Name: רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למד פרוטוקול סטנדרטי להפקת חלבון מ-Fusarium spp. לאחר אינדוקציית רעלן בת 10 ימים. השיטה ממזערת הטיות ניסיוניות ומייצרת דגימות חלבון איכותיות לניתוח פרוטאומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Servane Contal ובוריס Untereiner על תרומתו הטכנית שלהם. אנו מכירים את התמיכה של הפרויקט FNR &quot;FUTOX&quot;.

הפרוטוקול דורש 16 ימים להשלמתו. הזמן הוא מפורט באיור 1. פרטים להכנת חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר תמוגה (3mL לדגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר כביסה (50 מ"ל לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד לניתוח נוסף ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת למאגר משקעים (20mL לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד הצורך ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה צריכה להתבצע מעדיפים לתוך תא קר 4 ° C. </li></ul> הפטרייה מינים שלושה זנים המשמשים מנתח proteomic סווגו להיות graminearum Fusarium על סמך תכונות מורפולוגיות שלהם תרגום התארכות-Alpha-1 גורם ניתוח (אודונל et al., 1998) זנים אלו שייכים לאוסף ליפמן CRP-גבריאל נשמרו ואוחסנו ב - 80 מעלות 15% גליצרול. הכנת mycelia פטריות שעובדו על V8 במשך 4 ימים של 25 מעלות צלזיוס לסירוגין תקופה האור והחושך כל 12 שעות. תרבויות היו מפוצלים באמצעות להב סטרילי חתיכות של התרבויות הללו שימשו כדי לחסן 250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer המכילה 100 מ"ל של רעלן וישכנע התקשורת. Mycelia נבצרו לאחר 10 ימים הופרדו בינוני ידי סינון התרבות עם מסנן סטרילי. Mycelia נשטפו 3 פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר שאריות בינוני ותרכובות אחרות. לאחר מכן, אנו קפא מיד את התאים על ידי הוספת חנקן נוזלי ושמר את דגימות ב -80 ° C. תיאור כללי של מיצוי החלבון דגימות חלבון חולצו באמצעות השיטה המתוארת 3A הדמות 3B. הדגימות היו Fusarium הקרקע בחנקן נוזלי ואת אבקת נאסף 10 מ"ל צינורות טפלון. דגימות הודגרו אז 30 דקות עם למאגר תמוגה, מורתחים במשך 10 דקות, centrifuged 2 פעמים בטמפרטורת החדר (12000g במשך 15 דקות). Supernatants נאספו מודגרות ב -20 מעלות עם משקעים חיץ בין לילה. לאחר צנטריפוגה ב 4 ° C 30000g במשך 45 דקות, את כדורי של חלבונים זירז נשטפו 3 פעמים עם אצטון קר המכילה DTT. לבסוף, היו כדורי אוויר יבש החלבונים היו resolubilized במאגר תיוג, התאמת ה-pH ל 8. מדגם קטן של 30 מ"ל הוסר עבור כימות חלבון הכולל supernatant הנותרים אוחסן ב -20 ° C עד אלקטרופורזה חלבון. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ציר הזמן של ההליך. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Scheme למפעילים מרובים מדגם עיבוד. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="איור 3א" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3a"> איור 3 א. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="איור 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3b"> איור 3 ב. אנא <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 3a, או <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">כאן</a> לגרסה גדולה יותר של 3b דמות. דמויות 3a-b תרשימי זרימה לתהליך מיצוי החלבון (A: יום ראשון, ב ': היום השני).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. 1D תמונה של תמציות חלבון. חלבונים נוהלו עד הגירה מלאה של כחול עד סוף הג'ל כי היה מוכתם סגול לבה. אנא <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

עניין אחרונים גישות proteomic בתוך תחום הביולוגיה פטרייתי הוביל מספר מוגבר של פרסומים באמצעות טכניקה זו (הנסקרת כמו קים et al. 2007). שיטות להפקת חלבון מסתמכים על שילוב של מיצוי הליכים, הם לעתים קרובות תיאר בקושי בסעיפים מתודולוגיים דורשים מומחיות בהתמודדות עם שיטות פתרון בעיות פוטנציאליות. באשר &quot;omics&quot; גישות אחרות, הגדרת סטנדרטים עבור עיבוד מדגם נתונים היא חיונית על מנת ליצור מידע מדעי אמין. יתר על כן דגימות ונהלים של מניפולציה יש לתאר באופן הולם על מנת לאפשר פרשנות תוצאה משותף בין ניסויים שונים &quot;omics&quot;. זה יהיה חיוני ניצול מלא של פוטנציאל הכרייה צולבות נתונים גנומיקה, metabolomics, ... (מוריסון et al. 2006). מידע מינימלי על ניסוי proteomic כבר ניסחו וקבוצות עבודה הוקמו כדי להתמודד עם כל ההיבטים של ניסוי (ג&#39;ל אלקטרופורזה, ספקטרומטריית מסה, אינטראקציות מולקולריות, שינויים חלבון, מידענות Proteomics, עיבוד המדגם). כרגע אין מידע מוגדר זמינים הליכי עיבוד המדגם. לאור החשיבות של מיצוי הליכים חלבון בקביעת איכות הסופי של מחקרים proteomic, כדי ליישם נהלים יכולים להגדיל תקינה במסגרת הנחיות MIAPE (Taylor et al. 2007), הצענו את השימוש בפרוטוקול וידאו המפרט מדגם עיבוד. תיאור וידאו של ניסויים עשוי לתרום באופן משמעותי כדי להגדיל את מספר מידע על עיבוד המדגם שעלולים לגרום שחזור טוב יותר של &quot;omics&quot; ניסויים (Pasquali, 2007). ואכן, שחזור פני מעבדות היא דרישה בסיסית כדי להבטיח את תקפות תוצאות proteomics (http://www.fixingproteomics.org). שחזור צולבת מעבדה מושפע משני גורמים: instrumentations שונים המפעילים מניפולציות שונות דגימות. בפרוטוקול שתואר, אנו מציעים לבצע ביולוגי משכפל מעורבים מפעילי מרובים (איור 2 ו - וידאו) כדי להגביר את האמינות של הנתונים (כלומר וריאציה טכני של התוצאות נלקחת בחשבון). ההליך המתואר להפקת חלבון מבוססת על SDS וחימום. זה היה הראו בעבר כדי להבטיח טוהר כמות טובה של חלבונים (Bridge 1996). SDS יחד עם רותחים מתמוסס קירות התא, חלבונים הידרופובי ומונע היווצרות משקעים oligomers כי להפיל של חלבונים. רתיחה מאפשר גם איון של פרוטאזות. את אותו אפקט מיוצר גם על ידי EDTA, PMSF ו מעכב פרוטאז להשלים מיני. DTT מסיר גשרים דיסולפיד פנימה בין חלבונים להקל solubilization חלבון. על מנת להסיר SDS לפני IEF, חלבונים הם זירז ידי אצטון / TCA / DTT. יתר על כן, אצטון / TCA / DTT משקעים מאפשר הסרת חלק מזהמים כגון שומנים, חומצות גרעין, מלחי ו / או תרכובות פנוליות כאשר תרכובות אלו נמצאים. כמו SDS, מולקולות אלה ולמנוע הגירה טוב במהלך IEF. בעקבות משקעים זה, יש צורך לשטוף את החלבונים זירז ידי אצטון / DTT, על מנת להסיר TCA כפי שהוא יכול להפריע IEF. מדגם הכנה טובה היא המפתח לתוצאות טובות. לשם כך, היא גם חיונית כדי למנוע זיהום של חלבונים מן הסביבה לעבוד עם כפפות אבקת חופשי כיבוד נהלי מעבדה טובים. מנקודת מבט טכנית, במסגרת פרוטוקול המתואר, השלבים הקריטיים ביותר להשגת כמות מספקת של חלבונים וטוהר שני שלבים. ראשית, שלב שבו שחיקה הרס מוחלט של התא חיונית לשחרור חלבונים, ושנית, טיהור חלבונים הכולל, המקיף את שלב הסרת רוב ה-DNA, שומנים ומזהמים אחרים שעשויים להפריע הגירה של חלבונים.

מדיה ופתרונות מחשב כף יד: 39 גרם תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (Difco); 1 ליטר מים מזוקקים. אגר V8: 200 מ&quot;ל V8 (קמפבל, ארה&quot;ב), 2g CaCO3 (Sigma), אגר 16G (DIFCO), 800 מ&quot;ל מים מזוקקים גרימת רעלן התקשורת: 1g K 2 HPO 4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO 4 7H 2 O, 10 מ&quot;ג FeEDTA, 2g חומצה גלוטמית L, סוכרוז 10g ב 1 ליטר של מים מזוקקים. תמוגה חוצץ: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td><td></td></tr><tr><td> טריס-HCL pH8 </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 50mm </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2G או 10 מ&quot;ל </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500ml </td><td> 10mm </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0.1mm </td><td> 0.5m </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200 מ&quot;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> השלם מעכב פרוטאז מיני </td><td> 1 לוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מים </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> רטיבות הצפת: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> כביסה חוצץ: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1mL </td><td> 0.1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr></table> Labelling חוצץ (חנות ב -18 מעלות צלזיוס aliquots קטן): <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> דשן </td><td> 140 מ&quot;ג </td><td> 7m </td></tr><tr><td> Thiourea </td><td> 50 מ&quot;ג </td><td> 2M </td></tr><tr><td> בחורים </td><td> 40 מ&quot;ג </td><td> 4% </td></tr><tr><td> טריס </td><td> 30 μL </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מים </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td></td></tr></table>

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן fusarium spp. תרבויות ללימודי proteomic

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria הם פטריות פילמנטיות מסוגל לייצר רעלים שונים. Fusarium mycotoxins כגון deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric חומצה, moniliformin, וכו &#39;.. יש השפעות שליליות על הבריאות הן של בני אדם וחיות וחלקם נחשבים כגורמים pathogenicity. מחקרים הראו proteomic להיות יעילים בפענוח מנגנוני ייצור הרעלן (Taylor et al., 2008), כמו גם לזיהוי גורמים פתוגניים פוטנציאל (נייר et al. 2007, Houterman et al. 2007) ב Fusaria. זה הופך אפוא יסוד להקים שיטות אמין להשוואה בין מחקרים proteomic כדי להסתמך על ההבדלים האמיתיים למצוא ביטוי חלבון בין ניסויים, זנים ומעבדות. הליך זה יתוארו לתרום ברמה מוגברת של סטנדרטיזציה של הנהלים proteomic על ידי שתי דרכים. פרוטוקול צולם משמש כדי להגדיל את רמת הפרטים ניתן לתאר בדיוק. יתר על כן, את הזמינות של נהלים סטנדרטיים כדי תהליך ביולוגי משכפל צריך להבטיח עמידות גבוהה יותר של נתונים, תוך לקיחה בחשבון גם את הגורם האנושי בתוך reproducibility הטכני של ההליך החילוץ. פרוטוקול המתואר דורש 16 ימים להשלמת שלו: ארבעה עשר ימים עבור תרבויות יומיים להפקת חלבונים (איור 1). בקצרה, זנים Fusarium גדלים על התקשורת מוצק במשך 4 ימים, הם מפוצלים אז ידנית ומועברים תוך גרימת מדיה שונה רעלן (יאו et al, 2008.) במשך 10 ימים. תפטיר נאסף על ידי סינון דרך שכבת Miracloth. גריסה מבוצעת בחדר קר. מפעילי שונים שבוצעו מיצוי משכפל (n = 3) על מנת לקחת בחשבון את ההטיה עקב שינויים טכניים (איור 2). הפקת התבסס על מאגר SDS / DTT כמתואר Taylor et al. (2008) עם שינויים קלים. מיצוי חלבון סך נדרש תהליך משקעים של חלבונים באמצעות Aceton / TCA / DTT כביסה חיץ בין לילה אצטון / DTT (דמות 3a, 3b). חלבונים היו resolubilized לבסוף חיץ חלבון תיוג לכמת. תוצאות ממוצא היו דמיינו את הג&#39;ל 1D (איור 4, SDS-PAGE), לפני שתמשיך 2D ג&#39;ל (IEF / SDS-PAGE). ההליך אותו ניתן ליישם עבור ניתוחים proteomic על התקשורת גדל אחרים ופטריות פילמנטיות אחרים (מיילס et al. 2007).

מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון מן<em&gt; Fusarium spp.</em

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

פטריות מסוג Fusarium הן פטריות Filamentous המסוגלות להפיק רעלנים שונים. מיקוטוקסינים של Fusarium, כגון deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, חומצה פוסארית (fusaric acid), ...

סרטון זה מתאר פרוצדורה המשמשת להשראת סינתזה של רעלנים במינים מסוימים, במקרה זה עבור Fusarium, ואת הפרוטוקול להפקת חלבוני השלם המשמש למחקרים פרוטאומיים במעבדתנו. משך הפרוצדורה הוא 16 ימים: ארבעה ימים לצמיחת הפטריות, 10 ימים לסינתזה של רעלנים ויומיים להפקת חלבונים. לאחר ארבעה ימים, המושבות עדיין צומחות באופן פעיל לעבר שולי הפתח.מיצליום אוורירי טיפוסי נוצר ונאסף באמצעות להב סטרילי תחת תא זרימה למינרית על ידי גירוד עדין של פני השטח של הצלחת. המיצליום נחתך לחמישה חלקים קטנים ונוסף לבקבוק ארלנמייר המכיל 25 milliliter של מצע להשראת רעלנים. השראת הרעלנים יעילה יותר בתנאי חושך.הבקבוק מכוסה בנייר אלומיניום. לאחר מכן, התרביות מנוערות במשך 10 ימים, 150 סבבים לדקה ב-25 מעלות צלזיוס. המצע הוא SAPH ומכיל תמיסת S row בריכוז גבוה.ידוע כי השילוב של חשיכה מקדם את סינתזת הרעלנים ב-ria. לאחר מכן, המיצליום מופרד מהנוזל המכיל את הרעלנים באמצעות סינון על רקמת MI close. ניתן להשתמש בנוזל למדידת תכולת הרעלנים, בעוד שהמיצליום משמש להפקת חלבונים.כדי למנוע שאריות של מצע גידול, המיצליום נשטף שלוש פעמים במים סטריליים. יש להסיר את עודפי המים, ולאחר מכן מוסיפים חנקן נוזלי, ואת הדגימות ניתן לשמור בטמפרטורה של -80°C או להשתמש בהן להפקת חלבונים. הליך הפקת החלבונים מבוסס על שימוש ב-SDS וב-TCA ומורכב משלבי ליזיס שונים.הוא יציע שיטה הכוללת מספר מפעילים לביצוע. במקביל להפקה של רפליקות ביולוגיות, מפעיל שונה מבצע כל רפליקה. הליך זה לוקח בחשבון הבדלים בתהליך ההפקה שעלולים להיווצר כתוצאה ממפעילים שונים המעבדים את הרפליקות.לפיכך, הדבר אמור להפגין חסנות גבוהה יותר בעת השוואת שכמיות ביולוגיות, שכן משתנה המפעיל נכלל בתוך השכמיות. במקביל, השימוש במספר מפעילים מקצר את זמן העיבוד. הדגימה נטחנת במכתש סטרילי באמצעות חנקן נוזלי עד שהמיצליום הופך לאבקה דקה.שלב זה הוא קריטי לאיכות וכמות החלבונים. המיצליום נאסף לשפורי Teflon של 10 ml ביחס של ארבע עשיריות מהנפח הכולל של השפורים. לאחר מכן מתווסף lysis buffer המכיל SDS ומעכבי פרוטאזה שונים.לאחר מכן מנערים את המבחנות עד לקבלת תמיסה הומוגנית. לאחר מכן, הדגימות מנוערים במשך 30 דקות בתא הקירור להומוגנציה נוספת. הדגימות מורתחות כדי להמיס את דפנות התאים וחלבונים הידרופובים. נוכחותו של SDS מונעת היווצרות של אוליגומרים המעכבים את שקיעת החלבונים.שלב של צנטריפוגציה מפריד בין שלושה שלבים. החלבונים תלויים בתמיסה השקופה שנאספת לפיתוליה חדשה הנשמרת על קרח. המשקע משמש לאחר מכן לביצוע שלב ליזיס שני, תוך חזרה על פעולות השCה (vortexing), ההרחאה והצנטריפוגציה.העליי שקיבלנו משני שלבי הליזיס מאחדים על מנת לבצע שיקיעה באמצעות באפר שיקיעה המכיל TCA (חומצה טריכלורואצטית) ו-DTT. הדגימות מאוחסנות למשך לילה, 16 שעות, בטמפרטורה של -20°C כדי לאפשר את שיקיעת החלבונים. החלבונים שוקעים לתחתית המבחנות כדי לשפר את תהליך השיקיעה.השפופרות סובבבות בצנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 45 דקות. המשקע כעת נראה בבירור. ניתן להסיר את העלייה באמצעות פפית של 5 מ"ל.לאחר מכן מסירים את ה-TCA על ידי הוספה של 25 מיליליטר של בופר שטיפה קר המכיל אצטון ו-DTT. לאחר מכן מנערים את התמיסה ביסודיות ובחוזקה. לאחר מכן מבצעים שלב צנטריפוגה נוסף.משקע החלבון צף כעת, לכן יש להקפיד על הסרת השכבה העליונה. מבוצע שלב שטיפה שני, הכולל הוספת בופר שטיפה, ניעור וסרטיפוגה. הסופרנאט מוסר והדגימה מיובשת באמצעות SpeedVac.כאשר הדגימה יבשה, החלבון הוא בעל עקביות דמוית אבקה. לאחסון, יש לאסוף את חלבון הדגימה מהמבחנה כדי להפחית את ההפרעה האלקטרוסטטית של הפלסטיק.נעשה שימוש באקדח אלקטרוסטטי ואת אבקת החלבון אוספים באמצעות שפכטל מתכת. לאחר מכן, החלבונים מושעים מחדש ישירות בתמיסת התיוג. משמש ל-2D למשך 30 דקות ב-800 g.מספיק להמסה של החלבון לפני המעבר לשלב היקר של הסימון ב-2D. איכות החלבון נבדקת באמצעות ג'ל SDS-PAGE במימד אחד, כפי שניתן לראות.היעדר מריחות משמעותיות בשולי הנתיב מעיד על איכות טובה של הדגימה.

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי לחקור את תהליכי ההתפתחות של ascospores ב Gibberella zeae, נוהל איסוף בתנאים סטריליים מצולם על מנת להפיק את הרמה הגבוהה ביותר של מידע עבור תיאור פרוטוקול. זה אמור להקל על שחזור של הניסוי, היבט חיוני כאשר ביטוי מלא הגנום בדיקות פרופיל מיושמים.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

אנו מדגימים שיטה לניתוח aflatoxins וביטוי transgene בזרעי בוטנים המכילים אותות RNA-התערבות להשתקת גני אפלטוקסין-סינתזה בflavus אספרגילוס הפטרייה. השליטה בתיווך RNAi של mycotoxins בצמחים לא דווחה בעבר.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; Pathosystem

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות שונים Clostridium הפרסטריגנים טוקנוסוגים של מזון מקומי נרכש, במיוחד אפסילון רעלן ייצור סוגי זן B ו-D, ללא שימוש בתאי אנאירובית.

העשרה ואיתור הפרסטרידיום של רעלים בדגימות מזון קמעונאי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

למד פרוטוקול סטנדרטי להפקת חלבון מ-Fusarium spp. לאחר אינדוקציית רעלן בת 10 ימים. השיטה ממזערת הטיות ניסיוניות ומייצרת דגימות חלבון איכותיות לניתוח פרוטאומי.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

גלה סרטונים נוספים