רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון מן

סרטון זה מתאר הליך המשמש להשראת סינזיס רעלן במינים מסוימים במקרה זה עבור הפרוטוקול למיצוי פרוטה שלם המשמש למחקרים פרוטאומיים במעבדה שלנו. אורך ההליך, 16 ימים, ארבעה ימים לגידול פטריות, 10 ימים לסינזיס רעלנים ויומיים למיצוי חלבון. לאחר ארבעה ימים, המושבות עדיין צומחות באופן פעיל לכיוון קצה הצלחת.

תפטיר אווירי טיפוסי נוצר ונאסף באמצעות להב סטרואידים מתחת לתיבת זרימת למינה על ידי גירוד עדין של פני הצלחת. התפטיר נחתך לחמש חתיכות קטנות ומתווסף לבקבוק המוקדם שלי המכיל 25 מיליליטר של חומר מעורר רעלן. השראת רעלנים יעילה יותר מאבק כהה.

הבקבוק מכוסה באלומיניום. לאחר מכן מנערים תרביות במשך 10 ימים, 150 סיבובים לדקה ב-25 מעלות צלזיוס. המדיום הוא של SAPH ומכיל תמיסת שורת S מרוכזת גבוהה.

מיטה יחד עם חושך ידועה כמקלה על סינזיס רעלים בריה. לאחר מכן התפטיר מופרד מהנוזל המכיל רעלן על ידי סינון על הרקמה הקרובה של MI. ניתן להשתמש בנוזל למדידת תכולת הרעלן בעוד שהתפטיר משמש למיצוי חלבון.

כדי להימנע מהעברת מדיה, התקרה שלי נשטפת שלוש פעמים במים סטריליים. יש לסלק את עודפי המים לאחר מכן, כמו להוסיף חנקן נוזלי, וניתן לאחסן דגימות במינוס 80 או להשתמש בהן למיצוי חלבון. הליך מיצוי החלבון מבוסס על שימוש ב-SDS ו-TCA ומורכב משלבי ליזה שונים.

הוא יציע שיטה הכוללת מספר מפעילים לביצוע. במקביל למיצוי שכפולים ביולוגיים, מפעיל אחר מבצע כל שכפול. הליך זה לוקח בחשבון הבדלים בהליך החילוץ שיכולים להיווצר על ידי מפעילים שונים המעבדים את השכפולים.

לכן הוא אמור להראות חוסן גבוה יותר כאשר משווים שכפולים ביולוגיים כאשר משתנה האופרטור נכלל בשכפול. יחד עם זאת, השימוש במספר אופרטורים מפחית את זמן העיבוד. הדגימה נטחנת בטיט סטרילי באמצעות חנקן נוזלי עד שהתפטיר הופך לאבקה דקה.

שלב זה חיוני לאיכות וכמות החלבונים. התפטיר נאסף בצינורות טפלון של 10 מילי, בפרופורציה של ארבע עשיריות מהנפח הכולל של הצינורות. לאחר מכן מתווסף מאגר ליזה המכיל SDS ומעכבי פרוטאז שונים.

לאחר מכן מנערים את הצינורות עד לקבלת תמיסה הומוגנית. לאחר מכן מנערים את הדגימות למשך 30 דקות בתא הקוד כדי להחזיר דגימות הומוגניות על מנת להמיס דפנות תאים וחלבונים הידרופוביים. נוכחותו של SDS מונעת היווצרות אוליגומרים המבטלים משקעים של חלבונים.

שלב צנטריפוגה מפריד בין שלושה שלבים. חלבונים תלויים בתמיסה השקופה שנאספת בשפופרת חדשה שנשמרת על קרח. לאחר מכן הפלטה משמשת לביצוע שלב שני, חזרה על המערבולת, הרתיחה והצנטריפוגה.

החטיפה משני הליזיס משולבת על מנת לבצע משקעים עם משקעים קרחונים, מאגר המכיל טונוס חומצי, חומצה תלת-חומצית ו-DTT. לאחר מכן הדגימות מאוחסנות למשך הלילה למשך 16 שעות במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר חלבון. חלבוני משקעים ממוקמים בתחתית הצינורות כדי לשפר את המשקעים.

צינורות הם צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 45 דקות. החך נראה כעת היטב. ניתן להשליך סופרנטנטים באמצעות כרית צינור של חמישה מיליליטר.

לאחר מכן מסירים TCA על ידי הוספת 25 מיליליטר של מאגר שטיפת קרחונים המכיל אצטון ו-DTT. לאחר מכן הוא מטלטל ביסודיות ובעוצמה. ואז מבוצע שלב צנטריפוגה חדש.

חיך החלבון צף כעת, ולכן יש לשלם מתח כדי לחסל את החטף. מבוצע שלב כביסה שני, הוספת כביסה, חיץ, ניעור וצנטריפוגה. חומר הסאפ מסולק והדגימה מיובשת באמצעות שקית מהירות.

כאשר הדגימה יבשה, החלבון הוא בעל עקביות דמוית אבקה. לאחסן. יש לאסוף את חלבון הדגימה מהצינור כדי להפחית את ההפרעה האלקטרוסטטית של הפלסטיק.

משתמשים באקדח אלקטרוסטטי ואבקת החלבון נאספת באמצעות מרית מתכת. לאחר מכן החלבונים מושעים ישירות במאגר התיוג. משמש למקף דו-ממדי 30 דקות ב-800 גרם לדקה.

מספיק להתמוססות. החלבון לפני שממשיכים לתיוג המקף הדו-ממדי היקר. איכות החלבון נבדקת על ג'ל SDS עמוד מימד אחד כפי שניתן לראות.

היעדר מריחות משמעותיות בשולי הנתיב מרמז על איכות טובה של הדגימה.