תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

סרטון זה מדגים פרוטוקול להדמיית שכפול DNA על ידי מיקרוסקופיה אופטית רחבת שדה ליניארית ושונה כימית. DNA מחובר לכיסוי זכוכית פונקציונלי. הקצה החופשי של הדנ"א מסומן בחרוז והדנ"א נמתח על ידי זרימה למינרית.

כאשר השכפול מתחיל, הגדיל המוביל מתחיל להתארך והגדיל המפגר מתקצר עקב סליל. ההבדל הגדול באורך בין DNA דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי בכוחות נמוכים מאפשר תצפית ישירה על המרות DNA במהלך השכפול. אורך מבנה ה-DNA מנוטר על ידי מעקב אחר מיקום החרוז, המאפשר קביעה מדויקת של קצב ותהליך שכפול ה-DNA.

היי, אני ארי אולריך מהמעבדות של אנטו וניאן וצ'ארלס ריצ'רדסון במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום אנו הולכים להראות לכם הליך להדמיית שכפול DNA ברמה מולקולרית אחת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדות שלנו כדי לחקור פעילויות אנזימטיות המתרחשות במהלך סינתזת DNA.

אז בואו נתחיל בתחילת הליך זה. חיידקים לינאריים פאג' למבדה DNA משתנה על ידי אוליגונוקלאוטידים כורעים ליצירת מזלג שכפול, זרוע מזלג משלימה למבדה, זרוע מזלג ביוטיניל ופריימר מזלג. זרוע המזלג הביוטינית מכילה ביוטין t המחובר לחמשת הקצה הראשוני שלו, המאפשר קשירה של תבנית ה-DNA לפני השטח של תא הזרימה.

ה-DNA של הלמבדה משתנה עוד יותר על ידי חישול, אוליגונוקלאוטיד נוסף המכיל דיגן וחלק המשמש כתג חיסוני בעל זיקה גבוהה להצמדת חרוז. כדי ליצור את מזלג השכפול, השג DNA למבדה בנוסף למספר אוליגונוקלאוטידים שניתן למצוא את הרצפים שלהם בפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה. אוליגונוקלאוטידים אלה כוללים זרוע מזלג ביוטינילית, זרוע מזלג משלימה למבדה, פריימר מזלג ודיגן משלים למבדה וזרחן קצה חמשת הקצוות העיקריים של זרוע המזלג המשלים למבדה וקצה דיגו ג'נין המשלים למבדה באמצעות T ארבעה פולינוקלאוטיד קינאז.

לאחר מכן מערבבים את זרוע המזלג המשלימה של למבדה זרחנית, זרוע המזלג הביוטינילית, פריימר המזלג וה-DNA של הלמבדה ביחס מולרי של 10 עד 10 עד 100 לאחד. ב-T ארבע DNA ליגאז מחממים את התערובת ב-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ומצננים לאט לטמפרטורת החדר על ידי כיבוי גוש החום כדי לאפשר חישול נכון של האוליגונוקלאוטידים ו-T ארבעה DNA ליגאז לתערובת ולדגור במשך שעתיים. בטמפרטורת החדר, T four DNA Ligase יזרז את איטום החריצים בין האוליגונוקלאוטידים והלמבדה.

ה- DNA לבסוף מבטל את הלמבדה המשלים ומסיים את תבנית שכפול ה- DNA על ידי הוספת ה- diggen המשלים של הלמבדה הזרחני ומסתיים ב- T ארבע מאגר ליגאז דוגר את התערובת למשך 30 דקות ב -45 מעלות צלזיוס ושוב, מתקרר לאט לטמפרטורת החדר על ידי כיבוי בלוק החום לחבר את חמצן החפירה המשלים של למבדה זרחני ולסיים את תבנית שכפול ה- DNA על ידי הוספת T ארבע ליגאז DNA לתערובת ו דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. תבנית שכפול ה-DNA הסופית מוכנה כעת לשימוש. על מנת לחבר את החרוזים המגנטיים המופעלים על ידי ציצית לתבנית שכפול ה-DNA, עליהם להיות פונקציונליים עם שבר FAB ספציפי לדיגו ג'נין.

כדי להתחיל בתהליך זה, השעו מחדש את תמיסת המלאי של החרוזים והעבירו 400 מיקרוליטר לצינור עינור. הנח את הצינור במפריד מגנטי ודגר עד שהתמיסה מתנקה. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג כדי להפעיל את קבוצות הטואל לצימוד נוגדנים, הוסף מיליליטר אחד של מאגר הגוף וערבב בעדינות על ידי פיפטינג.

שוב, הסר את הסופרנטנט בעזרת מפריד מגנטי. לאחר מכן, הוסף 240 מיקרוליטר של שבר FAB והשהה מחדש את החרוזים ב-400 מיקרוליטר של מאגר בוראט. מערבבים היטב ומאפשרים דגירה על מסובב למשך 16 עד 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הפרד את החרוזים באמצעות המפריד המגנטי והסר את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה ודוגרים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את המאגר באמצעות המפריד המגנטי. שטיפה זו חוזרת על עצמה פעמיים.

כדי לחסום את קבוצות הטוסיל החופשיות, הוסף מיליליטר אחד של BSA המכיל טריס בופר ודגירה למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את המאגר מהחרוזים באמצעות שטיפת מפריד מגנטי פעמיים עם מאגר ואליקווט. לשימוש, ה-DNA שיש לשכפל מחובר לפתקי כיסוי זכוכית המתפקדים עם נתיב אמיל.

קבוצת החמצן של נתיב אמיל נקשרת לזכוכית ומשאירה אמין זמין לקשירה למולקולות peg ביוטיניליות. ציפוי זה מסייע בהפחתת קשירה לא ספציפית למשטח. כדי לנקות היטב את החלקות כיסוי הזכוכית, הניחו אותן בצנצנות מכתימות ומלאו את הצנצנות באתנול סוניקט.

במשך 30 דקות יש לשטוף את הצנצנות ולמלא בסוניקט אשלגן הידרוקסיד מולארי אחד למשך 30 דקות ולחזור על שתי השטיפות. לצורך תגובת הפונקציונליזציה הראשונה, יש להסיר את כל עקבות המים. מלאו את צנצנות הצביעה באצטון וסוניקט למשך 10 דקות.

מרוקנים את הצנצנות וממלאים שוב באצטון. המשך להוסיף את מגיב הסינוס לצנצנות ולערבב במשך שתי דקות. ואז להרוות עם עודף גדול של מים.

לאחר מכן יבש את החלקות הכיסוי על ידי אפייתם בחום של 110 מעלות צלזיוס בתנור למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו את תערובת היתד בכ- 0.2% משקל לנפח. יתד ביוטיניל, כולל מרווח החלקה לכיסוי זכוכית, יאפשר הפרדה של החלקות הכיסוי, פיפטה 100 מיקרוליטר על החלקת כיסוי מבודדת יבשה.

הניחו תלוש כיסוי שני מעל. דגרו את החלקות הכיסוי בתמיסת PEG למשך שלוש שעות. לאחר מכן הפרד כל זוג החלקות כיסוי ושטוף בהרחבה במים.

הקפד לשמור על החלקות הכיסוי מתפקדות כלפי מעלה מכיוון שרק צד אחד יהיה מצופה יתד. לבסוף, יבש את החלקות הכיסוי באוויר דחוס ואחסן אותם תחת ואקום בייבוש, המשטחים נשארים יציבים לפחות חודש. כך שניתן להכין עשרות תלושי כיסוי באצווה ולהשתמש בהם לפי הצורך.

כעת, כשהחלקות הכיסוי מוכנות, אפשר להרכיב את תא הזרימה לניסוי המולקולה הבודדת. ניסוי המולקולה הבודדת מבוצע באמצעות תא זרימה פשוט הבנוי עם החלקת כיסוי פונקציונלית, סרט דו צדדי, שקופית ליטר וצינורות. תא זרימה אחד מוכן לכל ניסוי של מולקולה בודדת.

התחל בערבוב של חמישה מיליליטר של מאגר חוסם ו-20 מיליליטר של מאגר עובד והנחת התערובת בחומר ייבוש כדי להסיר בועות אוויר לשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן, מורחים 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של strp din ב-PBS על פני השטח של החלקת הכיסוי הפונקציונלית של היתד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-strp din לקשור ביוטין על פני השטח. בינתיים, חותכים חתיכת סרט דו צדדי כך שתתאים לגודל שקופית הקוורץ, מסמנים את מיקום חורי הצינורות על הקלטת.

מתאר את תא הזרימה על ידי ציור תעלה מרכזית ברוחב שלושה מילימטרים ומלבנים המכילים את שני החורים. ניתן לעצב תאי זרימה עם שני תעלות בצורת כניסה ושתי יציאות בצורת y. כעת חותכים את הסרט המסומן לאורך קווי המתאר המצוירים, ומבצעים חתכים נקיים ישרים כדי לוודא ששום דבק לא בולט לתעלה.

נקה היטב את שקופית הקוורץ באמצעות אצטון כדי להסיר דבק מבניית תאי הזרימה ששימשה בניסויים קודמים. מצא את היישור הטוב ביותר של מתאר הערוץ. הסר צד אחד של גב הדבק והנח בזהירות את הסרט על מגלשת המגרש.

הקפד ליישר את הסרט כראוי מכיוון שחורי הכניסה והיציאה צריכים להישאר לא חסומים. לאחר מכן, הכינו את אורכי חיתוך הצינורות של צינורות בקוטר פנימי של 0.76 מילימטר לכניסה ויציאה של תא הזרימה. חותכים את קצה הצינור בזווית של כ-30 מעלות כך שהצינור לא ילחץ שטוח על תחתית החדר.

תלו את הצינור על מדפי המבחנה לחיבור קל לתא הזרימה בשלבים הבאים. בשלב זה, הדגירה של החלקת הכיסוי אמורה להסתיים. שוטפים את הכיסוי, מחליקים היטב במים ומייבשים אותו באמצעות אוויר דחוס.

היזהר לא להפוך את החלקת הכיסוי מכיוון שרק צד אחד מתפקד עם יתד. השלם את הרכבת תא הזרימה על ידי הסרת הצד השני של גב הסרט והנחת מגלשת הקוורץ על החלקת הכיסוי לחץ קלות על החלקת הכיסוי כדי לדחוף החוצה את כל האוויר הכלוא בדבק. זה יעזור למנוע בועות אוויר להיכנס לתעלת הזרימה.

אטום את דפנות החדר באפוקסי. הכנס את הצינור החתוך לחורי הקוורץ ואוטם במקומו עם האפוקסי. מניחים להתייבש מספר דקות.

לאחר הייבוש, השתמש במחט בגודל 21 כדי למשוך חלק מה-DGAs החוסמים את המאגר דרך אחד הצינורות על מנת לחסום את פני החדר. שטפו החוצה כמה פעמים כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר לתא לדגור לפחות 30 דקות לפני שתעברו לניסוי שכפול המולקולה הבודדת. לאחר הכנת החרוזים המתפקדים של תבנית ה-DNA ותא הזרימה, ניתן לבצע ניסוי מולקולה בודדת.

כדי להתחיל, הנח את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ. החזק את החדר במקומו עם tagקליפסים וודא שתעלת הזרימה ממוקמת בהתאמה למצלמת ה-CCD. התחבר לאוויר שנבנה בעבר לקפיץ למשאבת המזרק ולצינורות היציאה של תא הזרימה.

באמצעות צינורות מחבר בקוטר גדול יותר, הנח את צינורות הכניסה של תא הזרימה במאגר חוסם ומשוך לאחור את המזרק כדי להסיר בועות אוויר מהצינורות, החלק בעדינות את צינורות היציאה כדי לנקות בועות אוויר כלואות בתא הזרימה. לאחר הסרת כל בועות האוויר, חבר את אחד מצינורות הכניסה במחט ואטום את אחד מצינורות היציאה על ידי כיפופו ב-180 מעלות ואבטחתו עם סרט דבק לפני הוספת DNA לתא, יש לדלל את תבנית ה-DNA של המלאי ל-10 פיקומולר במיליליטר אחד של DGAs מאגר חסימה אחד. הזרימו את התבנית לתוך החדר בקצב זרימה מתון כדי לאפשר כיסוי פני שטח טוב של ה-DNA.

לדלל את תמיסת חרוזי המלאי בין שתיים לארבע פעמים 10 מהחרוזים השישיים למיליליטר. במיליליטר אחד של DGAs מאגר חסימה אחד. לאחר מכן מערבלים את התערובת וסוניקט למשך 20 שניות.

הזרימו את תמיסת החרוזים המדוללת לתוך החדר. לאחר הוספת חרוזים, כבה את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל. לאחר מכן סגור את שני צינורות היציאה.

כל שינוי בצינורות ללא תא סגור יגרום לתנודות לחץ שיפעילו כוח חזק על החרוזים ויגזזו את מולקולות ה-DNA הקשורות. חבר את צינור הכניסה ששימש להעמסת החרוזים בעזרת מחט באמצעות צינור הכניסה השני. התחל לשטוף את תא הזרימה עם תמיסת DGAs אחת של חסימת שטיפת חיץ באופן נרחב.

עורר את הבמה על ידי הקשה כדי להסיר חרוזים שאינם דבוקים במיוחד למשטח כדי לבדוק אותו. החרוזים קשורים ל-DNA. נסה לשנות את כיוון הזרימה.

לאחר שהחרוזים החופשיים מוסרים מספיק, כבה את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל. הכן תערובת תגובה טרייה המכילה חלבוני שכפול כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. סגור את צינור היציאה הפתוח והעביר את מאגר הכניסה לתערובת התגובה הטרייה שהוכנה.

פתיחה איטית של השקע כדי למנוע שינויי לחץ מהירים כדי להמשיך בתגובה האנזימטית. ראשית, הזרימו את תמיסת החלבון לתוך החדר בקצב זרימה מתון כדי לאפשר קשירה יעילה ל-DNA. כבה את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל.

סגור את צינורות היציאה והחלף את הצינור המכיל את תערובת התגובה. כשהצינור מורכב ממאגר כביסה של DGAs, שטפו את החדר כדי להסיר חלבונים חופשיים לאחר הכביסה. שוב, כבה את הזרימה ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל.

סגור את צינורות היציאה והחלף את הצינור המכיל מאגר כביסה. כאשר הצינור מכיל את מאגר השכפול T 7, מאגר השכפול T 7 מכיל מגנזיום כלוריד המפעיל את תחילת תגובת השכפול. השתמש בקצב זרימה של 0.012 מיליליטר לדקה המתאים לכוח גרירה של שלושה פיקו ניואין על קשירה של ה-DNA תוך שימוש בתנאים המתוארים בפרוטוקול זה.

הנח מגנט קבוע של אדמה נדירה מעל תא הזרימה לפני ההדמיה כדי למנוע אינטראקציות לא ספציפיות בין החרוזים למשטח. מקם תאורת סיבים בזווית התרחשות בין 10 מעלות ובמקביל לשלב המיקרוסקופ ליד שדה הראייה של המיקרוסקופ עם אובייקט פי 10 ומצלמת CCD. תאורת שדה כהה משמשת להגברת הניגודיות במיקוד הדמיית החרוזים באמצעות חרוז קשור.

התחל ברכישת נתונים במשך 20 עד 30 דקות בקצב פריימים איטי. בניסוי מוצלח ניתן לצפות ב-100 חרוזים בו זמנית. הניסוי אמור להניב עקבות רבים המציגים סינתזת DNA גדילית מובילה.

על מנת למדוד את הקצב והתהליך של פירוק ה- DNA ופילמור, יש לקבוע את המיקומים המדויקים של החרוזים כדי להשיג זאת. התאימו את המיקומים הללו לפונקציות גאוס דו-ממדיות. דמיין את המסלול על ידי מעקב אחר מיקום החרוז בכל מסגרת באמצעות תוכנת מעקב.

לאחר מכן שרטט את מיקום החרוז כפונקציה של זמן באמצעות כל תוכנה גרפית כדי להשיג נתוני קצב. התאם את העלילות עם רגרסיה ליניארית וחשב את השיפוע עבור תהליכי. קבע את האורך הכולל של ה- DNA מתחילתו ועד סופו של אירוע קיצור.

שלב את כל המדידות הבודדות והתפלגות קצב העלילה והפרודוקטיביות התאימו לנתונים באמצעות פונקציות גאוס ופונקציות מעריכיות בודדות בהתאמה. זה עתה הראינו לכם כיצד למדוד את הקצב ואת התהליך של שכפול ה-DNA ברמת מולקולה בודדת. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שהכוח וההימורים המסוימים של זרימת הלמינה אינם משפיעים על הפעילות האנזימטית של חלבוני השכפול.

אז זהו. תודה שצפיתם ותהנו מהניסויים שלכם.