Name: פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למדו לייצר טטרמרים של KLRG1 לניתוח ליגנדים במחקר אימונולוגי באמצעות חיידקים וביטוי חלבון מושרה IPTG. פרוטוקול זה מספק כלי אמין לחקר אינטראקציות KLRG1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר Naidenko עזרה אופטימיזציה התנאים refolding. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק מחקר AI58181 אל לורן Brossay. סינדי Banh נתמך על ידי NIH NRSA F31 AI080230. סטפני Terrizzi וסינדי Banh לתרום באופן שווה על עבודה זו.

הכנת גופים הכללה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 4 x 500 מ"ל צלוחיות של שחפת שכל אחת מהן מכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו carbenicillin chloramphenicol עם תרבות הלילה של חיידקים ביטוי לבנות KLRG1 פלסמיד. כאשר מגיע OD 0.6 בבית 600 ננומטר, להשרות עם תוספת של 0.4 M ו - IPTG דגירה והתרבות של 4 שעות נוספות רועד ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים שנקטפו ב-pH = 8.0 חיץ resuspension (50 מ"מ טריס-HCl, 25% (W / V) סוכרוז, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). הערה: כדורי אפשר להקפיא בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת לא יותר מ 60 מ"ל של חיידקי resuspensions בכוס פוליפרופילן. אם יש צורך להסתגל 60 מ"ל עם TE חיץ pH 8.0 ומערבבים לתערובת במהירות וחצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי בחישה לתערובת להוסיף טיפה חכם: ליזוזים (סופי = 1 מ"ג / מ"ל), MgCl2 (סופי = 5 מ"מ), 2 מ"ג DNAse אני ב גליצרול 50% הכילו 75 mM NaCl, טריטון-X100 (סופי = 1%), DTT ( סופי = 10 mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הפתרון על קרח דק 1.5 ו בצנטריפוגה lysates ב 5000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ"ל של pH = 8.0 חיץ לשטוף (50 מ"מ טריס-HCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קרח, sonicate פתרון 1.5 דקות עד גלולה הוא resuspended לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב 5000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף 5 פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 5b עם חיץ לשטוף ללא צנטריפוגות טריטון, X-100 ו resuspend ב 4 מ"ל של הצפת TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את משקל רטוב הכללת גופים slurry ולאחסן TE חיץ בריכוז של 30 עד 100 מ"ג / מ"ל. </li></ol> Refolding של KLRG1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את L 1 של refolding pH = 8.0 חיץ (0.4 מ 'ארגינין-HCl, 0.1 מ' טריס pH 8-8.3, 2 mM EDTA, 0.2 מ"מ PMSF, 3 EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות, GSH 5 מ"מ GSSG 0.5 מ"מ) צמרמורת עד 4 ° C תוך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הגופות הכללת להזרקה לתוך תערובת קיפול: הוא אידיאלי לעשות 5 10 זריקות כל אחד עם ריכוז 0.5 0.25 מיקרומטר, כך הריכוז הסופי של החלבון יהיה 2 3 מיקרומטר. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את נפח של 50 מ"ג של slurry הכללת גופים 7 M GnHCl עם 10 מ"מ β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הכללת גופים / תערובת GnHCl על 37 מעלות צלזיוס למשך 3-40 דק 'ו מערבולת כל 5 דקות כדי להבטיח התכה מלאה (slurry יתברר כאשר נמס לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות מקסימום למשך 30 דקות ב microcentrifuge ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. אין להעביר כל אחד גלולה שחור קטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונן את עוצמת הקול עם חיץ הזרקה (3 M GnHCl, NaAcetate 10 מ"מ, ה-pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1 מ"ל של גופים הכללת מדולל כל שעה. כאשר מזריקים, מערבבים במהירות גבוהה, מוסיפים 1 מ"ל של ירידה הכללת גופים מדולל עם ירידה של 2 שניות בין כל טיפה. כאשר מתבצעת הזרקה, ומערבבים במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לילה ערבוב במהירות נמוכה ב 4 ° C. </li></ol> ריכוז תגובות שב וקיפל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות פרוטוקול של Millipore, לרכז את L 1 של התגובה (0.22 מיקרומטר מסונן) מראש מסונן refolding באמצעות Amicon מעורבב תא YM10 קרום 10K NMWL ultrafiltration (Millipore) ל ~ 10 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז כדי מ"ל 2 ≤ באמצעות Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> טיהור KLRG1 tetramer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת AKTAFPLC על 4 מעלות צלזיוס על פי הוראות GE Healthcare. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הטופס מונומר של KLRG1 ידי כרומטוגרפיה גודל הרחקה באמצעות Sephacryl S-200 16/60 ברזולוציה גבוהה עמודה (GE Healthcare) ב 20 HEPES מ"מ ו 150 מ"מ NaCl. (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז כדי מ"ל 1 באמצעות Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אנזים בירה על פי פרוטוקול של בלהיטות כדי biotinylate מונומר KLRG1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביוטין חינם מסולק על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל כמו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KLRG1 מולקולה היא tetramerized ידי ערבוב KLRG1 מונומר עם 4 לקפל טוחנת עודף PE streptavidin מצומדות (BD Biosciences). </li></ol> נציג תוצאות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"></a> באיור 1. תוצאות חיוביות נציג מן כרומטוגרפיה FPLC אקטע גודל הרחקה של וקיפלתי KLRG1. הגרף מראה את ההפרדה של מונומר (83.52 מ"ל), דימר (56.36 גרם), ו multimer (36.26 מ"ל) טופס של KLRG1 וקיפלתי. לשיא מ"ל 94.25 מייצג את חילופי חיץ.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

בפרוטוקול זה, הראה כיצד לטהר, biotinylate ו KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramer ניתן להשתמש בתווית KLRG1 ligands ידי cytometry הזרימה. למרות התנאים refolding יצטרך להיבדק באופן אמפירי של חלבון זה לזה, C-סוג לקטינים יכול להיות tetramerized באמצעות פרוטוקול דומה. באמצעות חלבונים tetramerized כמו בדיקות, ligands ל-C מסוג קולטני יתום לקטינים שעלולים להיות מזוהה.

<table><tbody><tr><td>אנזים BirA ובופר</td><td>ערכה לביוטיניליציה</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכבי פרוטאז Mini מלאות, ללא EDTA</td><td>ריאגנט</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>תא ערבוב Amicon</td><td>ציוד</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>ממברנת אולטרה-פילטרציה YM10 NMWL 10K</td><td>ציוד סינון</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>מרכז 15 ml YM10</td><td>ציוד סינון</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>ציוד</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>עמודה בעלת רזולוציה גבוהה Sephacryl S-200 16/60</td><td>ציוד</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidin PE</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>או שווה ערך</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לייצור klrg1 tetramer

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

תא רוצח לקטינים כמו קולטן ה-G1 (KLRG1) הוא סוג II הטרנסממברני גליקופרוטאין קולטן מעכבות השייכים superfamily לקטינים כמו סוג ג&#39;. KLRG1 קיים הן מונומר וכן homodimer דיסולפיד צמודות. קולטן זה היטב נשמרת נמצא על תאים NK בוגרת ביותר הופעל לאחרונה, כמו גם על קבוצת תאים T מפעיל / זיכרון. שימוש KLRG1 tetramer כמו גם שיטות אחרות, דואר, N-, ו-R-cadherins זוהו KLRG1 ligands. אלה Ca 2 + תלויי תאים תאים מולקולות הדבקה כוללת של תחום תאי המכיל חמש חזרות cadherin אחראי תאים תאים אינטראקציות, תחום הטרנסממברני ואת תחום cytoplasmic המקושר cytoskeleton אקטין. הדור של tetramer KLRG1 היה חיוני לזיהוי של KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer היא גם כלי ייחודי כדי להבהיר את cadherin תפקידים לשחק KLRG1 בוויסות התגובה החיסונית ושלמות הרקמות.

פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.

פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

קולטן דמוי לקטין של תאי קטלר G1 ‏(KLRG1) הוא קולטן מעכב מסוג גליקופרוטאין חלבוני חוצה ממברנה מסוג II, השייך למשפחת העל של הדמויי לקטין מסוג C.

שלום, אני סטפני רזי מהמעבדה של לורן פארס במחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה באוניברסיטת בראון. היום נראה לכם פרוצדורה להפקה של K LRG one Tetramers. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציות קוהרנטיות של K LRG one.נתחיל בתהליך. ראשית, החדירו חיידקים המבטאים את מבנה הפלסמיד K LRG one לארבעה בקבוקים של 500 milliliter של TB buffer המכיל אנטיביוטיקה מתאימה, וגדלו אותם ב-37 °C עם ניעור. כאשר ה-OD מגיע ל-0.6 ב-600 nanometers, גרמו להבעה באמצעות מקדם T7 על ידי הוספה של 0.4 molar IPTG, ודגרו את התרבית למשך ארבע שעות נוספות עם ניעור ב-37 °C. לאחר הדגרה של ארבע שעות, העבירו את החיידקים לאנבובי צנטריפוגה וסובבו את התרביות למשך 20 דקות ב-3000 RPM וב-4 °C.במידת הצורך, ניתן להקפיא את המשקעים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס בשלב זה לשימוש במועד מאוחר יותר. השהו מחדש את התאים שנאספו ב-30 milliliters של בופר להשהה (Resus suspension buffer). לאחר מכן, איחדו את השהיות החיידקים לנפח של עד 60 milliliters בכלי פוליפרופילן.במידת הצורך, השלימו את הנפח הכולל ל-60 milliliters באמצעות TE buffer PH 8 נוסף, וערבבו את התערובת במהירות נמוכה על גבי פלטה מחוממת עם בוחש מגנטי. תוך כדי ערבוב של תמיסתו המאוחדת של ה-Resus, הוסיפו לתוך התערובת בטיפות את התמיסות הבאות: Lysozyme, magnesium chloride, DNS, TRITTON X 100, ולבסוף DTT.העבירו את התמיסה למבחנות אולטרה-צנטריפוגה באמצעות מבחנה עם ממיר אולטרסוני באמפליטודה של 30%. בצעו סוניקציה לתמיסה על קרח למשך 1.5 דקות וצנטריפוגו את הליזאט במהירות של 5,000 RPMs למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שפכו את הסופרנאט והוסיפו 15 milliliters של בופר שטיפה. חזרו על הסוניקציה כפי שבוצע בעבר עד שהמשקע יסוएसपीנד באופן מלא וחזרו על הצנטריפוגה; חזרו על שלבי השטיפה, הסוניקציה וההשקעה חמש פעמים.לבסוף, השביו את המשקע באמצעות באפר שטיפה שאינו מכיל Triton X 100. צנטריפגו פעם נוספת והשביו ארבעה מיליליטר של באפר TE. אלו הם גופי ההכלה (inclusion bodies) שלכם.כמות את גופי התכלילים (inclusion bodies) שלך לפי משקל רטוב. ניתן לשמור את תמיסת גופי התכלילים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במאגרי באפר בריכוזים של 30 עד 100 milligram per milliliter. כאשר גופי התכלילים מוכנים, ניתן כעת להתכונן לשלב הקיפול מחדש (refolding).התחל את הליך הקיפול מחדש (refolding) על ידי הכנת בקבוק טרי של ליטר אחד של תמיפת Refolding buffer, וערבב במהירות נמוכה בטמפרטורה של 4 °C לקירור. לאחר מכן, הכן שבע הזרקות של הגופים ההכליליים (inclusion bodies) להזרקה לתוך תמיפת הקיפול מחדש. ראשית, המס את מלאי תרחיף הגופים ההכליליים במבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח סופי של 1.4 milliliters ב-7 M guine hydrochloride בתוספת 10 millimolar beam mercaptoethanol, באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 עד 40 דקות.ערבוב במערבל Vortex (וורטקס) בכל חמש דקות. תדעו שההמסה הושלמה כאשר התמיכה תהפוך לשקופה.סבב את התערובת המומסת במהירות מקסימלית למשך 30 דקות במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תוך הקפדה לא לאסוף דבר מהמשקע השחור הקטן, העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר.השלם את הנפח לשבעה מיליליטרים באמצעות בופר הזרקה לצורך ההזרקה. ראשית, העלה את מהירות הערבוב של תערובת הקיפול למהירות גבוהה. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של גופי הכללה מדוללים.יש להוסיף טיפה אחר טיפה, במרווח של שתי שניות בלבד בין טיפה לטיפה. הוסיפו מיליליטר אחד של גופי הכללה (inclusion bodies) מדוללים בכל פעם, במרווח של שעה בין הזרקה להזרקה. החזירו את מהירות הערבוב לנמוכה.המשיכו לערבב במהירות נמוכה בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך הלילה. לאחר מכן החלבונים יהיו מוכנים לריכוז וניקוי. כדי להתחיל בריכוז של טטראמרים של KLRG one מקפלים מחדש.ראשית, בצעו סינון מקדים של התגובה באמצעות מסנן של 22 µm. לאחר מכן, רכזו את התגובה מליטר אחד לכ-10 mL באמצעות תא ערבוב millipore Amon וממברנת אולטרה-פילטרציה בעלת סף חיתוך של 10 kDa, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, באמצעות ממברנת אולטרה-פילטרציה של Millipore עם סף חיתוך של 10 kDa, רכזו במקום עד לנפח של ≤ 2 mL.הגדירו את מערכת הכרומטוגרפיה שלכם בהתאם להוראות היצרן. אנו משתמשים במערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים (FPLC) מדגם ACTA של GE healthcare בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך שימוש בעמודה ברזולוציה גבוהה. טהרו את צורת המONOMER של K lrg, ב-20 millimolar heaps ו-150 millimolar sodium chloride באמצעות כרומטוגרפיית הדרה על פי גודל (size exclusion chromatography).הנפח המוזרק צריך להיות פחות מ-2% מהנפח הכולל של הג'ל בעמודה. שוב, השתמשו בממברנת סינון אולטרה עם סף משקל מולקולרי של 10 kilodalton של Millipore כדי לרכז את ה-KLG one monomer לנפח סופי של מיליליטר אחד, בהתאם להוראות היצרן. הסירו את הביוטין החופשי על ידי טיהור כפי שבוצע קודם לכן באמצעות כרומטוגרפיית הֶחְלָלָה (size exclusion chromatography) כדי להגיע לטטראמר.ערבבו את המonomers של KL LRG one עם עודף מולרי פי ארבעה של FICO rine; tetramers של streptavidin המשורשרים זמינים כעת לסימון ליגנדים של קולטנים. גרף זה מציג תוצאה חיובית של הפרדה של חלבוני Refolded K lrg one באמצעות כרומטוגרפיית הֶחְלָפָה של גודל (size exclusion chromatography) משמאל לימין. הפסגות ממחישות את הצורות של multimer, dimer ו-monomer של K LRG one.הפיסגה בצד ימין רחוק מייצגת את החלפת הבאפר. למרות שיש לבחון את תנאי קיפול החלבון (refolding) באופן אמפירי עבור כל חלבון, קולטני לקטין מסוג C אחרים אמורים להיות מסוגלים להיווצר כטטמרים באמצעות פרוטוקול דומה, ובכך לאפשר זיהוי פוטנציאלי של ליגנדים אחרים. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד להפיק את הטטמר של KLRG בעת ביצוע הליך זה.חשוב לזכור לבדוק את רמות האינדוקציה ולהקפיד באופן קפדני על תנאי הקיפול מחדש (refolding). זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 יכול להיות מונחה על ידי CRNA RNA (CRRNA) שתוכנן במיוחד כדי לדבוק DNA כפול תקועים באתרים הרצוי, יצירת הקצוות דביקים. בהתבסס על מאפיין זה, תקן DNA הרכבה (C-Brick) הוקמה, ופרוטוקול המפרט את השימוש שלה מתואר כאן.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת כתב כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת קולטן-ליגנד אינטראקציות.

מערכת BW כתב ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.

התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

מחקר זה קבע שיטה המשתמשת בהרחבת הקוד הגנטי כדי לשלב בהצלחה את לקטיל-ליזין (Klac) באתרים ספציפיים של האנולאז-1 (hENO1) והסופרפולקציה GFP (sfGFP) באשריכיה קולי ותאי יונקים.

לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

למדו לייצר טטרמרים של KLRG1 לניתוח ליגנדים במחקר אימונולוגי באמצעות חיידקים וביטוי חלבון מושרה IPTG. פרוטוקול זה מספק כלי אמין לחקר אינטראקציות KLRG1.

פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

גלה סרטונים נוספים