Name: סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למדו פרוטוקול לזיהוי סינפסות שקטות פרה-סינפטיות במערכת העצבים המרכזית באמצעות צביעת צבע חי ואימונו-סטיינינג. שיטה זו מאפשרת להבחין בין סינפסות פעילות לשקטות ולחקור פלסטיות סינפטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DA018109 ו MH78823, ו-NIH Neuroscience Blueprint Core גרנט P30NS057105 כדי אוניברסיטת וושינגטון.

תרבות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרביות תאים ניתק של תאים בהיפוקמפוס חולדה או עכבר מיום הלידה 0-3 חיות 1. הנוירונים שלנו לדבוק monolayer astrocyte הבסיסית, אשר בתורו שומרת על שכבת קולגן להתפשט על coverslip 0 מספר עובי. פלייט הנוירונים בצפיפות של כ 500 תאים לסנטימטר מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תרבויות לגדול במשך 10-14 ימים כדי לאפשר פיתוח התבגרות הסינפטי ו. פנקו את התרבויות ביום במבחנה 4 עם AraC antimitotic לעצור צמיחה גליה נוספת. הזנת אותם יום במבחנה 5 עם חילופי בינוני וחצי עם Neurobasal בינוני פלוס תוסף B27 כדי לשפר את ההישרדות עצביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התקופה תרבות, להציג טיפולים שנועדו לשנות את מספר הסינפסות השתיק תפקודית. אנו מוצאים כי אחד דרך נוחה להשתיק אחוז גדול (~ 80%) של סינפסות הגלוטמט הוא טיפול של 4 שעות עם אשלגן 30 מ&quot;מ. Incubations ארוכים עם גירויים depolarizing חלש להשרות 2 השתקה דומה. גירוי של 4 שעות עם 50 מיקרומטר forskolin, activator של cyclases adenylyl, יכול לשמש כדי לעורר את האוכלוסייה של מסופי שקט בתחילת המחקר 3. </li></ol> לדמיין סינפסות שותק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריך צפיפות נמוכה יחסית עם מופרדים היטב תהליכים מדלקת עצבים ביום במבחנה 10-14 כדי לאפשר ויזואליזציה של המסופים הסינפטיים בדידה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של 5 מ&quot;מ FM1-43FX במים מזוקקים. המניה יש לשמור בחושך ב 4 ° C. כל הניסויים באמצעות FM1-43FX צריך גם להתבצע בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתגר התרבויות במשך 2 דקות עם אשלגן כלוריד 45 מ&quot;מ מלוחים פתרון HEPES שנאגרו המכיל נתרן 100 mM כלוריד, סידן כלוריד 2 מ&quot;מ, מגנזיום כלוריד 1 מ&quot;מ, 10 גלוקוז מ&quot;מ, ו - 10 מיקרומטר FM1-43FX. פתרון זה אמור גם להכיל 1 מיקרומטר NBQX ו -25 מיקרומטר D-APV לחסום קולטנים postsynaptic ולמנוע איתות חוזרת. אתגר זה יהיה תווית המסופים הסינפטיים המסוגלים exocytosis ו אנדוציטוזה. השעה אתגר וכוח נועדו לגרום לפחות סיבוב אחד של exocytosis של כל שלפוחית ​​זמין 4 הבריכה מיחזור. עם זאת, האתגר אינו מספיק כדי לגרום השתקה נוספת של מסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את התרבות במשך 3 עד 5 שניות בלבד, תוך שימוש באותו HEPES שנאגרו מלוחים ללא אשלגן כלורי, אבל עם 500 מיקרומטר Advasep-7 להסיר צבע ספציפי 5. ראוי לציין, כי העיתוי של הצעד הזה היא קריטית כיישום ממושכת של Advasep-7 תגרום לאובדן של תיוג FM1-43FX כל. לשטוף הבאה HEPES שנאגרו מלוחים ללא Advasep-7 2 במשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% ו 0.2% ב glutaraldehyde PBS, pH 7.4 למשך 10 דקות. לשטוף את התאים לאחר זמן קצר עם PBS, אז דגירה במשך 15 דקות בתמיסה המכילה חוסם 4% נסיוב עז נורמלי טריטון 0.04% X-100 ב PBS. שים לב FM1-43FX הוא גם רגיש מאוד לסכום של טריטון X-100 השתמשו כאן ב צעדים מאוחר יותר. ככלל, FM1-43FX תיוג הוא הטוב ביותר בהיעדר טריטון X-100, אך חומר ניקוי כלשהו יש צורך permeabilize תאים immunostaining הבאים. יש לנו נקבעים אמפירית כי 0.04% Triton X-100 הוא אופטימלי לבדיקה של סינפסות שקט presynaptically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן העיקרי vGluT-1 בחסימת פתרון בריכוז של 1:2500. דגירה התאים עם סיבוב עדין רועד / ב בדילול vGluT-1 נוגדנים במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הקפידו לכסות מנות התרבות שלך עם רדיד כדי למנוע הלבנת של צבע FM1-43FX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים PBS ואז דגירה התאים עם הנוגדנים נגד ניסיונות חזיר מצומדות כדי fluorophore עם מאפיינים ספקטרליים שונים FM1-43FX להבחין בשני כתמים. לצורך ניסוי שלנו, נשתמש אלקסה 555-מצומדות נגד ניסיונות נוגדן חזיר בשעה 1:500 בחסימת פתרון. דגירה התאים עם הנוגדנים המשני תוך רעד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים ארבע פעמים יותר PBS ואז הר להחליק לכסות על זכוכית שקופית באמצעות ירידה קטנה של Fluoromount-G. הקפד coverslip להתמצא כך התאים פני שקופיות. אפשר השקופיות לייבוש למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת אנחנו מוכנים לרכוש תמונות של סינפסות פעיל פעיל. הכן אובייקטיבית שמן x 60 עם צמצם 1.4 מספרית על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. המקום שקופיות על הבמה, על מנת להבטיח כי הצד coverslip פונה המטרה. לאחר התמקדות השקופית, למצוא שדה neurites זה לא צפוף מדי. מומלץ גם להימנע הדמיה סומה ליד התא, כמו צבע שיורי FM1-43FX יכול להישאר שם גם אחרי כביסה נרחב. לקבלת תמונות הניסוי שלנו, אנו בדרך כלל זום לגודל שדה של 51 51 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכושZ-ערימה של שדה נתון כיסוי לעומק של 7.8 מיקרון עם 27 0.3 מיקרון צעדים. טווח זה מספיק כדי לכסות את עובי של neurites בתרבות שלנו. לכל שלב בערימה-z, סרוק הראשון עם אור לייזר זה מלהיב immunofluorescence של נוגדן vGluT 1-לזהות את כל הסינפסות glutamatergic בתחום מיקרוסקופ. השדה אותו מחדש סרק בכל שלב של הקרינה FM1-43FX. הגדר סינון צפיפות ניטרלי ורווחי מכפיל בעקביות בין כל coverslips לניסוי נתון, תוך הימנעות הרוויה של האות. אנחנו בדרך כלל לרכוש ≥ 5 שדות לכל תנאי כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ניתוח, להמיר את Z-מחסנית לתוך תמונה מטוס בודד מרוכבים. תהליך אנו משתמשים עבור המרה זו מייצרת דימוי המבוסס על עוצמת מקסימום מהמטוס כל כל פיקסל. הדימוי מורכב הוא thresholded ו vGluT-1 מסופי מזוהים לניתוח, ללא התייחסות FM1-43FX הכתם. אזורים ויטראז, המכונה puncta, מסומנים כמו אזורים של עניין. אנחנו בדרך כלל לבחור 10 puncta לכל שדה. הבא בערוץ FM1-43FX הוא thresholded לבין אזורים של עניין הן על גבי. תוכנת הניתוח משמש לכמת את עוצמת הקרינה של כל אות, כמו גם את השטח של כל פונקטום. קריטריון פיקסל מוחלט או קריטריון פיקסל אחוז יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות פעיל פעיל. </li></ol> נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרבויות שלנו, אנו מוצאים כי 70-80% של סינפסות הגלוטמט, שהוגדר על ידי מכתים vGluT 1-, התערוכה לזיהוי FM1-43 מכתים 2, 6-8. בתמונות כיסו של ירוק FM1-43 פלואורסצנטי אדום vGluT-1 מכתים זו כפי שהיא משתקפת שפע של puncta צהוב: סינפסות עם שותף מקומי סמנים. אלו מסומנים על ידי החצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20-30% של (אדום) puncta vGluT 1-חיובי ייכשל להיות (ירוק) FM1-43 הקרינה מעל הבסיס. אלה הם מסופי presynaptic פעילים, דוגמה מצוינת באמצעות ראש החץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוכלוסייה השלישית של סינפסות יהיה גם ציין. אלו הן חיוביות (ירוק) FM1-43 הקרינה אך ללא מכתים vGluT-1 (אדום). אלו סינפסות GABAergic פעיל דוגמה מצוינת באמצעות הכוכבית. אלו אינן נכללות מרבית הניתוחים שלנו, אבל ניתן ללמוד במפורש באמצעות נוגדן טרנספורטר שלפוחי GABA במקום את הנוגדן vGluT 1. </li></ol>

<ol><li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+role+for+Ca2%2B-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li>
<li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li>
<li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li>
</ol>

משמעות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל סינפסות נחשבים פועלים על ידי שחרור משדר בהסתברות למדידה. עבודה על ידי עצמנו ואחרים עושה את זה ברור כי הסינפסות חלקם עקשן שחרור הנוירוטרנסמיטר, למרות מערך מלא של טרנספורטר הנוירוטרנסמיטר שלפוחי ושאר סמנים presynaptic מפתח 2, 6-8. הראינו בעבר כי פעילות הרשת הבסיס בנוירונים הוא קריטי כדי לשמור על אוכלוסייה זו של סינפסות פעיל. </li></ol><p class="jove_title" style=";te...

<table><tbody><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F-35355</td><td>קיים גם FM4-64FX עם הזזה לאדום, אך הוא לא הוכח כמתאים למספיק למבחני השתקה פרה-סינפטית.</td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>CyDex</td><td>AR-0A7-001</td><td></td></tr><tr><td>vGluT-1</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5905</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugated anti-GP</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

סינפסות שקט presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

פלסטיות בבסיס Synaptic סביר היכולת של מערכת העצבים ללמוד ולזכור ואולי גם לייצג ההסתגלות שמונעת אחרת עלבונות פגיעה מלהפוך neurotoxic. אנחנו כבר לומדים צורה של פלסטיות presynaptic כי הוא מעניין, בין השאר משום שהוא מבוטא מיתוג דיגיטלי לסירוגין היכולת מסוף s presynaptic לשחרר שלפוחית ​​המכילה את הנוירוטרנסמיטר גלוטמט. כאן אנו להדגים פרוטוקול המאפשר הדמיה מצב הפעילות של מסופי presynaptic בתרביות תאים ניתק מוכן מן ההיפוקמפוס מכרסמים. השיטה מסתמכת על גילוי סינפסות פעיל באמצעות מכתים עם צורה ניתן לתקן את צבע styryl FM1-43, נפוץ תווית שלפוחית ​​סינפטית. פרופיל זה מכתים הוא בהשוואה immunostaining של המסופים אותו עם נוגדן כנגד המשלח גלוטמט שלפוחי 1 (vGluT-1), כתם נועד תווית כל סינפסות הגלוטמט ללא קשר למצב ההפעלה. אנו מוצאים כי גירויים depolarizing להשרות השתקה presynaptic. האוכלוסייה של סינפסות כי הוא שותק בתנאי ההתחלה יכול להיות מופעל על ידי השתקת חשמל ממושכת או על ידי הפעלה של מסלולי איתות cAMP.

סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.

סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

פלסטיות סינפטית עומדת ככל הנראה בבסיס יכולתו של המערכת העצבית ללמוד ולזכור, ועשויה לייצג גם סגולת הסתגלות המונעת מצבים שבהם...

נראה כי חלק מהטרמינלים הפרסינפטיים במערכת העצבים המרכזית אינם תפקודיים או הם "שקטים". כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי טרמינלים פרסינפטיים שקטים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות טיפולים ומניפולציות החשודים כגורמים להשתקה או להשכמה של טרמינלים.הפרוטוקול משלב סימון של שלפוחיות סינפטיות באמצעות צבע חיוני במהלך דפולריזציה נוירונלית, יחד עם סימון עוקב של תאים מקובעים באמצעות נוגדן המסמן את כל הטרמינלים הפרה-סינפטיים, הן השקטים והן הפעילים. סינפסות המסומנות הן בצבע והן בנוגדן הן פעילות. סינפסות המסומנות בנוגדן בלבד הן שקטות.שלום, אני אמאנדה טיילור מהמעבדה של ד"ר סטיב מיניק במחלקה לפסיכיאטריה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. אני שאהין, גם אני ממעבדת מניק. היום נרצה להראות לכם פרוצדורה להדמיה של טרמינלים פרה-סינפטיים שקטים באמצעות נוירונים של היפוקמפוס בתרבית.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד פעילות חשמלית ומסלולי איתות בודדים אחרים מווסתים את שחרור הנוירוטרנסמיטורים. אז בואו נתחיל. תחת מ indicated laminar flow hood סטרילי, השתמשו ב-HIPA מחתולים של חולדות או עכברים בני 0 עד 3 ימים לאחר הלידה כדי להכין תרביות תאים מפוצלים.בהתאם לפרוטוקול שפרסמנו, התרביות שלנו הן תרביות גליאליות מעורבות המופקות מאותה דיסקציה; יש לזרוע את התאים בצלחות סטריליות של 35 מילימטר, שכל אחת מהן מכילה כיסוי זכוכית (cover slip) מספר 0 שצופה ב-5 mg/mL של קולגן. יש לזרוע את הנוירונים בצפיפות מקורבת של 500 תאים לסמ"ר.12 גורי חולדה יניבו בדרך כלל 30 צלחות של 35 מילימטר. יש להניח לתרביות לגדול באינקובטור תרביות למשך 10 עד 14 ימים. לצורך פיתוח והבשלת סינפסים, יש להוסיף את ה-anti-mitotic a C כדי לעצור את צמיחת הגליות ביום הרביעי למשך התרבית (day in vitro four).כמו כן, ביום החמישי לתרבית (in vitro), בצעו החלפה חלקית של המצע למצע neuro basal בתוספת B 27 כדי לשפר את הישרדות הנוירונים במהלך תקופת הבשלה זו. החילו טיפולים המשנים את מספר הסינפסות השקטות באופן פרה-סינפטי. מצאנו שדרך נוחה להשקיט אחוז גבוה של סינפסות גלוטמט היא טיפול של ארבע שעות ב-30 millimolar אשלגן.כאשר התרביות בשלות, לנוירונים צריכה להיות צפיפות נמוכה יחסית עם שלוחות עצביות נרחבות ומופרדות היטב. הוצא את התרביות מהאינקובטור והעבר אותן לשולחן העבודה. החלף את מצע התרבית בתמיסת סלין עם בופר המכילה 45 millimolar potassium chloride ו-10 micromolar FM 1 43 FX die.תמיסה זו צריכה להכיל גם NBQX ו-APV כדי למנוע סיגנלינג חוזר. חשוב לשמור את תמיסת המלאי של FM 1 43 FX ואת הניסויים בחשכה כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). לכן, כסו את צלחות התרבית בנייר אלומיניום בכל שלבי האינקובציה הבאים.דגרו במשך שתי דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. הסירו את תמיסת הצבע ושטפו למשך שלוש עד חמש שניות בלבד ב-heaps buffered saline עם 500 micromolar adversive.Seven. להסרת קישור לא ספציפי של הצבע, התזמון בשלב זה הוא קריטי.חשיפה ממושכת ל-adv adverse F seven תסיר את כל סימון ה-FM 43 FX. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים ב-heaps buffered saline ללא adv adverse Seven, בחמישה מרווחי זמן של שתי דקות, תחת מנדף כימי.קבע את התרביות ב-4%paraldehyde ו-0.2%glutaraldehyde ב-PBS למשך 10 דקות. שטוף את התאים קצרות ב-PBS. כעת ניתן להוציא את התאים ממטחט השאיבה.הוסיפו תמיסת חסימה המכילה 4%normal goat serum ו-0.04%tritton X כדי להפחית את הרקע ולהגדיל את חדירות התאים לצביעה אימונוהיסטוכימית. הדגרירו למשך 15 דקות. צבעו את התאים עם נוגדן vlu T one המדולל ביחס של 1:2000 בתמיסת החסימה.דגרו את התרביות בנוכחות הנוגדן תוך כדי נדנוד עדין למשך שלוש שעות. שטפו את התאים ארבע פעמים עם PBS. דגרו את התאים עם Alexa.נוגדן שני אנטי-חזי חול (anti Guinea pig) מסומן ב-6 47, מדולל ביחס של 1:500 בתמיסת החסימה. יש להחזיק את התרביות בנוגדן השני תוך כדי נדנוד עדין למשך 30 דקות. שטוף את התאים ארבע פעמים נוספות ב-PBS.הנח טיפה קטנה של תגית רצפה על תבנית זכוכית נקייה באמצעות פינצטה. הרם זכוכית כיסוי והנח אותה בעדינות על הטיפה, כך שתאי תגית הרצפה יהיו פונים לתבנית. השאר את התבנית לייבוש למשך הלילה.הכינו עדשה אובייקטיבית 60 x oil במיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקלי. הניחו את הפסחית על הבמה כך שזכוכית המכסה פונה לעדשה. אתרו שדה של נוריטים שאינו צפוף מדי ושנמצא הרחק מהסומה, שעלולה לשמור על שאריות צבע.בצעו זום לגודל שדה של 51 על 51 מיקרון. באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, רכשו מחסנית ZS המכסה עומק של 7.8 מיקרון על פני 27 שלבים של 0.3 מיקרון לכל שלב.בצעו סריקה ראשונה עבור הנוגדן VLU T one כדי לזהות את כל הסינפסות הגלוטמטרגיות בשדה. לאחר מכן, סרקו שוב עבור פלואורסצנציית FM 1 43 FX כדי לנתח את התמונות לאחר הרכישה. השתמשו בתוכנת ניתוח כדי להמיר את ה-Z tack לתמונת מישור בודד מורכבת, המבוססת על קריאת העוצמה המקסימלית מכל מישור עבור כל פיקסל, תוך הגדרת סף.כדי להפחית את הרקע, זהו את קצות ה-VG glu T one ללא התייחסות לצביעת ה-FM 1 43 effects. סמנו נקודות אלו כאזורי עניין. בדרך כלל אנו בוחרים 10 PUNTA לכל שדה.חזרו על תהליכי הסף (thresholding) ובחירת הנקודות (puncta) בתמונת ההשפעות של FM 1 43 והסמירו את התמונות כדי לזהות סינפסות שקטות. ניתן להשתמש בקריטריון פיקסלים מוחלט, או בקריטריון אחוז פיקסלים, כדי להבדיל בין סינפסות פעילות חיוביות ל-FM 1 43 לבין סינפסות לא פעילות שליליות ל-FM 1 43. בתרביות שלנו, מצאנו ש-70 עד 80% מסינפסות הגלוטמט שהוגדרו על ידי צביעת V glut one מראות צביעת FM 1 43 ניתנת לגילוי בתמונות מוסמירות של פלואורסצנציית FM 1 43 ירוקה וצביעת V glut one אדומה.דבר זה ניכר כשפע של נקודות צהובות (puncta) של סינפסות עם סמנים הממוקמים יחד (co-localized). אלו מסומנים על ידי החיצים. כ-20 עד 30% מהנקודות החיוביות ל-Vglut1 באדום לא יראו פלואורסצנציית FM 1-43 בירוק מעל קו הבסיס.אלו הם הטרמינלים הפרה-סינפטיים הבלתי פעילים, ודוגמה אחת מסומנת על ידי ראש החץ. תצפית תגלה גם אוכלוסייה שלישית של סינפסות. אלו חיוביות לפלואורסצנציה ירוקה של FM 1 43, אך נטולות צביעת B glut one אדומה.אלו הן סינפסות GABAergic פעילות, ודוגמה אחת מסומנת בכוכבית. אלו מוחרגות מרוב הניתוחים שלנו, אך ניתן לחקור אותן במפורש באמצעות נוגדן למעביר GABA וסיקולרי. במקום הנוגדן ל-VLU T one, הראינו לכם כעת כיצד להדמיות של סינפסות שקטות פרה-סינפטית באמצעות FM 1 43 וצביעת אימונו של VLU one.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ש-FM 1 43 FX רגיש הן לזמן השהייה בתוך ה-adver sub seven wash והן לריכוז של ה-X 100 המטפל הכלול בתמיסת החסימה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

presynaptically-silent-synapses-studied-with-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

הפרוטוקול המוצג מתאר את השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) כדי לכמת שינויים צירקדיים בקליפת המוח של חבית העכבר, תוך התמקדות בעיקר במספר הסינפסות ובמורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטית.

מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כטכניקת הדמיה לניתוח הפלסטיות הסינפטית הצירקדית בקליפת המוח של חבית העכבר

למדו פרוטוקול לזיהוי סינפסות שקטות פרה-סינפטיות במערכת העצבים המרכזית באמצעות צביעת צבע חי ואימונו-סטיינינג. שיטה זו מאפשרת להבחין בין סינפסות פעילות לשקטות ולחקור פלסטיות סינפטית.

סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

גלה סרטונים נוספים