Name: כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו את שיטת ה-qPCR בזמן אמת באמצעות ערכות Solaris לניתוח ביטוי גנים. הטכנולוגיה מספקת ספציפיות גבוהה וזיהוי של כל גרסאות ה-splicing הידועות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. המדעית Thermo Solaris עיצוב qPCR Assay אלגוריתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלגוריתם משמש בעיצוב של Solaris qPCR בדיקה / פריימר זוגות אני מתאים את של כל רכיב ובכך לאפשר תנאים אופניים אוניברסלית. התאגדות של מג"ב, או קטין מחייב חריץ, מחצית בתוך החללית מגבירה את אני ומאפשרת בדיקות קצרות להיות מיועד assay גמישות רבה יותר וביצועים. כפי ששמה מרמז, MGBs הם סוג של אנטיביוטיקה שיכולה להשתלב חריץ הקטין של סליל ה-DNA. MGBs המצורפים בסוף 3 או 5 של בדיקה דנ"א. ב פתרון, פלואורסצנציה הכתב FAM של החללית הוא הרווה ידי מרווה Eclipse Dark. כאשר החללית נקשר ברצף היעד, וכתוצאה מכך לשנות קונפורמציה של בדיקה 3-D מאפשר אות ניאון חזק. עקידת לחקור את רצף ה-DNA היעד הוא התייצב על ידי מג"ב, אשר מאפשר את השימוש, בדיקות ספציפיות מאוד קצרים, תוך שמירה על טמפרטורת ההתכה מתאים PCR. לכן, זיהוי אות מתרחשת בשלב חישול של הגברה היעד. במהלך שלב ההארכה, בדיקה מג"ב disassociates ואת הקרינה הוא הרווה שוב. בגלל החללית disassociates, זה לא משפיע על יעילות ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפיין נוסף של האלגוריתם Solaris הוא השימוש Superbases. Superbases משתנים בסיסים שיש להם יכולות משופרות מחייב כדי לשפר את היציבות של AT אג"ח לחסל GG עצמית העמותה רצפים עשירים גואנן. יתר על כן, הם אינם סמוכים להרוות fluorophores מצורף בתחנה הסופית 5. בסיסים אלה ממוקמים באופן סלקטיבי, על פי האלגוריתם, כדי להרחיב את הזמינות של רצפי היעד. זה מאפשר להשתמש רצפים, כגון אזורים GC עשיר, שאחרת היה נמנע בעיצוב primers ו בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, את האלגוריתם Solaris משלבת אזורים אקסון צומת פורש באתר היעד. זה מגדיל סגוליות ידי הימנעות הגברה של הדנ"א הגנומי מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, האלגוריתם מזהה גם רצף קונצנזוס של כל גרסאות אחוי ידוע, כך שכל מכוסים על ידי בדיקה יחיד / קבוצה פריימר. לכן, רק אחד assay דרוש גן מסוים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, qPCR עיצוב Solaris אלגוריתם Assay מנצל פרמטרים מחמירים מאוד שיקולים עיצוב קריטי כולל תוכן אורך GC, אני, והוא משתרע של נוקלאוטידים הומוגנית. רצפים וכתוצאה מכך הם תפציץ ניתח עבור סגוליות 3 באמצעות מאגרי מידע שונים: גנומי, תמליל, ו pseudogene. </li></ol> 2. קבלת Solaris ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את המתאים Solaris ריאגנטים, בקר <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solaris</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם באתר לחץ על "חיפוש GENEius המוצר". כדי לעבור ישירות לחפש את המוצר GENEius, ללכת <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בתיבת החיפוש חקירה ולבחור את האורגניזם היעד המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיפוש מוצר GENEius יכול לעבד רבים מזהים גנים שונים. הנה, הזן אחד הציע מונחי חיפוש כדי למצוא את הגן של עניין, לרבות שופט Seq ההצטרפות, מזהה ג'ין, סמל ג'ין, תיאור הגן, את מזהה סנגר או מספר ההצטרפות, או מספר קטלוג. לאחר מכן, לחץ על "חיפוש". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגן של עניין ולחץ על "בחר" בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את המוצרים השונים Thermo Scientific זמין עבור הגן של עניין. תחת "מוצרים" בחר את "qPCR איתור" Tab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת "Assay Gene Expression סולאריס" הכותרת, תוכלו לראות את אחד מעוצב בצורה אופטימלית Solaris בדיקה / assay פריימר. זה assay אחד לא לכסות את כל גרסאות אחוי ידוע היעד הגן שלך. בחרו את הכמות הרצויה. הם זמינים 100, 200, 400, ו 1000 X 25 תגובות μl (אם assay מזוהה עשה סדר, אל, את גודל חבילת 100 לא יהיה זמין). לחץ על "הוסף לסל". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בחר את תערובת אב מתאים Cycler התרמית אשר ישמשו. כדי לקבוע איזו תערובת מאסטר יעבדו הכי טוב עם המכשיר זמין, לחץ על "גלה אילו מיקס מאסטר עובד הכי טוב עם Cycler PCR שלך!" </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את Cycler qPCR אשר ישמשו בתפריט כדי לקבוע אילו לערבב לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל חלון החיפוש המוצר GENEius, ובחר לערבב מאסטר המתאים. תמהיל המאסטר מגיע 100, 200, 400, ו 1000 גדלים התגובה. לחץ על "הוסף לסל". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנים התייחסות המוצעות cDNA Verso ערכות סינתזה יכול להיות גם הורה לניתוח qRT-PCR להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר qPCR ריאגנטים Solaris להגיע, לאחסן אותם ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. ריאגנטים הבאות צריכות להתקבל: פתרון 20X המכיל שני primers סיפק 800 nM כל אחד בדיקה גנים ספציפיים הניתנים 200 ננומטר, sequence מידע עבור בדיקה והן primers, ו-Solaris הביטוי qPCR ג'ין מיקס מאסטר בריכוז 2X. Solaris הביטוי qPCR מבחני ג'ין יציבים עבור מינימום של 12 חודשים. הימנע להקפיא חזר הפשרה. </li></ol> 3. qPCR ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין פרוטוקול qPCR עם cDNA. RNA סה"כ צריך להיות חילוץ באמצעות שיטה טור ספין. מדעי Thermo ערכת cDNA Verso סינתזה מומלץ שעתוק לאחור כדי ליצור cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו qPCR על ידי הפשרת primers, בדיקות, ומערבבים מאסטר על הקרח. כמו כן יש על יד מים PCR כיתה ו אטום צלחות qPCR לבן, אשר יכולים לשפר את הרגישות של ה-PCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל מאסטר מכיל את כל הרכיבים בפעם PCR אמיתי כולל: פולימראז Thermo-Start 1) ה-DNA, גרסה חמה ההתחלה של פולימראז הדנ"א Thermoprime. סוג זה של פולימראז משמש למניעת הלא ספציפית הגברה במהלך התגובה, להגדיר דורש שלב ההפעלה על 95 מעלות צלזיוס 15 דקות. 2) dNTPs בתמהיל Solaris הורים, dTTP מחליף dUTP כדי למקסם את היעילות הגברה 3) המאגר התגובה קנייניות, מותאם לעבודה עם Solaris פריימר / מבחני בדיקה. זה חיץ תגובה מכיל צבע כחול כדי להגביר את הניגודיות בין מגיב ופלסטיק. 4) רוקס, אם המכשיר שלך דורש qPCR רוקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרונות יש להפשיר, לערבב ידי מצליף הצינור (לא מערבולת). ספין אותם כדי למנוע אובדן של מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין 15 מ"ל סטרילי צינור פלקון להגדיר את תערובת תגובה עבור הגן של עניין, ועוד אחד של הגן התייחסות, קנה המידה בהתאם למספר דוגמאות. הכינו מספיק כאלה כי שלושה משכפל יכול להיות מוכן מדגם זה, כולל שליטה אין תבנית (NTC) דגימות עקומת רגיל, אם שיטת עקומת סטנדרט ישמש לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 96 היטב, לערבב את הדברים הבאים: 5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 0.5 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרונה, פעם cDNA הוא הוסיף יהיה 25 μL. עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 384 לערבב היטב את הדברים הבאים: 12.5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 1.25 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרון, לאחר cDNA הוא הוסיף יהיה 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor רב ערוצי, להעביר את תערובת מאסטר בארות המתאים הצלחת. צבע כחול הכלולים לערבב האב יסייע להתקדמות pipetting מעקב על הצלחות הלבנות. לאחר מכן יש להוסיף את תבנית 1-5 cDNA μL (עבור צלחת 96 באר) או 1-2 μL של תבנית cDNA (עבור 384 צלחת היטב). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מניחים את צלחת בצנטריפוגה ספין למטה כדי להסיר בועות, כמו אלה יפריע בקריאה פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית Cycler תרמי: האנזים חייב להיות מופעל עם 95 מעלות צלזיוס 15 דקות (1 מחזור). ואז 40 מחזורים של 95 ° C, denaturation למשך 15 שניות, חישול והסיומת ב 60 ° C למשך 60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המכשיר qPCR. הפעל את התוכנית. </li></ol> נציג qPCR התוצאות באמצעות Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מבחני Solaris לתת זיהוי אמין גם בריכוזים נמוכים מאוד קלט, כמו להישפט על ידי היעילות PCR וערכים r2. עשר של פי 10 דילולים של cDNA מסונתז מתוך רצף RNA סינתטי amplicon או amplicon רצף הדנ"א היה מוגבר על מכשיר ABI 7900HT באמצעות Solaris הביטוי qPCR Assay ג'ין עבור F2RL1 או CDC20, בהתאמה. יומן בהיקף העיקולים הגברה ועקומות תקן מוצגים יחד עם הביצועים של כל assay כולל יעילות, ערך r2, טווח דינמי מתוך 10 LOG10 דילולים, ואת הגבול התחתון של זיהוי. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מבחני Solaris לתת תוצאות עקביות אפילו בין חוקרים במעבדות שונות. siRNAs מיקוד ALDOA ו PPIB, כמו גם בקרת Non-מיקוד (NTC), היו transfected לתאי הלה ב nM 100, 10, 1 ו 0.1 ריכוזי הסופי. תאים נקצרו ו-RNA בודד הכולל 48 שעות שלאחר הטיפול. cDNA היה מסונתז באמצעות Thermo Verso מדעי cDNA ערכת סינתזה. Aliquot של cDNA היה מוגבר בשתי מעבדות מופרדים גיאוגרפית באמצעות Solaris הביטוי qPCR מבחני ג'ין לגילוי ALDOA, PPIB ו GAPDH על LightCycler רוש 480 (384 גם) פלטפורמה. מציאה חושבה בשיטת ΔΔCq (מנורמל ל GAPDH התייחסות גנים NTC שטופלו בתאים). רמות אותו מציאה היו הפגינו הן מטרות גנים בין שני החוקרים בשני האתרים.

המחברים של מאמר זה הינם עובדים של Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris מבחני qPCR לספק שיטה פשוטה, משופרת עבור ביצוע ניתוח qPCR. באמצעות אלגוריתם חומרה גבוהה, שילוב מג&quot;ב טכנולוגיה Superbases, אלה קבוצות פריימר ועל בדיקה למקסם את נאמנות וחוסנם של ניסויים qPCR. אחת פריימר ולהגדיר בדיקה מזהה כל גרסאות אחוי ידוע של גן מסוים. אתר היעד, במידת האפשר, כולל אזורים אקסון פורש, על מנת להבטיח כי הדנ&quot;א הגנומי לא מוגבר. תכונות אלה מאפשרות להריץ בו זמנית מספר רב של דגימות, מקטינים מאד את משך הזמן הדרוש כדי לבצע ניסויים מורכבים. מאז לערבב הראשי הוא כחול, אפשר להשתמש בצלחות אטום לבן, לשפר את הרגישות של qPCR, מבלי לאבד את תחושת pipetting. Taken הכל ביחד, את התכונות העיצוב של Assay Solaris qPCR להפוך את זה assay assay qPCR רומן פשוט, אך בעל ביצועים גבוהים, כי הוא גם ספציפי וחזק.

כמותי real-time pcr באמצעות המדעית thermo solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

QPCR הביטוי Solaris Assay ג&#39;ין הוא סוג חדש של קבוצת פריימר / בדיקה, שנועדה לפשט את תהליך qPCR תוך שמירה על רגישות ודיוק של assay. פריימר / בדיקה אלה סטים מוגדרים מראש שנועדו% 98&gt; של הגנום האנושי עכבר ושיפורים תכונה משמעותית מטכנולוגיות זמין קודם לכן. שיפורים אלה התאפשרו בזכות אלגוריתם רומן העיצוב, שפותחו על ידי מומחים Thermo Scientific ביואינפורמטיקה. מספר תכונות נוחות שולבו Assay Solaris qPCR כדי לייעל את תהליך ביצוע כמותי בזמן אמת PCR. ראשית, פרוטוקול דומה חלופות מועסקים בדרך כלל, ולכן השיטות במהלך qPCR צפויים להיות מוכרים. שנית, תמהיל הראשי הוא כחול, מה שהופך את ההגדרה תגובות qPCR קל יותר לעקוב. שלישית, התנאים רכיבה תרמית זהים עבור כל מבחני (גנים), כך שניתן להפעיל דגימות רבות בזמן וצמצום הפוטנציאל לטעויות. לבסוף, בדיקה ורצף מידע פריימר מסופקים, לפשט את תהליך הפרסום. כאן, אנו מדגימים כיצד להשיג את ריאגנטים המתאימים Solaris השימוש במוצר GENEius החיפוש תכונה למצוא באתר האינטרנט של ההזמנה (www.thermo.com / Solaris) ואת אופן השימוש ריאגנטים Solaris לביצוע qPCR בשיטה עקומה סטנדרטית.

QPCR הביטוי Solaris מבחני ג&#39;ין הם הרומן תוכנן מראש פריימר / בדיקה qPCR שילובים שנועדו לפשט את תהליך qPCR מבלי להקריב את הספציפיות וחוסנם של assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

ערכת בדיקת ביטוי הגנים Solaris qPCR היא סוג חדש של סט פריימרים/פרובים, שנועדה לפשט את תהליך ה-qPCR תוך שמירה על הרגישות ו...

במאמר וידאו זה, מוצגת שיטת real time PCR באמצעות בדיקות Solaris QPCR. בדיקות Solaris QPCR הן תכמימי פרוב (probe) ופריימר ספציפיים לגן, שנועדו לזהות את כל וריאנטים השחזור (splice variants) הידועים של גן נתון. תחת תנאי תרמוסייקלינג (thermocycling) אוניברסליים, הפרוב של Solaris כולל רכיב קושר של חריץ צר (minor groove binder moiety) ודיווח FA בקצה הפרימה חמיש, ומשתיק כהה (dark quencher) בקצה הפרימה שלישי.במהלך שלב הדנטורציה ב-real-time PCR, הגשש נשאר בתמיסה והפלואורסצנציה של הדיווח FAM מוחלשת. במהלך שלבי ההיסנול (annealing) וההארכה (extension), הפריימרים והגשש נקשרים לרצף המטרה והקוונצ'ר (quencher) מופרד מה-FAM. ה-FAM מפיק אז אות פלואורסצנטי חזק כאשר הגשש מתפרק, והפלואורסצנציה מוחלשת שוב.תוצאות ה-PCR בזמן אמת המתקבלות מדגימות את הרגישות, הסגוליות והשחזוריות של בדיעה יעילה זו. שלום, אני ג'יימס קובינו מצוות המחקר והפיתוח של Thermo Fisher Scientific בלאפייט, קולורדו. היום נראה לכם פרוצדורה להקמה של תגובת QPCR סטנדרטית באמצעות ריאגנטים לבדיקת ביטוי גנים של Lars QPCR.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור השתקה של גנים מטרתים באמצעות טכנולוגיות של הפרעה של RNA. אז בואו נתחיל. מערך ה-Solaris QPCR assay STEM מוגדר על ידי אלגוריתם ייחודי המשתמש בטכנולוגיות MGB ו-super base כדי לספק מערך בודד ונוח עבור 98% מהגנים המאושרים של בני אדם ועכברים.בדרך כלל, תכנון של גששים (probes) ופריימרים ל-DNA מוגבל על ידי טמפרטורת ההמסה של הגשש, אשר נקבעת על ידי מספר וסוג הבסיסים. לרצפים ארוכים יותר ולרצפים עשירים ב-GC יש טמפרטורות המסה גבוהות יותר. רכיב קישור החריץ המינורי המשמש בגששי Solaris נכנס אל החריץ המינורי של סליל ה-DNA ומייצב את האינטראקציה בין הגשש לרצף המטרה.דבר זה מעלה את טמפרטורת ההמסה, ובכך מאפשר שימוש בגששים קצרים יותר. אלגוריתם ה-Solaris משלב באופן סלקטיבי נוקלאוטידים משתנים הנקראים super bases כדי לשפר את יציבות קשרי ה-at ולמנוע התאגדות עצמית של GG ברצפים עשירים בגואנין. הדבר מאפשר שימוש ברצפי מטרה ששלא זאת, היו נמנעים מהם.גמישות הרצף המוגברת המוענקת על ידי שימוש בטכנולוגיות אלה מאפשרת תכנון של מערכי פריימר-פרוב המזהים את כל וריאנטי השחול (splice variants) הידועים של גן בודד. שימו לב שבכל מקום שהיה הדבר אפשרי, שולבו באתר המטרה אזורים החוצים צמתים של אקסונים (exon junction spanning regions) כדי להגביר את הספציפיות על ידי מניעת הגברה של DNA גנומי מזוהם; מערכי הפריימר-פרוב שהתקבלו נותחו באמצעות BLAST בשלושה מאגרי נתונים שונים: גנומי, תמלול (transcript) ופסאודוגן, וזאת כדי להבטיח ספציפיות. יתרה מכך, מערכי הפריימר-פרוב של Solaris עברו אופטימיזציה מלאה כך שתנאי המחזור עבור כל בדיקות ה-QPCR הם זהים, מה שמאפשר להעריך את הביטוי של תמלילים שונים בהרצות PCR בודדות.כדי להתחיל בתכנון ניסוי ה-qPCR R, זהו את הריאגנטים הדרושים לביצוע qPCR עבור הגן המבוקש באמצעות חיפוש המוצרים הגאוני (genius product search), שניתן למצוא בכתובת thermo.com/solaris. לחצו בתיבת השילת החיפוש ובחרו את האורגניזם המטרה המתאים. חיפוש המוצרים הגאוני יכול לעבד מזהי גנים רבים ושונים כאן.הזינו את אחד ממונחי החיפוש המוצעים עבור הגן המבוקש, לאחר מכן לחצו על חיפוש, זהו את הגן המבוקש ולחצו על בחירה (select) בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את الريאגנטים השונים הזמינים עבור הגן המבוקש. לחצו על לשונית גילוי QPCR תחת בדיקת ביטוי הגנים של Solaris.מוצגת בדיקת פריימר של גשש Solaris בעיצוב אופטימלי. בדיקה אחת זו תזהה את כל וריאנטים השחלוף (splice variants) הידועים של הגן הנבדק. לאחר זיהוי הסוכן המתאים לפריימר, מצאו בתפריט את מכשיר ה-QPCR שישמש לבדיקה וזהו את התערובת המוכנה (master mix) התואמת, בין אם זו התערובת המוכנה עם בקבוק נפרד של צבע ייחוס פסיבי ROX, תערובת ה-ROX, או תערובת ה-low ROX.כאן נשתמש במכשיר ה-Roche light cycler 480, ולכן ייעשה שימוש ב-master mix plus rock vial. חשוב לוודא שגן ייחוס מתאים נכלל במחקר זה. ייעשה שימוש ב-B2M לאחר קבלת כל ריאגנטים ה-Solaris QP CR.יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לשימוש. הריאגנטים יציבים למשך 12 חודשים לפחות. יש להימנע מהפשרה והקפאה חוזרת.הכינו cDNA עבור qPCR על ידי ביצוע תגובות שעתוק הפוך (reverse transcription) על RNA של הדגימה. לאחר הכנת ה-cDNA, הפשירות את ה-Solaris assay ואת ה-master mix על קרח. ה-master mix מכיל את כל הרכיבים עבור qPCR כמותי למעט ה-assay הספציפי לגן; רכיבי התבנית כוללים thermostat, DNA polymerase dn ו-TPS rocks.אם מכשיר ה-QPCR דורש rox ותמיסות באפר (buffer) תגובה קנייניות המכילות צבע כחול פנימי, יש להכין גם מים בדרגת PCR ופלטות QPCR. לאחר שהתמיסות הופשרו, ערבבו אותן באמצעות נקישה, ולאחר מכן סובבו אותן קצרה בcenterY (spin down) כדי למנוע אובדן של ריאגנטים. לאחר מכן, בתוך מבחנה של 15 milliliter, הכינו תערובת מאסטר (master mix) ובדיקת Solaris QPCR בריכוז one x.ערבבו עבור מספר הדגימות הרצוי להרצה בלוחית של 384 בארות 5 µL של 2x master mix, ‏0.5 µL של 20X Solaris assay ומים בדרגת PCR, כך שהנפח הסופי בכל בארה יהיה 10 µL. לאחר הוספת ה-CDNA, ודאו שהכנתם כמות מספקת לשלוש חזרות של כל דגימה, כולל בקרת נטול תבנית (NTC) ובקרת נטול טרנסקריפטאזה הפוכה (no RT), כדי לבדוק ריאגנטים מזוהמים או DNA גנומי מזוהם, בהתאמה. לאחר מכן, העבירו את התערובת למאגר סטרילי.לאחר מכן, באמצעות פפטה רב-ערוצית, העבירו את הנפח המתאים של one x master mix לבארות המתאימות בלוח ה-PCR. אם נעשה שימוש בלוחות לבנים, הצבע הכחול הכלול ב-master mix יסייע במעקב אחר התקדמות הפפטינג. ניתן לבחון מספר ספריות CDNA וגנים של ייחוס באותו לוח, כיוון שכל תנאי המחזורים זהים.לאחר הוספת תערובת ה-one x master mix לבארים המתאימות, הוסיפו תבנית CD NA מדוללת לכל באר כך שהנפח הסופי יהיה 10 microliters, וערבבו באמצעות שאיבה ושחרור חוזר של הנוזל עם הפ pipette. אטמו את הפלטה באמצעות מדבקת איטום או איטום תרמי כפי שמוצג כאן.הניחו את הפלטה בצנטריפוגה וסובבו אותה כדי להביא את הריאגנטים לתחתית הבאר ולהסיר בועות שעלולות להפריע לתוכנית קריאות הפלואורסצנציה. בטרמוסייקלר, יש להפעיל את הפולימרז בעל ההתחלה החמה (hot start polymerase) בתערובת ה-Solaris QPCR master mix בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות, מחזור אחד, ולאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 15 שניות, והארכה ב-60 °C למשך 60 שניות. פרוטוקול זה זהה עבור כל בדיקות ה-Soliris QPCR, ללא קשר לגן המוגבר.לבסוף, הכניסו את הפלטה למכשיר ה-QPCR והפעילו את התוכנית. איור זה מדגים את הביצועים הגבוהים של בדיקות Solaris; כאן, הועשרו 10 דילוציות בן פי 10 של DNA סינתטי או CDNA באמצעות בדיקות ביטוי גנים של Solaris QPCR עבור CDC 20 ו-F two RL one. עקומות ההגברה בסולם לוגריתמי ועקומות סטנדרט עבור 10 דילוציות של Log 10 מדגימות את הביצועים הגבוהים של הבדיקה גם בריכוזי קלט נמוכים.הביצועים של כל בדיקה נמדדים על ידי היעילות, ערך הטווח הדינמי הריבועי מתוך 10, דילולי log 10 וגבול הגילוי התחתון. הנתונים המוצגים כאן מדגימים את השחזוריות של בדיקות Solaris. במקרה זה, מנות של CD NA הועשרו בשני מעבדות מרוחקות גיאוגרפית באמצעות בדיקות ביטוי גנים של Solaris QPCR ותערובת מאסטר (master mix).רמות הביטוי הזהות חושבו עבור שתי מטרות גנים בשני המעבדות. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין תגובת QPCR סטנדרטית באמצעות ריאגנטים לביטוי גנים של Solaris QPCR. בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור להכין תערובות מאסטר (master mixes) עם הריכוז הסופי הנכון של הריאגנטים ולכלול חזרות ביולוגיות ו/או טכניות מתאימות.בנוסף, חיוני להגדיר את מכשיר ה-QPCR עם תנאי המחזוריות התרמית המתאימים עבור Solaris. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

פרוטוקול זה מתאר בדיקת qRT-PCR בעלת תפוקה גבוהה לניתוח חתימות ביטוי IFN מסוג I ו-III. הבדיקה מפלה הבדלים בזוגות בסיסים בודדים בין התעתיקים הדומים מאוד של גנים אלה. באמצעות הרכבת אצווה ופיפטינג רובוטי, הבדיקות עקביות וניתנות לשחזור.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

ניתן להבחין בין ניתן להבחין בין כרומוזומי מעצבים של פרויקט גנום השמרים הסינתטיים, Sc2.0, לבין עמיתיהם המקוריים באמצעות בדיקת גנוטיפ מבוססת PCR הנקראת PCRTagging, שיש לה נקודת קצה של נוכחות/היעדרות. כאן אנו מתארים שיטת זיהוי PCR בזמן אמת בתפוקה גבוהה עבור גנוטיפ PCRTag.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

זהו פרוטוקול זמן cost effective במבחנה חוקרים על מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, ובגלל זה צורך רפואי קליניות מאוד בניהול סרטן.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים באתר, במיוחד קרקע בתפו פתוגנים צמח, הוא חיוני כדי למנוע התפשטות של מחלות בתחום עיצוב והפקת inoculum. השיטה שפותחה כאן באמצעות מערכת זיהוי PCR נייד בזמן אמת מאפשר האבחון באתר בתנאי שדה.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

למדו את שיטת ה-qPCR בזמן אמת באמצעות ערכות Solaris לניתוח ביטוי גנים. הטכנולוגיה מספקת ספציפיות גבוהה וזיהוי של כל גרסאות ה-splicing הידועות.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

גלה סרטונים נוספים