כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

במאמר וידאו זה, מוצגת שיטת real time PCR באמצעות בדיקות Solaris QPCR. בדיקות Solaris QPCR הן תכמימי פרוב (probe) ופריימר ספציפיים לגן, שנועדו לזהות את כל וריאנטים השחזור (splice variants) הידועים של גן נתון. תחת תנאי תרמוסייקלינג (thermocycling) אוניברסליים, הפרוב של Solaris כולל רכיב קושר של חריץ צר (minor groove binder moiety) ודיווח FA בקצה הפרימה חמיש, ומשתיק כהה (dark quencher) בקצה הפרימה שלישי.

במהלך שלב הדנטורציה ב-real-time PCR, הגשש נשאר בתמיסה והפלואורסצנציה של הדיווח FAM מוחלשת. במהלך שלבי ההיסנול (annealing) וההארכה (extension), הפריימרים והגשש נקשרים לרצף המטרה והקוונצ'ר (quencher) מופרד מה-FAM. ה-FAM מפיק אז אות פלואורסצנטי חזק כאשר הגשש מתפרק, והפלואורסצנציה מוחלשת שוב.

תוצאות ה-PCR בזמן אמת המתקבלות מדגימות את הרגישות, הסגוליות והשחזוריות של בדיעה יעילה זו. שלום, אני ג'יימס קובינו מצוות המחקר והפיתוח של Thermo Fisher Scientific בלאפייט, קולורדו. היום נראה לכם פרוצדורה להקמה של תגובת QPCR סטנדרטית באמצעות ריאגנטים לבדיקת ביטוי גנים של Lars QPCR.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור השתקה של גנים מטרתים באמצעות טכנולוגיות של הפרעה של RNA. אז בואו נתחיל. מערך ה-Solaris QPCR assay STEM מוגדר על ידי אלגוריתם ייחודי המשתמש בטכנולוגיות MGB ו-super base כדי לספק מערך בודד ונוח עבור 98% מהגנים המאושרים של בני אדם ועכברים.

בדרך כלל, תכנון של גששים (probes) ופריימרים ל-DNA מוגבל על ידי טמפרטורת ההמסה של הגשש, אשר נקבעת על ידי מספר וסוג הבסיסים. לרצפים ארוכים יותר ולרצפים עשירים ב-GC יש טמפרטורות המסה גבוהות יותר. רכיב קישור החריץ המינורי המשמש בגששי Solaris נכנס אל החריץ המינורי של סליל ה-DNA ומייצב את האינטראקציה בין הגשש לרצף המטרה.

דבר זה מעלה את טמפרטורת ההמסה, ובכך מאפשר שימוש בגששים קצרים יותר. אלגוריתם ה-Solaris משלב באופן סלקטיבי נוקלאוטידים משתנים הנקראים super bases כדי לשפר את יציבות קשרי ה-at ולמנוע התאגדות עצמית של GG ברצפים עשירים בגואנין. הדבר מאפשר שימוש ברצפי מטרה ששלא זאת, היו נמנעים מהם.

גמישות הרצף המוגברת המוענקת על ידי שימוש בטכנולוגיות אלה מאפשרת תכנון של מערכי פריימר-פרוב המזהים את כל וריאנטי השחול (splice variants) הידועים של גן בודד. שימו לב שבכל מקום שהיה הדבר אפשרי, שולבו באתר המטרה אזורים החוצים צמתים של אקסונים (exon junction spanning regions) כדי להגביר את הספציפיות על ידי מניעת הגברה של DNA גנומי מזוהם; מערכי הפריימר-פרוב שהתקבלו נותחו באמצעות BLAST בשלושה מאגרי נתונים שונים: גנומי, תמלול (transcript) ופסאודוגן, וזאת כדי להבטיח ספציפיות. יתרה מכך, מערכי הפריימר-פרוב של Solaris עברו אופטימיזציה מלאה כך שתנאי המחזור עבור כל בדיקות ה-QPCR הם זהים, מה שמאפשר להעריך את הביטוי של תמלילים שונים בהרצות PCR בודדות.

כדי להתחיל בתכנון ניסוי ה-qPCR R, זהו את הריאגנטים הדרושים לביצוע qPCR עבור הגן המבוקש באמצעות חיפוש המוצרים הגאוני (genius product search), שניתן למצוא בכתובת thermo.com/solaris. לחצו בתיבת השילת החיפוש ובחרו את האורגניזם המטרה המתאים. חיפוש המוצרים הגאוני יכול לעבד מזהי גנים רבים ושונים כאן.

הזינו את אחד ממונחי החיפוש המוצעים עבור הגן המבוקש, לאחר מכן לחצו על חיפוש, זהו את הגן המבוקש ולחצו על בחירה (select) בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את الريאגנטים השונים הזמינים עבור הגן המבוקש. לחצו על לשונית גילוי QPCR תחת בדיקת ביטוי הגנים של Solaris.

מוצגת בדיקת פריימר של גשש Solaris בעיצוב אופטימלי. בדיקה אחת זו תזהה את כל וריאנטים השחלוף (splice variants) הידועים של הגן הנבדק. לאחר זיהוי הסוכן המתאים לפריימר, מצאו בתפריט את מכשיר ה-QPCR שישמש לבדיקה וזהו את התערובת המוכנה (master mix) התואמת, בין אם זו התערובת המוכנה עם בקבוק נפרד של צבע ייחוס פסיבי ROX, תערובת ה-ROX, או תערובת ה-low ROX.

כאן נשתמש במכשיר ה-Roche light cycler 480, ולכן ייעשה שימוש ב-master mix plus rock vial. חשוב לוודא שגן ייחוס מתאים נכלל במחקר זה. ייעשה שימוש ב-B2M לאחר קבלת כל ריאגנטים ה-Solaris QP CR.

יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לשימוש. הריאגנטים יציבים למשך 12 חודשים לפחות. יש להימנע מהפשרה והקפאה חוזרת.

הכינו cDNA עבור qPCR על ידי ביצוע תגובות שעתוק הפוך (reverse transcription) על RNA של הדגימה. לאחר הכנת ה-cDNA, הפשירות את ה-Solaris assay ואת ה-master mix על קרח. ה-master mix מכיל את כל הרכיבים עבור qPCR כמותי למעט ה-assay הספציפי לגן; רכיבי התבנית כוללים thermostat, DNA polymerase dn ו-TPS rocks.

אם מכשיר ה-QPCR דורש rox ותמיסות באפר (buffer) תגובה קנייניות המכילות צבע כחול פנימי, יש להכין גם מים בדרגת PCR ופלטות QPCR. לאחר שהתמיסות הופשרו, ערבבו אותן באמצעות נקישה, ולאחר מכן סובבו אותן קצרה בcenterY (spin down) כדי למנוע אובדן של ריאגנטים. לאחר מכן, בתוך מבחנה של 15 milliliter, הכינו תערובת מאסטר (master mix) ובדיקת Solaris QPCR בריכוז one x.

ערבבו עבור מספר הדגימות הרצוי להרצה בלוחית של 384 בארות 5 µL של 2x master mix, ‏0.5 µL של 20X Solaris assay ומים בדרגת PCR, כך שהנפח הסופי בכל בארה יהיה 10 µL. לאחר הוספת ה-CDNA, ודאו שהכנתם כמות מספקת לשלוש חזרות של כל דגימה, כולל בקרת נטול תבנית (NTC) ובקרת נטול טרנסקריפטאזה הפוכה (no RT), כדי לבדוק ריאגנטים מזוהמים או DNA גנומי מזוהם, בהתאמה. לאחר מכן, העבירו את התערובת למאגר סטרילי.

לאחר מכן, באמצעות פפטה רב-ערוצית, העבירו את הנפח המתאים של one x master mix לבארות המתאימות בלוח ה-PCR. אם נעשה שימוש בלוחות לבנים, הצבע הכחול הכלול ב-master mix יסייע במעקב אחר התקדמות הפפטינג. ניתן לבחון מספר ספריות CDNA וגנים של ייחוס באותו לוח, כיוון שכל תנאי המחזורים זהים.

לאחר הוספת תערובת ה-one x master mix לבארים המתאימות, הוסיפו תבנית CD NA מדוללת לכל באר כך שהנפח הסופי יהיה 10 microliters, וערבבו באמצעות שאיבה ושחרור חוזר של הנוזל עם הפ pipette. אטמו את הפלטה באמצעות מדבקת איטום או איטום תרמי כפי שמוצג כאן.

הניחו את הפלטה בצנטריפוגה וסובבו אותה כדי להביא את הריאגנטים לתחתית הבאר ולהסיר בועות שעלולות להפריע לתוכנית קריאות הפלואורסצנציה. בטרמוסייקלר, יש להפעיל את הפולימרז בעל ההתחלה החמה (hot start polymerase) בתערובת ה-Solaris QPCR master mix בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות, מחזור אחד, ולאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 15 שניות, והארכה ב-60 °C למשך 60 שניות. פרוטוקול זה זהה עבור כל בדיקות ה-Soliris QPCR, ללא קשר לגן המוגבר.

לבסוף, הכניסו את הפלטה למכשיר ה-QPCR והפעילו את התוכנית. איור זה מדגים את הביצועים הגבוהים של בדיקות Solaris; כאן, הועשרו 10 דילוציות בן פי 10 של DNA סינתטי או CDNA באמצעות בדיקות ביטוי גנים של Solaris QPCR עבור CDC 20 ו-F two RL one. עקומות ההגברה בסולם לוגריתמי ועקומות סטנדרט עבור 10 דילוציות של Log 10 מדגימות את הביצועים הגבוהים של הבדיקה גם בריכוזי קלט נמוכים.

הביצועים של כל בדיקה נמדדים על ידי היעילות, ערך הטווח הדינמי הריבועי מתוך 10, דילולי log 10 וגבול הגילוי התחתון. הנתונים המוצגים כאן מדגימים את השחזוריות של בדיקות Solaris. במקרה זה, מנות של CD NA הועשרו בשני מעבדות מרוחקות גיאוגרפית באמצעות בדיקות ביטוי גנים של Solaris QPCR ותערובת מאסטר (master mix).

רמות הביטוי הזהות חושבו עבור שתי מטרות גנים בשני המעבדות. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין תגובת QPCR סטנדרטית באמצעות ריאגנטים לביטוי גנים של Solaris QPCR. בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור להכין תערובות מאסטר (master mixes) עם הריכוז הסופי הנכון של הריאגנטים ולכלול חזרות ביולוגיות ו/או טכניות מתאימות.

בנוסף, חיוני להגדיר את מכשיר ה-QPCR עם תנאי המחזוריות התרמית המתאימים עבור Solaris. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.