/47</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מרובעות</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-10k</td><td></td></tr><tr><td>מגשי שתילה (Phytatrays)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1552</td><td></td></tr><tr><td>מצע בסיסי של מוראשיגה וסקווג (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>תמיסת מקור 10 M</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Eclipse 90i</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלולאז R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041</td><td>תמיסת מקור 1 M</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;מרקפטו-&amp;#8211;אתנול</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2536</td><td> מלאי 1 M</td></tr><tr><td>מנער אורביטלי</td><td>מכשירי Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;מסנן תאים m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות 15 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>20170-38</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>מערכת WT-Ovation Pico להגברת RNA</td><td>NuGEN</td><td>3300_12</td><td></td></tr><tr><td>מודול ביוטין ל-cDNA מסוג FL-Ovation V2</td><td>NuGEN</td><td>4200_12</td><td></td></tr></tbody></table>

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של protoplasts הצמח

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

ברזולוציה גבוהה, סוג ספציפי תא ניתוח של ביטוי גנים משפר באופן משמעותי את ההבנה של תקנה התפתחותית ולתגובות לגירויים סביבתיים באורגניזם כלשהו תאיים. ההכלאה ב באתרו גן להדמיה עיתונאי יכול במידה מוגבלת לשמש למטרה זו אבל ברזולוציה גבוהה כמותי RT-PCR או תפוקה גבוהה transcriptome רחב ניתוח הבידוד של RNA מתוך סוגי תאים מסוים הנדרש. נייד ניתוק של רקמת להביע סמן חלבון פלואורסצנטי בסוג תאים ספציפיים ומיון הבאים פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) מאפשרת לאסוף כמות מספקת של חומר להפקת RNA, cDNA ניתוח סינתזה / הגברה microarray. סט נרחב של סוג ספציפי שורות תאים כתב ניאון זמין לקהילה מחקר הצמח. במקרה זה, שתי שורות סמן השורש thaliana ארבידופסיס משמשים: P SCR: GFP (endodermis מרכז שקט) ו-P WOX5: GFP (מרכז שקט). מספר רב (אלפים) של השתילים גדלים hydroponically או על צלחות אגר וקצרו להשיג חומר שורש מספיק לניתוח נוסף. נייד ניתוק של חומר צמחי מושגת על ידי עיכול אנזימטי של התא הקיר. הליך זה עושה שימוש plasmolysis osmolarity-Induced גבוה cellulases זמינים מסחרית, pectinases ו hemicellulases לשחרר protoplasts לתוך פתרון. FACS-GFP חיובי תאים עושה שימוש להדמיה של ירוק לעומת ספקטרום פליטה אדום של protoplasts נרגש לייזר 488 ננומטר. GFP חיובי protoplasts ניתן להבחין ביחס מוגברת שלהם ירוק פליטה אדום. Protoplasts ממוינות בדרך כלל ישירות לתוך חוצץ מיצוי RNA ומאוחסנים לעיבוד נוסף במועד מאוחר יותר. טכניקה זו מתגלה להיות פשוטה מבחינה מעשית. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן להשתמש בו ללא קושי לבודד בכמות מספקת של תאים עבור ניתוח transcriptome, אפילו סוגי תאים נדירים מאוד (למשל תאים מרכז שקט). לבסוף, תוכנית ההתקנה של צמיחה עבור שתילים ארבידופסיס הוא הוכיח המאפשרת טיפול לא מסובך הצמחים לפני מיון התא (לדוגמא עבור סוג ספציפי של התא ניתוח של תגובות דחק ביוטי או אביוטי). משלים פוטנציאל לשימושים FACS של protoplasts צמח הם דנו.

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt; השתילים לפני מיון התא.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

ניתוח ברזולוציה גבוהה וספציפי לסוג התא של ביטוי גנים משפר במידה ניכרת את ההבנה של הבקרה ההתפתחותית ותגובות לסביבה...

הליך זה מתבסס על צמחים המבטאים GFP בסוגי תאים ספציפיים, אותם ניתן לבודד משאר תאי הצמח באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה או FACS. דוגמה זו משתמשת בשני קווי סמן המבטאים ביטוי בסוגי תאים ספציפיים של *Arabidopsis thaliana*. נבטי שורש גודלים במגשי phyto או בצלחות אגר.שורשיהם נאספים ומטופלים באנזימים לעיכול דופן התא. לאחר שעה, התמיסה מסוננת כדי להסיר שיירי תאים גדולים. לאחר מכן התמיסה עוברת סנטריפוגציה והנוזל העליון מוסר.פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP מופרדים לאחר מכן באמצעות fax. החומר הממוין יכול לשמש לאנליזה ספציפית לסוג תא, כגון פרופילים שגורתיים ברחב הגנום. שלום, אני Basian Barman מהמעבדה של Ken Birnbaum במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ניו יורק.היום נדגים לכם פרוצדורה למיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של פרוטופלסטים מצמחים. בדוגמה זו, נמיין שני סוגי תאים ספציפיים בשורש של Arabidopsis. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פרופילים שעתוקיים ספציפיים לסוג התא.אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו נבטים מסוג בר (wild type) וכן נבטים בעלי ביטוי של GFP ספציפי לסוג תא. הקידומת (promoter) של scarecrow המניעה את ה-GFP מסמנת את האנדודרמיס של השורש ואת המרכז השקט (quiescent center) בקבוצה אחת של נבטים.ובקבוצה אחרת, מרכז השקיעה של השורש מסומן על ידי הקידום של walk5 המפעיל GFP. השתילים גודלים באופן הידרופוני במגשאי FIA על גבי מסנן ניילון, המאפשר לשורשים לגדול דרכו אל תוך מצע הגידול. לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי רשת ניילון ובצלחונות אגר 1% הממוקמים בצורה אנכית.בנוסף לסיוע בקצירת השורשים, המסננים מאפשרים להעביר את השתילים באופן המוני לתבניות פיטו (phyto trays) חדשות או לצלחות אגר, שבהן ניתן להוסיף להם זרז רצוי. ניתן לעשות זאת כדי לחקור תגובות שעתוק ספציפיות לסוג תא למזינונים, הורמונים או טיפולי עקה. בדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לוודא שהסמן הפלואורסצנטי מובע כמצופה.יש לוודא כי תבנית הביטוי של הסמן עקבית תחת תנאי הטיפול המיושמים, שכן היא עלולה להשתנות כתוצאה מהטיפול. המשיכו לקציר ולהכנת פרוטופלסטים. התחילו בהכנת תמיסת הפרוטופלסטים.ערבבו במים דמינרליים cellulase בריכוז 1.25% weight per volume, maser zyme בריכוז 0.3% weight per volume, D mannitol בריכוז 0.4 molar, MES בריכוז 20 millimolar, ו-KCL בריכוז 20 millimolar, וכווןנו את ה-pH ל-5.7 באמצעות tris HCL בריכוז one molar ב-pH 7.5. תמיסה זו תהיה עכורה מעט. לאחר מכן, חממו את התמיסה ל-55 degrees Celsius למשך 10 דקות.התמיסה תהפוך שקופה; יש להניח לה להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף BSA בריכוז 0.1% משקל לנפח, calcium chloride בריכוז 10 millimolar, ו-beta me capto ethanol בריכוז five millimolar. קצרו נבטים בני שבוע מתוך phyto tray אחד. במקרה של קו ה-scarecrow GFP, או שמונה צלחות של נבטי 5G FP בני ארבעה ימים. גרדו את השורשים מרשת הניילון באמצעות סכין מנתח, ולאחר מכן העבירו אותם למכל המכיל תמיסת protoplasts.השתמש בכ-10 milliliters של תמיסת פרוטופלסטים לכל 1500 שתילים. נער את הבקבוקים בעדינות ב-75 RPM בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. זמן אינקובציה ממושך יותר עשוי להגדיל את תנובת הפרוטופלסטים, אך יעצים גם את ההשפעה של הפרוטופלסטים עצמם על ביטוי הגנים.כעת, לאחר ששחררו את הפרוטופלסטים, השתמשו במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן את התמיסה וחלקו את תרחיף הפרוטופלסטים בין מבחנות קוניות של 15 מל. חשוב להפיק תרחיף פרוטופלסטים נקי ללא שאריות רבות כדי למנוע סתימה של המכשירים ולמזער את הזמן הדרוש למיון התאים. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה בעלת סלים נדנדים (swing bucket centrifuge) ב-500 G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.שימו לב כי מהירות הצנטריפוגציה תלויה בהרכבו של חלק הצמח ממנו מופקים הפרוטופלסטים ובכמות פסולת התאים הנוצרת במהלך הטיפול האנזימטי. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את רוב הנוזל העליון ושחזרו בעדינות את המשקע המכיל את הפרוטופלסטים בנפח הקטן של תמיסת הפרוטופלסטים שנותרה. לבסוף, ספרו את הפרוטופלסטים באמצעות המוציטומטר וקבעו את צפיפותם כדי לחשב את התנובה ולהחליט על פרמטרי ההרצה של המיון בתאי זרימה (FACS).לאחר הספירה, בחנו את הפרוטופלסטים. בדקו את שלמותם, את רמת ביטוי ה-GFP ואת כמות שיירי התאים המזהמים. לאחר מכן, המשיכו ל-fax.אם לא ממשיכים ישירות למיון. ניתן לשטוף, לתלה שוב ולשמור את הפרוטופלסטים בתמיסת דגירה, כגון תמיסת proto plating ללא האנזימים המוספים או תמיסת W five. הפעילו את מיין התאים ואת מחשב תחנת העבודה.כאן אנו משתמשים במכשיר fria המיוצר על ידי Becton Dixon and Company. השתמש ב-XPBS אחד כנוזל מעטפת (sheath fluid) והפעל את הליך אתחול הזרימה. התקן נחיר ברוחב 100 µm והגדר לחץ מעטפת של 20 PSI.הקימו זרימה יציבה וכיילו את השהיית הטיפה (drop delay). שימו לב שהכיול אינו מוצג בהליך זה. ניתן למיין בהצלחה תרחיפי פרוטופלסטים בצפיפות גבוהה של עד 10 מיליון תאים למ"ל.על מנת למנוע שקיעה של הפרוטופלסטים, השתמש באפשרות ערבול הדגימה במכשיר ה-facts. אם סתימה של ה-facts מהווה בעיה, קיימים שלושה שלבי פתרון תקלות אפשריים. ראשית, בצע שטיפה אחורית (back flush) של קו הדגימה.שנית, דללו את תרחיף הפרוטופלסטים כדי להפחית את הצפיפות. שלישית, נקו את תמיסת הפרוטופלסטים על ידי חזרה על שלב הסינון לאחר סרכוז ותלייה מחדש של התרחיף. ארבעה פרמטרים בלבד משמשים להבחנה בין פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP לבין פרוטופלסטים שליליים ל-GFP ושאריות תאים לאחר עירור באמצעות לייזר של 488 nanometer: פיזור קדימה (forward scatter) משמש כאינדיקטור לגודל החלקיק, ופיזור צידי (side scatter) כאינדיקטור לגרנולריות של החלקיק.פליטה ב-530 nanometers כמדד לפלואורסצנציה ירוקה ופליטה ב-610 nanometers כמדד לאוטופלואורסצנציה של הספקטרום האדום. התחילו בהגדרת תרשים פיזור (dot plot) של פיזור קדמי (forward scatter) לעומת פיזור צדי (side scatter). הגדירו את המתח כך שהאירועים הנמדדים יהיו ממורכזים בתרשים.ניתן להבחין בין PROTOPLASTS חיוביים ל-GFP לבין אירועים עם פלואורסצנציה עצמית על ידי יחס גבוה יותר של פליטה ירוקה לעומת אדומה. הגדירו dot plot של פלואורסצנציה ירוקה לעומת פלואורסצנציה עצמית בספקטרום האדום. הגדירו את ערכי המתח כך שהאירועים הנמדדים יניבו אוכלוסייה אלכסונית אחת בגרף.בבחינה של תרחיף פרוטופלסטים מסוג בר (wild type), פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP אמורים להפיק אוכלוסייה ברורה של אירועים פלורסצנטיים ירוקים שאינם נראים בדגימות מסוג בר. הגדירו הגבלות פיצוי (compensation constraints) כדי להתאים את החפיפה הספקטרלית בין פלורסצנציה ירוקה לאוטופלורסצנציה של הספקטרום האדום. בשימוש בתרחיף פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP, הגדרות נכונות של הגבלות הפיצוי יאפשרו הפרדה טובה יותר של הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP מהפרוטופלסטים שאינם חיוביים ל-GFP ומשאריות (debris); הגדירו שער (gate) לזיהוי אירועים חיוביים ל-GFP.מומלץ להכין בכל פעם שאתם מכינים ניסוי מיון גם פרוטופלסטים שאינם GFP, כדי לסייע בהגדרת גבולות השער (gate boundaries). לבסוף, הגדירו סף חיתוך של פיזור קדימה (forward scatter) כדי להוציא שברים קטנים מהניתוח. ויזואליזציה של אירועים חיוביים ל-GFP בגרף של פיזור קדימה לעומת פיזור צדי תסייע בקביעת המקום שבו יש להגדיר את הסף.ניתן להשתמש שוב בפרמטרים שהוגדרו בהרצת העובדות הראשונית זו עבור מינויים עתידיים. לשימוש יומיומי ב-facts יידרשו התאמות קלות. לצורך מיצוי RNA, הכינו מבחנות איסוף המכילות בופר למיצוי RNA; ככלל, השתמשו בנפח מיון של עד 100 µL עבור 350 µL של בופר למיצוי.20,000 אירועי מיון מניבים נפח מיון כולל של כ-100 microliters. כעת, כאשר פרמטרי ה-fax ומצבי ההפעלה נקבעו ומבחנות האיסוף מוכנות, התחל במיון הפרוטופלסטים עד להשלמת המיון. ערבב את מבחנות איסוף הדגימות כיוון שתיתלהי תרחיף תאים עלול להצטבר בחלק העליון; ניתן להשתמש ב-500 אירועי מיון בודדים לצורך אנליזת microarray לאחר מיצוי RNA והגברה של CD NA.כאן אנו משתמשים בערכה למיקרו-מיצוי RNEZ, במערכת להגברת RNA מסוג WT ovation PICO ובמודול biotin CD NA fl ovation גרסה 2. אלו הן תוצאות FACS טיפוסיות עבור פרוטופלסטים שהופקו מנבטים של non GFP Scarecrow, GFP ו-W 5G FP. בכל תרשים פיזור מוצגים 100,000 אירועים של פלואורסצנציה ירוקה בציר ה-x לעומת פלואורסצנציה אדומה. בציר ה-y, האירועים הנופלים בתוך שער המיון של ה-GFP מודגשים בירוק.זהו סיכום של תנובת הפרוטופלסטים הטיפוסית מנבטים המבטאים או את scarecrow GFP המסמן את האנדודרמיס של השורש ואת המרכז השקט, או את walks 5G FP המסמן את המרכז השקט של השורש. ישנם פחות תאים במרכז השקט של השורש בהשוואה לאנדודרמיס של השורש. לכן, למרות התחלה עם מספר רב יותר של פרוטופלסטים, תנובת התאים המבטאים GFP קטנה יותר במיון של walks 5G FP בהשוואה למיון של scarecrow GFP. מוצגות כאן תוצאות טיפוסיות של מיצוי RNA מדגימות שנבצעו בשלוש חזרות.כל דגימה תואמת ל-RNA שהופק מ-10,000 אירועים. ה-RNA המופק נסרק ב-bioanalyzer המציג את הפיקים הריבוסומליים עבור דגימות scarecrow GFP למעלה ודגימות walks 5G FP למטה. ניתן להשתמש ב-RNA המופק בהמשך לצורך ניתוח microarray. תרשים פיזור זה של רמות ביטוי log two מדגים את הדמיון בין שתי חזרות.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של פרוטופלסטים מצמחים לצורך אנליזה ספציפית לסוג התא. טכניקה זו ישימה עבור רקמות ומיני צמחים רבים ושונים. תנובות גבוהות עם תכולת פסולת נמוכה ופרוטופלסטים בריאים יניבו תוצאות טובות יותר בשלבים הבאים של אנליזות תעתוק ואנליזות אחרות.זכרו גם כי חשוב לשמור על תנאי גידול זהים עבור החומר הצמחי לצורך השוואה בין הדגימות הממוינות. זהו כל הסיפור. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

fluorescence-activated-cell-sorting-of-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

מתוארים פרוטוקולים לחקירת הדינמיקה של סטרומולים של כלורופלסט, הצינורות המלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של כלורופלסטים.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בתפוקה גבוהה להעברה זמנית של מיליוני פרוטופלסטים של תירס לבדיקת ספריות גדולות של פלסמידים בתאי מזופיל תירס.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

למד שיטה לבידוד סוגי תאים ספציפיים מ-Arabidopsis thaliana באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי (FACS). השיטה משתמשת בקווי סמן טרנסגניים המביעים חלבון GFP לזיהוי מדויק של תאים מטרה.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

גלה סרטונים נוספים