סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

חלק מהמסופים הפרה-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית נראים לא מתפקדים או שקטים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מסופים פרה-סינפטיים שקטים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לזיהוי טיפולים ומניפולציות החשודים כהשתקה או התעוררות של מסופים.

הפרוטוקול משלב תיוג צבע חיוני של שלפוחיות סינפטיות במהלך דפולריזציה עצבית עם תיוג לאחר מכן של תאים קבועים עם נוגדן המסמן את כל הטרמינלים הפרה-סינפטיים, שקטים ופעילים כאחד. סינפסיס. Co המסומן בצבע ונוגדנים פעילים. סינפסיס המסומן רק על ידי נוגדנים שקט.

היי, אני אמנדה טיילור מהמעבדה של ד"ר סטיב מיניק במחלקה לפסיכיאטריה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. אני שאהין גם ממעבדת המאניה. היום ברצוננו להראות את ההליך שלכם להמחשת מסופים פרה-סינפטיים שקטים באמצעות תאי עצב בהיפוקמפוס מתורבתים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד פעילות חשמלית ומסלולי הנוטרנסמיטורים הבודדים האחרים מווסתים את שחרור המוליכים העצביים. אז בואו נתחיל. במכסה זרימה למינרי סטרילי, השתמש ב-HIPA לא יכול לקנות מיום האפס שלאחר הלידה לשלושה חולדות או עכברים להכנת תרביות תאים מנותקים.

על פי הפרוטוקול שפורסם שלנו, התרביות שלנו מעורבות תרביות גליה שמקורן באותם תאי דיסקציה צריכות להיות מצופות בכלים סטריליים של 35 מילימטר. כל אחד מהם הכיל פתק כיסוי מספר אפס שצופה בחמישה מיליגרם למיליליטר של צלחת קולגן. הנוירונים בצפיפות משוערת של 500 תאים לסנטימטר בריבוע.

12 גורי חולדות יניבו בדרך כלל 30 מנות של 35 מילימטר. אפשר לתרבויות לצמוח בחממת תרבות למשך 10 עד 14 יום. להתפתחות והתבגרות סינפטית, הוסף את האנטי-מיטוטיקה A C כדי לעצור את צמיחת הגליה ביום במבחנה ארבע.

כמו כן, ביום מבחנה חמש, בצע החלפה של חצי מדיום עם מדיום נוירו-בסיסי בתוספת תוסף B 27 כדי לשפר את ההישרדות העצבית במהלך תקופת התבגרות זו. הציגו טיפולים המשנים את מספר הסינפסות השקטות מבחינה פרה-סינפטית. אנו מוצאים שאחת הדרכים הנוחות להשתיק אחוז גדול של סינפסות גלוטמט היא טיפול של ארבע שעות באשלגן 30 מילימולרי.

כאשר התרביות בשלות, נוירונים צריכים להיות בעלי צפיפות נמוכה יחסית עם תהליכים נוירוטיים מופרדים היטב ונרחבים. מוציאים את התרבויות מהחממה ומביאים אותן לספסל. החלף את מדיום התרבות בתמיסת מלח חוצצת המכילה 45 מילי-מולרי אשלגן כלורי ו-10 מיקרו-מולרי FM 1 43 FX.

פתרון זה צריך להכיל גם NBQX ו-A PV כדי למנוע איתות חוזר. חשוב שהפתרון והניסויים של FM 1 43 FX יישמרו בחושך כדי למנוע פוטו-הלבנה. אז מכסים את כלי התרבות בנייר כסף לכל שלבי הדגירה הבאים.

דוגרים בדיוק שתי דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת הצבע ושטוף במשך שלוש עד חמש שניות בלבד בערימות של מי מלח עם 500 מיקרו-מולארי יריב. שבע. הסרת תזמון צבע לא ספציפי בשלב זה הוא קריטי.

מכיוון שחשיפה ממושכת ל-F 7 שלילי תסיר את כל התיוג FM 43 FX. לאחר מכן שטפו את התאים וערימות מי מלח חוצצים ללא השפעה שלילית. שבע לחמש מרווחים של שתי דקות במכסה אדים כימי.

תקן את התרביות ב-4% פרלדהיד ו-0.2% גלוטרלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות. שוטפים את התאים בקצרה עם PBS. כעת ניתן להוציא את התאים ממכסה האדים.

הוסף תמיסת חסימה המכילה 4% סרום עיזים רגיל ו-0.04% טריטון X כדי להפחית את הרקע ולחלחל את התאים לצביעה חיסונית. דגירה למשך 15 דקות. צבעו את התאים ב-vlu T נוגדן אחד מדולל ל-1 עד 2000 בתמיסת חסימה.

דגרו את התרביות בנוגדנים עם נדנוד עדין למשך שלוש שעות. שוטפים את התאים ארבע פעמים עם PBS. דגרו על התאים עם Alexa.

6 47 נוגדן מצומד נגד שרקנים מדולל ל-1 עד 500 בתמיסת חסימה. שמור על התרביות בנוגדנים המשניים עם נדנוד עדין למשך 30 דקות. שטפו את התאים ארבע פעמים נוספות עם PBS.

הניחו טיפה קטנה של כמות הרצפה על מגלשת זכוכית נקייה באמצעות מלקחיים. הרם פתק כיסוי והורד אותו בעדינות על טיפת תאי כמות הרצפה הפונים לשקופית. הניחו לשקופית להתייבש למשך הלילה.

הכן אובייקט שמן פי 60 במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. הנח שקופית על הבמה כך שהחלקת הכיסוי פונה למטרה. מצא שדה של נויריטים שאינו צפוף מדי ומרוחק מהסומה שיכול לשמור על שאריות צבע.

הגדל את התצוגה לגודל שדה של 51 על 51 מיקרון. שימוש בתוכנה לרכישת תמונות. רכוש מחסנית ZS המכסה עומק של 7.8 מיקרון על פני 27 שלבים של 0.3 מיקרון עבור כל שלב.

סרוק תחילה את נוגדן VLU T one כדי לזהות את כל הסינפסות הגלוטמטרגיות בשדה. לאחר מכן סרוק מחדש את הקרינה FM 1 43 FX כדי לנתח תמונות לאחר הרכישה. השתמש בתוכנת ניתוח כדי להמיר את ה-Z לתמונת מישור יחיד מורכבת בהתבסס על קריאת העוצמה המקסימלית מכל מישור בכל סף שנקבע בפיקסלים.

כדי להפחית את הרקע, זהה מסופי VG glu T one ללא התייחסות לכתם האפקטים FM 1 43. וסמן את הפונקטה הזאת כאזורי עניין. בדרך כלל אנו בוחרים 10 פונטה לכל שדה.

חזור על הסף ובחירת הפיסוק בתמונת האפקטים של FM 1 43 והניח את התמונות כדי לזהות סינפסות שקטות. ניתן להשתמש בקריטריון פיקסלים מוחלט, או בקריטריון פיקסלים באחוזים כדי להבחין בין סינפסות שליליות FM 1 43 פעילות לבין FM 1 43 שליליות לא פעילות. בתרבויות שלנו, אנו מוצאים כי 70 עד 80% מסינפסות הגלוטמט המוגדרות על ידי צביעת V glut One מציגות צביעה FM 1 43 ניתנת לזיהוי בתמונות שכבות של פלואורסצנטי FM 1 43 ירוק וצביעה אחת של V אדום.

זה ניכר כשפע של סינפסות פונקטה צהובות עם סמנים מקומיים משותפים. אלה מסומנים על ידי החצים. כ-20 עד 30% מכמות ה-V האדומה פונקטה חיובית אחת לא תקבל פלואורסצנטיות ירוקה של FM 1 43 מעל קו הבסיס.

אלה הם המסופים הפרה-סינפטיים הלא פעילים ודוגמה מסומנת על ידי ראש החץ. אוכלוסייה שלישית של סינפסות תיצפה גם כן. אלה חיוביים לפלואורסצנטיות FM 1 43 ירוקה, אך נטולי צביעה אדומה של גלוטן B.

אלו הן סינפסות GABAergic פעילות ודוגמה מסומנת על ידי הכוכבית. אלה אינם נכללים ברוב הניתוחים שלנו, אך ניתן לחקור אותם במפורש באמצעות נוגדן טרנספורטר GABA שלפוחית. במקום נוגדן VLU T אחד, זה עתה הראינו לך כיצד לדמיין סינפסות שקטות פרה-סינפטית באמצעות צביעה חיסונית FM 1 43 ו-VLU one.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי FM 1 43 FX רגיש הן לזמן בשטיפת האדוור תת שבע והן לריכוז הטיפול X 100 הכלול בתמיסת החסימה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.