Name: תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: למדו תצפית ישירה של שכפול DNA בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רחבת שדה ו-DNA לבדה מתוח. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויי אורך ה-DNA וקביעת קצב השכפול במדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

הפיתוח של ה-DNA מתיחה assay נעזרה פול Blainey, בונג ג&#39;ונג לי, סמיר חמדאן. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים לצ&#39;ארלס ריצ&#39;רדסון (GM54397) ואנטואן ואן Oijen (GM077248).

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

חשוב להבטיח כי כוח הגרר המופעל על ידי זרימה למינרית חרוזים אינו משפיע על פעילות אנזימטית של חלבונים שכפול. למשל, כוח 3 PN המתאים קצב זרימה של 0.012 ml / min לא משפיע השכפול של גדיל DNA מובילים. היא עושה זאת להשפיע על הפעילות האנזימטית המתרחשים במהלך סינתזת DNA מתואמת, ולכן יש לצמצם 1.5 PN. הכוח לגרור ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי קצב הזרימה או ברוחב של ערוץ הזרימה 5. ה-DNA מתיחה assay מעסיקה הבדלים באו...

<table><tbody><tr><td>DNA של בקטריופאג &amp;#955;</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>אוליגו-נוקלאוטידים של DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-digoxigenin Fab</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי Tosyl Activated</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>מפריד מגנטי</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>ניתן להשתמש באמינו-סילאנים אחרים או לערבב אותם עם סילאנים שאינם רגיבים לאמינים עבור משטחים דלילים יותר</td></tr><tr><td>Succinimidyl propionate PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>ניתן לרכוש PEGs דומים מ-Nanocs, CreativePEGWorks וכו'</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>ניתן לרכוש PEGs דומים מ-Nanocs, CreativePEGWorks וכו'</td></tr><tr><td>סרט דו-צדדי</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>עובי 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>שקופית קוורץ</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td><td>גודל המתאים לכיסויי זכוכית. יש לקדוח חורים באמצעות מקדחים בעלי קצה יהלום (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>קוטר פנימי 0.76 mm, קוטר חיצוני 1.22 OD&lt;br/&gt;ניתן להחליף בצינורות בגדלים אחרים.</td></tr><tr><td>סטרפטאבידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>הכן תמיסה בריכוז 1 mg/mL, במנות (aliquots) של 25 &amp;#x03BC;L ב-PBS pH 7.3</td></tr><tr><td>תערובת תמיסות דאוקסיריבו-נוקלאוטיד טריפוספט</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי הפוך עם עדשה 10X</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>מגנט קבוע של נדירות-ארץ</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרקים</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>הפעל במצב מילוי חוזר (refill mode) כדי להקל על החלפת תמיסות</td></tr><tr><td>מאיר סיבים</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

תצפית ישירה של ה-dna אנזימים שכפול באמצעות dna מולקולה בודדת מתיחה assay

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ&quot;א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage. לינארית λ-DNA הוא שונה יש ביוטין על קצה חוט אחד, מחצית digoxigenin בצד השני של גדיל אחד. סוף biotinylated מחובר coverslip כוס פונקציונליות לבין סוף digoxigeninated כדי חרוז קטן. הרכבה של אלה-DNA חרוז חבלים על פני השטח של התא זרימה מאפשר זרימה למינרית להיות מיושם להפעיל כוח לגרור על החרוז. כתוצאה מכך, ה-DNA הוא נמתח קרוב ובמקביל פני השטח של coverslip לעבר הכוח אשר נקבעת על ידי קצב הזרימה (איור 1). אורכו של ה-DNA נמדד על ידי ניטור את המיקום של החרוז. הבדלי אורך בין דנ&quot;א יחיד ו פעמיים תקועים מנוצלים לקבל מידע בזמן אמת על פעילות החלבונים שכפול במזלג. מדידת המיקום של החרוז מאפשר קביעה מדויקת של שיעורי processivities של ה-DNA ואת ההתרה פילמור (איור 2).

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ&quot;א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

אנו מתארים שיטה לצפייה בזמן אמת בשכפול של מולקולות DNA בודדות, המתווך על ידי חלבונים של מערכת השכפול של הבקטריופאג. ...

סרטון זה מדגים פרוטוקול להדמיית שכפול DNA באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בשטח רחב (widefield) של DNA מסוג למבדה ליניארי ומודגמר כימית. ה-DNA מחובר לכיסוי זכוכית פונקציונלי. הקצה החופשי של ה-DNA מסומן בחרוז (bead) וה-DNA נמתח באמצעות זרימה למינרית.עם תחילת השכפול, הגדיל הstrand המוביל להתארך והstrand המפגר מתקצר עקב קלייה. ההבדל הגדול באורך בין DNA דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי בכוחות נמוכים מאפשר תצפית ישירה על המרות DNA במהלך השכפול. אורך מבנה ה-DNA מנוטר על ידי מעקב אחר מיקום החרוז, דבר המאפשר קביעה מדויקת של קצב ותהליך השכפול של ה-DNA.שלום, אני ארי אולריך מהמעבדות של אנטוני וניאן וצ'ארלס ריצ'רדסון במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה לדימוי של רפליקציית DNA ברמה המולקולרית הבודדת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדותינו כדי לחקור פעילויות אנזימטיות המתרחשות במהלך סינתזת DNA.אם כן, נתחיל. בתחילת הליך זה, DNA של פאג למבדה (Lambda) של חיידקים בלינאריזציה עובר שינוי באמצעות אוליגונוקלאוטידים כדי ליצור מזלג רפליקציה, זרוע מזלג משלימה למבדה, זרוע מזלג ביוטינילית ופריימר למזלג. זרוע המזלג הביוטינילית מכילה ביוטין המחובר לקציו של הקצה ה-5', מה שמאפשר עיגון של תבנית ה-DNA לפני השטח של תא הזרימה.ה-lambda DNA עובר שינוי נוסף על ידי היברידיזציה

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

מחקר זה מציג הליך ניסיון מפורט כדי למדוד דינמיקת לולאות של גדילי הדנ"א כפול באמצעות פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה מולקולה בודדת (סריג). הפרוטוקול מתאר גם כיצד לחלץ את צפיפות הסתברות הלולאה נקראת גורם J.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

המתודולוגיה מסייעת בניתוח השונות בדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות ננו-חלקיקים. ניתן לאמץ מתודולוגיות שונות המבוססות על רמת ציטוטוקסיות של החומר המעניין. בנוסף, תיאור של ניתוח התמונה מסופק כדי לסייע בניתוח סיבי DNA.

הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

למדו תצפית ישירה של שכפול DNA בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רחבת שדה ו-DNA לבדה מתוח. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויי אורך ה-DNA וקביעת קצב השכפול במדויק.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

גלה סרטונים נוספים