סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור
4 בינואר 2010
סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.
נראה כי חלק מהטרמינלים הפרסינפטיים במערכת העצבים המרכזית אינם תפקודיים או הם "שקטים". כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי טרמינלים פרסינפטיים שקטים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות טיפולים ומניפולציות החשודים כגורמים להשתקה או להשכמה של טרמינלים.
הפרוטוקול משלב סימון של שלפוחיות סינפטיות באמצעות צבע חיוני במהלך דפולריזציה נוירונלית, יחד עם סימון עוקב של תאים מקובעים באמצעות נוגדן המסמן את כל הטרמינלים הפרה-סינפטיים, הן השקטים והן הפעילים. סינפסות המסומנות הן בצבע והן בנוגדן הן פעילות. סינפסות המסומנות בנוגדן בלבד הן שקטות.
שלום, אני אמאנדה טיילור מהמעבדה של ד"ר סטיב מיניק במחלקה לפסיכיאטריה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. אני שאהין, גם אני ממעבדת מניק. היום נרצה להראות לכם פרוצדורה להדמיה של טרמינלים פרה-סינפטיים שקטים באמצעות נוירונים של היפוקמפוס בתרבית.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד פעילות חשמלית ומסלולי איתות בודדים אחרים מווסתים את שחרור הנוירוטרנסמיטורים. אז בואו נתחיל. תחת מ indicated laminar flow hood סטרילי, השתמשו ב-HIPA מחתולים של חולדות או עכברים בני 0 עד 3 ימים לאחר הלידה כדי להכין תרביות תאים מפוצלים.
בהתאם לפרוטוקול שפרסמנו, התרביות שלנו הן תרביות גליאליות מעורבות המופקות מאותה דיסקציה; יש לזרוע את התאים בצלחות סטריליות של 35 מילימטר, שכל אחת מהן מכילה כיסוי זכוכית (cover slip) מספר 0 שצופה ב-5 mg/mL של קולגן. יש לזרוע את הנוירונים בצפיפות מקורבת של 500 תאים לסמ"ר.
12 גורי חולדה יניבו בדרך כלל 30 צלחות של 35 מילימטר. יש להניח לתרביות לגדול באינקובטור תרביות למשך 10 עד 14 ימים. לצורך פיתוח והבשלת סינפסים, יש להוסיף את ה-anti-mitotic a C כדי לעצור את צמיחת הגליות ביום הרביעי למשך התרבית (day in vitro four).
כמו כן, ביום החמישי לתרבית (in vitro), בצעו החלפה חלקית של המצע למצע neuro basal בתוספת B 27 כדי לשפר את הישרדות הנוירונים במהלך תקופת הבשלה זו. החילו טיפולים המשנים את מספר הסינפסות השקטות באופן פרה-סינפטי. מצאנו שדרך נוחה להשקיט אחוז גבוה של סינפסות גלוטמט היא טיפול של ארבע שעות ב-30 millimolar אשלגן.
כאשר התרביות בשלות, לנוירונים צריכה להיות צפיפות נמוכה יחסית עם שלוחות עצביות נרחבות ומופרדות היטב. הוצא את התרביות מהאינקובטור והעבר אותן לשולחן העבודה. החלף את מצע התרבית בתמיסת סלין עם בופר המכילה 45 millimolar potassium chloride ו-10 micromolar FM 1 43 FX die.
תמיסה זו צריכה להכיל גם NBQX ו-APV כדי למנוע סיגנלינג חוזר. חשוב לשמור את תמיסת המלאי של FM 1 43 FX ואת הניסויים בחשכה כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). לכן, כסו את צלחות התרבית בנייר אלומיניום בכל שלבי האינקובציה הבאים.
דגרו במשך שתי דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. הסירו את תמיסת הצבע ושטפו למשך שלוש עד חמש שניות בלבד ב-heaps buffered saline עם 500 micromolar adversive.Seven. להסרת קישור לא ספציפי של הצבע, התזמון בשלב זה הוא קריטי.
חשיפה ממושכת ל-adv adverse F seven תסיר את כל סימון ה-FM 43 FX. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים ב-heaps buffered saline ללא adv adverse Seven, בחמישה מרווחי זמן של שתי דקות, תחת מנדף כימי.
קבע את התרביות ב-4%paraldehyde ו-0.2%glutaraldehyde ב-PBS למשך 10 דקות. שטוף את התאים קצרות ב-PBS. כעת ניתן להוציא את התאים ממטחט השאיבה.
הוסיפו תמיסת חסימה המכילה 4%normal goat serum ו-0.04%tritton X כדי להפחית את הרקע ולהגדיל את חדירות התאים לצביעה אימונוהיסטוכימית. הדגרירו למשך 15 דקות. צבעו את התאים עם נוגדן vlu T one המדולל ביחס של 1:2000 בתמיסת החסימה.
דגרו את התרביות בנוכחות הנוגדן תוך כדי נדנוד עדין למשך שלוש שעות. שטפו את התאים ארבע פעמים עם PBS. דגרו את התאים עם Alexa.
נוגדן שני אנטי-חזי חול (anti Guinea pig) מסומן ב-6 47, מדולל ביחס של 1:500 בתמיסת החסימה. יש להחזיק את התרביות בנוגדן השני תוך כדי נדנוד עדין למשך 30 דקות. שטוף את התאים ארבע פעמים נוספות ב-PBS.
הנח טיפה קטנה של תגית רצפה על תבנית זכוכית נקייה באמצעות פינצטה. הרם זכוכית כיסוי והנח אותה בעדינות על הטיפה, כך שתאי תגית הרצפה יהיו פונים לתבנית. השאר את התבנית לייבוש למשך הלילה.
הכינו עדשה אובייקטיבית 60 x oil במיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקלי. הניחו את הפסחית על הבמה כך שזכוכית המכסה פונה לעדשה. אתרו שדה של נוריטים שאינו צפוף מדי ושנמצא הרחק מהסומה, שעלולה לשמור על שאריות צבע.
בצעו זום לגודל שדה של 51 על 51 מיקרון. באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, רכשו מחסנית ZS המכסה עומק של 7.8 מיקרון על פני 27 שלבים של 0.3 מיקרון לכל שלב.
בצעו סריקה ראשונה עבור הנוגדן VLU T one כדי לזהות את כל הסינפסות הגלוטמטרגיות בשדה. לאחר מכן, סרקו שוב עבור פלואורסצנציית FM 1 43 FX כדי לנתח את התמונות לאחר הרכישה. השתמשו בתוכנת ניתוח כדי להמיר את ה-Z tack לתמונת מישור בודד מורכבת, המבוססת על קריאת העוצמה המקסימלית מכל מישור עבור כל פיקסל, תוך הגדרת סף.
כדי להפחית את הרקע, זהו את קצות ה-VG glu T one ללא התייחסות לצביעת ה-FM 1 43 effects. סמנו נקודות אלו כאזורי עניין. בדרך כלל אנו בוחרים 10 PUNTA לכל שדה.
חזרו על תהליכי הסף (thresholding) ובחירת הנקודות (puncta) בתמונת ההשפעות של FM 1 43 והסמירו את התמונות כדי לזהות סינפסות שקטות. ניתן להשתמש בקריטריון פיקסלים מוחלט, או בקריטריון אחוז פיקסלים, כדי להבדיל בין סינפסות פעילות חיוביות ל-FM 1 43 לבין סינפסות לא פעילות שליליות ל-FM 1 43. בתרביות שלנו, מצאנו ש-70 עד 80% מסינפסות הגלוטמט שהוגדרו על ידי צביעת V glut one מראות צביעת FM 1 43 ניתנת לגילוי בתמונות מוסמירות של פלואורסצנציית FM 1 43 ירוקה וצביעת V glut one אדומה.
דבר זה ניכר כשפע של נקודות צהובות (puncta) של סינפסות עם סמנים הממוקמים יחד (co-localized). אלו מסומנים על ידי החיצים. כ-20 עד 30% מהנקודות החיוביות ל-Vglut1 באדום לא יראו פלואורסצנציית FM 1-43 בירוק מעל קו הבסיס.
אלו הם הטרמינלים הפרה-סינפטיים הבלתי פעילים, ודוגמה אחת מסומנת על ידי ראש החץ. תצפית תגלה גם אוכלוסייה שלישית של סינפסות. אלו חיוביות לפלואורסצנציה ירוקה של FM 1 43, אך נטולות צביעת B glut one אדומה.
אלו הן סינפסות GABAergic פעילות, ודוגמה אחת מסומנת בכוכבית. אלו מוחרגות מרוב הניתוחים שלנו, אך ניתן לחקור אותן במפורש באמצעות נוגדן למעביר GABA וסיקולרי. במקום הנוגדן ל-VLU T one, הראינו לכם כעת כיצד להדמיות של סינפסות שקטות פרה-סינפטית באמצעות FM 1 43 וצביעת אימונו של VLU one.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ש-FM 1 43 FX רגיש הן לזמן השהייה בתוך ה-adver sub seven wash והן לריכוז של ה-X 100 המטפל הכלול בתמיסת החסימה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לזיהוי טרמינלים פרה-סינפטיים שקטים במערכת העצבים המרכזית. באמצעות שילוב של סימון בצבע חי (vital dye) עם צביעה אימונוהיסטוכימית, חוקרים יכולים להבחין בין סינפסות פעילות לשקטות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- תפקוד סינפטי
רקע
- חלק מהטרמינלים הפרה-סינפטיים אינם תפקודיים או הם שקטים.
- הבנת הפעילות הסינפטית חיונית למחקר במדעי המוח.
- זיהוי טרמינלים שקטים יכול לסייע בחקר טיפולים שונים.
- ויזואליזציה של הפעילות הסינפטית יכולה לספק תובנות על התקשורת העצבית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לזיהוי של טרמינלים פסינפטיים שקטים.
- בדיקת ההשפעות של טיפולים שונים על פעילות סינפטית.
- העמקת ההבנה של דינמיקה סינפטית ברשתות נוירונליות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון של שלפוחיות סינפטיות באמצעות צבע חי במהלך דפולריזציה נוירונלית.
- צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדן המסמן את כל הסיומות הפרה-סינפטיות.
- טכניקות של סימון משולב להבחנה בין סינפסות פעילות לסינפסות שקטות.
- שימוש בצבע FM1-43 להדמיה של סינפסות פעילות.
תוצאות עיקריות
- ניתן להדמיות סינפסות פעילות באמצעות הצבע FM1-43.
- צביעה אימונוהיסטוכימית חושפת את כל הטרמינלים הפרה-סינפטיים, כולל אלו השקטים.
- הפרוטוקול מבחין ביעילות בין סינפסות פעילות לשקטות.
- הממצאים תורמים להבנת הפלסטיות והתפקוד הסינפטי.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מהווה כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- זיהוי טרמינלים שקטים יכול להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות סינפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית בכירה
זיהוי סינפסים שקטים פרה-סינפטיים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית בתיקוף מטרות (target validation) על ידי חשיפת הגנויה פונקציונלית ברשתות נוירונליות. שיטה זו תומכת בביטחון חיזוי במסכי בדיקה על ידי הבחנה בין אתרי שחרור גלוטמט פעילים לבלתי פעילים. היא מסייעת במיון תיקי פיתוח על ידי קישור מנגנוני פלסטיקות סינפטית למערכות רלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי כימות מצבים של השתקה או הפעלה פרה-סינפטית.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של כשירות שחרור של ואסיקולות (שלפוחיות).
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ביעד על ידי מתאם בין שביב cAMP או השתקה חשמלית לבין תוצאות תפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכת תרכובות באמצעות קולוקליזציה (co-localization) של אותות FM1-43 FX ו-vGluT-1.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה סטנדרטית של אחוז הסינפסות הפעילות באמצעות ניתוח תמונה מבוסס סף.
- שחזוריות: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, צביעה ודימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין פלסטיות פרה-סינפטית למסלולי למידה וזיכרון תלויי היפוקמפוס.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין גילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות ניטור הסתגלות סינפטית לטיפולים.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי כימות אוכלוסיות של סינפסות שקטות בתנאי בסיס ובתנאים מוודלים.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת קריאה תפקודית של פעילות מסופי פרה-סינפטיים לפני זיהוי מובילים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של טיפולים המשנים השתקה פרה-סינפטית באמצעות דפולריזציה של אשלחן או הפעלת cAMP.
- סריקה: מספק כימות הדיר ושחזור של יכולת שחרור גלוטמט בתרביות מופרדות של היפוקמפוס, המוכן לביצוע מדידה.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים (למשל, % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) המאפשרות השוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של הסתגלות סינפטית הרלוונטית למנגנונים של הפרעות נוירו-פסיכיאטריות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הניתנת לשימוש חוזר לסריקת מודולטורים של תפקוד פרה-סינפטי במודלים נוירונליים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הערכה ישירה של ההסתברות לשחרור שלפוחיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות דימוג תאים מקובעים ופרוטוקול צביעה משותפת.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) משופרת על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהשפעות של תרופות סינפטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד עדיפויות מותאם סיכון המבוסס על נתוני מודולציה סינפטית תפקודית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות נוירונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונות פלואורסצנטיות.
- דורש ציוד הכולל מיקרוסקופ סריקה בלייזר עם עדשת שמן 60x ורכישת Z-stack.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון הצביעה, ריכוז הצבע ועקביות השטיפה.
- כולל שיקולי התאמה עבור מערכות נוירונליות שאינן היפוקמפליות או עבור טרנספורטרים חלופיים של שלפוחיות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות FM1-43 FX למשך שטיפת חומצה אסקורבית ולהרכב תמיסת החסימה.
