Name: עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למד הכנת עצם לא מופחת לצורך היסטולוגיה והיסטומורפומטריה באמצעות שיטות חיתוך וטכניקות הדמיה מתקדמות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבנה העצם והרכבה התאי ליישומים קליניים ומחקריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר את הסיוע של גב &#39;סו Connell עבור המומחיות שלה הטבעה שרף גב קברים סטפניה עבור המומחיות שלה במעבדה. המחברים מבקשים להודות פרופסור פרנק Kandziora ד&quot;ר מארי אן Polboth עבור עצתם.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה ממוקם מיכל אטום המכיל פוספט 10% שנאגרו פתרון פורמלין 3. להבטיח חשיפה מינימלית לאור, אם ניתוח fluorochrome יש לבצעם, כמו fluorochromes הם רגישים לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקם אשר האוריינטציה של רקמת יידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הדגימה לגודל, בכיוון הנכון, באמצעות הלהקה ראה. ודא אמצעי בטיחות הם דבקו. הדגימה ממוקם מכן לתוך מיכל אטום, היקף אשר אמור להיות בערך עשר פעמים את גודל הדגימה להשיג קיבעון הולם. הדגימה צריך להישאר הפתרון פורמלין סך של בין שבוע עד שבועיים, בהתאם לגודלה. הוא הציע להשתמש רקמות מלאה לבדיקה למטרות אופטימיזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת רקמות מתאים לתבנית הטבעה והמקום רקמה לתוך מיכל אטום המכיל אטום אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך הרקמה עולה ריכוזי אתנול, מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% אתנול 1 שבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול 1 שבוע </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה אינה מסומנת ולאחר מכן במשך שבוע 1 ב butanol, שוב מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות של שרף ואת העצם צריך להיות מתאימים מקרוב. צפיפות שרף ניתן לשנות (ראה שלב 8) ואנו ממליצים הטבעה טיפוס המבחן הראשון כדי להבטיח את צפיפות נכונה. אנו משתמשים Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) עבור מיקרוסקופ אור וניתוח fluorochrome. אם אימונוהיסטוכימיה נדרש שרף אלטרנטיבה יש להשתמש כגון Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון 7100 Technovit הכנה עשוי להיות מעורב עם aliquots קטן של הפתרון ריכוך המסופק עם ערכת, אם נדרש, אך לא יותר מ% 5 את עוצמת הקול של פתרון הכנה; בחוויה שלנו את הפתרון ריכוך נדרשת לעתים רחוקות. חלקים שווים של אתנול מוחלט נוזלי בסיס Technovit 7100 מעורבבים ויישומי לרקמה כפתרון חדירה מראש למשך 24 שעות וצמצום החשיפה אור בהתרגשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון חדירה אז הוא עשה את השימוש 1 hardener גרם לי (= 1 שקית) אשר מומס בנוזל 100 מ&quot;ל בסיס. זה מחליף את הפתרון מראש חדירה מותר לחדור שבוע 1 תחת תסיסה מתמדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית לתוך הרקמה, עם פני משטח חיתוך למטה. ודא שיש שוליים (רצוי לפחות 5 מילימטרים) סביב הרקמה עבור שרף, זה מבטיח חוזק לחסום. מערבבים 15mls של פתרון 7100 הכנה Technovit עם 1 מ&quot;ל של hardener II ויוצקים מסביב הדגימה בתוך התבנית ולכסות על ידי לפחות 5 millimietres. אשפרה יחל בתוך 2 שעות אבל תהיה שלמה בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה מבוצעת אז בעיצוב בלוק גיבוי באמצעות Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). מערבבים Technovit 3040 ביחס נפח של 2 חלקים אבקה לנוזל חלק 1 להשיג נוזל צמיג. יוצקים Technovit 3040 לתוך ההפסקה בחלק האחורי של הבלוק לרמה של לפחות 2 מ&quot;מ מעל הבסיס של הבלוק. לאחר כ -10 דקות עובש ניתן התקלף ולחסום את מוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות ולכן המאפיינים החנית של שרף methacrylate רגישים ללחות הסביבה בחדר. בלוקים ולכן צריך להיות מאוחסן dessicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך קרקע מייצרת חלקים גדולים יותר בין 20-50 מיקרומטר עובי. זה שימושי עבור ניתוח fluorochrome (ראה סעיף למטה) כמו בסעיפים עבה לייצר הקרינה בהיר. אבטח את להב היהלום macrotome. הוסף חומר סיכה, כמו רוח נפט למאגר על macrotome. אבטח את לחסום מהדק ו להתמצא ללהב. אפשר שחיקה להתרחש לאט (כ 20-30 דקות לכל קטע) להבטיח שימון הולם. החלק הראשון חושף את הפנים חיתוך orientates סעיף זה צריך להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסעיף הבא הוא הניח אז בשקופית Superfrost פלוס. בסעיף יש נטייה להתכרבל כך מומלץ למקם חלק שקית סנדוויץ&#39; על זה ואז מחזיק אותו שטוח עם שקופיות אחר הידק במקום. זה ממוקם אז בין 60-80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לתוך באינקובטור של. זה מרכך את methacrylate ומסייע בסעיף לדבוק לשקופית באופן שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הקרקע ניתן לנקות ומלוטש כנדרש באמצעות נייר זכוכית חצץ דק בצורה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtome המזחלת קיצוצים בסעיפים רזה, המספק את החלקים הטובים ביותר microsocopy אור. השתמש microtome המזחלת כפי שהוא הוסיף קשיחות, אשר נדרש לחיתוך אלה בלוקים קשה. לחילופין microtome סיבובי מופעל ניתן להשתמש. השתמש בלהב חד נירוסטה. עדיף יש שני להבים זמין כאחד ניתן חידד את השני משמש. הלהב צריך לעשות בזווית של 45 מעלות עם הבלוק. סוריכוך rface יכולה להיות מושגת על ידי החלת נייר רטוב כדי לחסום את הצורך. זה עלול לקחת כמה סעיפים על מנת להשיג את התנאים חיתוך הרצוי כדי להשיג קטע איכותי. בסעיף הוא צף אז על אמבט מים והניח בשקופית כמו 16 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים מכתים מפורטים חומרים למטה. הפרוטוקולים מבוססים על בנקרופט 4 et al. עקב וריאציה עובי מומלץ לבצע אופטימיזציה כתמים בשקופיות הבדיקה. מכתים Rack עלול לגרום רקמות לצוף מעל השקופית כך להוסיף את הכתמים ישירות לשקופית שטוח ייתכן שתידרש. פרוטוקול זהה או מכתים מתלה הוא הכרחי עבור תוצאות עקביות מכתים נדרש histomorphometry. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Haematoxylin ו Eosin <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 5-10 דקות Haematoxyilin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב עם מים מהברז של סקוט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם Eosin 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במי ברז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = ורוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם מסויד = חום אדמדם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחול = גרעינים </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פון Kossa <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תמיסת כסף חנקתי ולחשוף לאור חזק עד העצם mineralized הופך שחור (10 דקות בערך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים מזוקקים שלוש פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איום עם thiosulfate נתרן במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם Safrinin O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם Mineralised = שחור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = אדום / ורוד </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסון גולדנר s Trichrome <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם אלכוהול אלקליין (90mls של 80% אתנול ו 10mls של אמוניה 25% למשך 20 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם Haematoxylin Weigert של 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם הפתרון הסופי Ponceau-Fuchsin 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם phosphomolybdic חומצה כתום פתרון G 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אור ירוק 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חומצה אצטית 1% 3 שינויים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצם Mineralised = ירוק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמוי עצם = אדום / כתום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> = גרעינים כחול אפור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סחוס = סגול </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorochrome ההכנות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלה בזריקה תוך ורידי איטי, לפחות שבועיים זה מזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינון <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein גרין 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oxytetracycline 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alizarin Complexone 30 מ&quot;ג / ק&quot;ג IV </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Calcein גרין <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרם אחד של Calcein הירוק הוא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-pH מותאם עם NaOH 1% עד pH = 7.1-7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון לשמור מוגן מפני האור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Alizarin Complexone <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה גרם של Alizarin complexone היא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-pH מותאם אז עד pH = 7.1-7.2 עם HCl או NaOH 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון לשמור מוגן מפני האור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Oxytetracycline <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oxytetracycline זמין כתרופה אנטי מיקרוביאליים מהמדף. הכנה לא נדרש. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

ממיסים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% Normal שנאגרו חומצה אתנול פורמלין, קסילן Butanol כל כיתה היסטולוגיה, ללא גופרית. Grale מדעי Pty בע&quot;מ http://www.grale.com.au </li></ul> Moulds: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל משם, תבניות פלסטיק Grale מדעי </li></ul> שקופיות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SUPERFROST PLUS שקופיות מיקרוסקופ לומב מדעי Pty בע&quot;מ <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> שרף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיבוי שרף-Technovit 3040 בלוק בלוק histo Heraeus Kulzer </li></ul> כתמים (ריאגנטים מ Grale מדעי) Trichrome גולדנר של כתם </li> 1. Weigert של ברזל hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) Hemotoxylin פתרון </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absolute אלכוהול </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) ברזל פתרון </td></tr><tr><td> 30% כלור וברזל מימית </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (מרוכז) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 95mL </td></tr></table> מסוננים והוסיף נפח שווה של hemotoxylin מיד לפני כתם בשימוש. 2. Ponceau-fuchsin-azophloxin מניות פתרונות <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) Ponceau דה פתרון xylidine </td></tr><tr><td> Ponceau דה xylidine </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> חומצה fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) azophloxin פתרון </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ג) פתרון סופי עבודה כתם </td></tr><tr><td> Ponceau-fuchsin פתרון </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2ml </td></tr><tr><td> 0.2% חומצה אצטית פתרון </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. הפתרון אור ירוק <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> אור ירוק </td><td> 1g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (500ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic חומצה אורנג&#39; G פתרון <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> Phosphomolybdic חומצה </td><td> 3g </td></tr><tr><td> אורנג&#39; G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> להמיס 500ml של מים מזוקקים ולהוסיף תימול קריסטל. </td></tr></table> פון Kossa כתמים <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> 1% חנקת הכסף מימית </td></tr><tr><td> נתרן 2.5% thiosulfate </td></tr><tr><td> 1% safranin O </td></tr></table> Alcian כתם כחול <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> Alcian כחול 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% חומצה אצטית פתרון </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr></table> Hemotoxylin ו Eosin כתם <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> א) האריס hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5G </td></tr><tr><td> Absolute אלכוהול </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> אשלגן אלום </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> כספיתי תחמוצת </td><td> 1.25g או </td></tr><tr><td> נתרן iodate </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ב) Eosin פתרון </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosin המיוצר מסחרית היה בשימוש. </td></tr></table> כל אבקות צבע הכתם הם Gurr אבקות צבע. ריאגנטים כל ריאגנטים אנליטיים, ולא מעבדת ריאגנטים Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> יצרן </td><td> Fluorochrome </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> סיגמא אולדריץ, סידני </td><td> Calcein גרין </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> סיגמא אולדריץ, סידני </td><td> Alizarin Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet אוסטרליה, ויקטוריה </td><td> Oxytetracycline (את התרופה מדף מיקרוביאלית) </td><td> Tradename; Engemycin 100 </td></tr></table>

עצם הכנת undecalcified עבור היסטולוגיה, histomorphometry וניתוח fluorochrome

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

היסטולוגיה עצם Undecalcified מדגים את המיקרו ארכיטקטורה של העצם. זה מראה גם את הרכיבים mineralized ואת התאי של העצם, אשר מספק מידע חיוני על מחזור או עצם היווצרות העצם resorption. זה יש חשיבות עצומה במגוון רחב של יישומים קליניים ומחקר. זה מניב תמונות יפות 1 ומאפשר טכניקות כגון הערכה fluorochrome ו histomorphometry 2. ניתוח Fluorochrome היא טכניקה שבה צבעי ניאון אשר נקלטות על ידי סידן מוזרקים בנקודת זמן מסוימת, אשר מאפשרת כימות של כמות מינרליזציה באותו זמן נתון. Histomorphometry זהו תהליך של כימות העצם ברמה המיקרוסקופית. עצם ביצוע היסטולוגיה undecalcified מבחינה טכנית מאתגרת, במיוחד עם דגימות גודל גדול. זה דורש שינויים טכניקה מאלה המשמשים פרפין תקן מוטבע היסטולוגיה. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם. הכנת הדגימה, קיבעון ועיבוד מושגות עם באופן דומה רקמות רכות אחרות, אולם בשל לצפיפות וחדירות התחתון של עצם ניכרת קיבעון ארוך פי עיבוד נדרשים, לעיתים לוקח מספר שבועות. הטבעת מושגת באמצעות מדיום תמיכה עם קשיות דומה או שווה צפיפות העצם כגון methacrylate מבוססי שרפים, אך בניגוד חדירת פרפין והטבעה, זהו צעד בלתי הפיך. חתך ניתן להשיג על ידי שחיקה אשר מייצרת חלק עבה, שהוא אופטימלי עבור מחקרים כגון ניתוח fluorochrome. זו מושגת באמצעות מיטב להב היהלום על macrotome. לחלופין, קטעים רזה יכול להיות מיוצר עבור מיקרוסקופ אור זו מושגת באמצעות microtome המזחלת עם סכין חדה מאוד. Microtome המזחלת מספק את הכוח יציבות נוספים הדרושים, בלוקים גדולים קשה. שרף חלקים מוטבע יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של כתמים, אשר הפגינו.

היסטולוגיה עצם Undecalcified מספק מידע חשוב עבור מגוון של יישומים קליניים ומחקר. זה מאתגר מבחינה טכנית, בעיקר עם דגימות גודל גדול. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

היסטולוגיה של עצם לא מסתכלצית (Undecalcified) מדגימה את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם. היא מראה הן את הרכיבים המינרליים והן את הרכיבים התאיים של העצם, דבר המספק...

היסטולוגיה של עצם דקאלציפיקציה (הסרת סידן) מדגימה את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם ומציגה הן את הרכיבים המינרליים והן את הרכיבים התאיים של העצם, ובכך מספקת מידע חיוני על תחלופת העצם, בניית עצם וספיגת עצם. לדבר זה חשיבות עצומה במגוון יישומים קליניים ומחקריים. שיטה זו מספקת תמונות איכותיות ומאפשרת טכניקות כגון הערכת פלואורסצנציה והיסטו-אופטומטריה.ביצוע היסטולוגיה של עצם תחת הסתיידה הוא מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בדגימות גדולות. סרטון זה ידגים את הקשיים הטכניים ואת השיטות להתגבר עליהם כדי להשיג חתכים של עצם תחת הסתיידה. הסרטון לא יעסוק בהערכה היסטו-מורפומטרית של חתכים אלו.לצורך כך, אנו מפנים אתכם לפרסום החשוב הבא. סרטון זה יסקור את הכנת הדגימה ותהליכי הקיבוע, הטמעה וחיתוך (הן באמצעות שיוף והן באמצעות חיתוך), הכנת סליידים וצביעה לאחר איסוף הרקמה. הדגימה.במקרה זה, עמוד השדרה הצווארי של הכבש מונח בתוך מכל אטום ואטום לאור המכיל תמיסת פוספט חוצבת (phosphate buffered solution) בריכוז 10%. יש להגביל ככל האפשר את החשיפה לאור במידה וייערך ניתוח פלואורוכרום. מכיוון שהפלואורוכרומים רגישים לאור, הדגימה מועברת למעבדה ונחתכת לגודל המתאים, דבר המשפר את הקיבוע ומבטיח התאמה לבלוק.בשלב זה יש להכיר את כיוון הרקמה על גבי הפלטה כדי שניתן יהיה להכין את הבלוק במישור הנכון. הבטיחות היא בעלת חשיבות רבה ויש להשתמש במכשירים כך שהידיים יישמרו הרחק מהלהב. כעת יש לקצץ את אזור העניין לגודל הרצוי.לאחר מכן מבוצע עיצוב סופי באמצעות מסור סרט קטן יותר, דבר המוביל לאובדן רקמה מועט יותר. לאחר שבלוק נחתך לגודל הרצוי, הוא מוצב במיכל אטום ואטום לאור המכיל תמיסה טרייה להשלמת הקיבוע. נפח המיכל צריך להיות בערך פי 10 מגודל הדגימה.כדי להשיג קיבוע הולם, על הדגימה להישאר בנוסחה ובבתמיסה למשך שבוע עד שבועיים, בהתאם לגודלה, ולאחר מכן היא מועברת ל-70% Ethanol. העיבוד מבוצע לאחר מכן באופן איטי, שכן גודלם הרב של הבלוקים והחדירות הנמוכה של העצם גורמים לדיפוזיה איטית של הממסים. התייבשות מבוצעת לאחר מכן באמצעות ריכוזים עולים של ethanol ולאחר מכן הבהרה ב-butanol. הדגימה נשמרת מוגנת מאור ותחת ערבוב מתמיד.אנו ממליצים על שהייה של כשבוע בכל תמיסה. לכן, תהליך העיבוד נמשך כארבעה עד שישה שבועות. אין להאיץ תהליך זה, שכן הדבר יפגע באיכות הסופית של הסריקים.קיימות אפשרויות השבהה מגוונות עבור עצם מסוידת. הבחירה בסוג השרף או המתאקרילט תלויה בסוג הבדיקה המתוכננת. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה אינה אפשרית עם כל סוגי השרפים.שרפי אפוקסי דורשים אור UV לצורך קשיה, דבר שיפריע לאנליזת פלואורוכרום. אנו ממליצים לעיין במפרטי היצרן לפני קבלת החלטה מושכלת. אנו משתמשים ב-TEVI 7, 100 מכיוון שהוא מאפשר השגת חתכים וטחיות איכותיים למיקרוסקופיית אור ולאנליזת פלואורוכרום, והוא יעיל מבחינת עלות.השיקול החשוב בביצוע השקיעה (embedding) הוא שצפיפות העצם וצפיפות חומר השקיעה צריכות להיות תואמות במידה רבה. דבר זה חשוב מאוד בעת חיתוך הבלוקים בשלב מאוחר יותר, ובמיוחד עבור חיתוך מיקרוטומי (microtome sectioning). התערובת מוכנה על פי הוראות היצרן וננערת בעוצמה. ייתכן שכדאי להשקיע דגימות בדיקה כדי לבצע אופטימיזציה לפרוטוקול.בניגוד לשימוש בפראפין, זהו שלב בלתי הפיך. הבלוקים מונחים כאשר משטח החיתוך פונה כלפי מטה לתוך התבנית. התבנית תהיה גדולה יותר מהבלוק כדי לספק תמיכה וחוזק.יש לבצע את חדירת המתאקרילט (meth acrylate) באיטיות כדי לאפשר חדירה מקסימלית של המתאקרילט אל תוך העצם. שוב, יש למזער את החשיפה לאור. לאחר שבוע של שימוש בתמיסת חדירה, מחליפים את תמיסת החדירה ומוסיפים את תמיסת ההקשחה.לאחר מכן מכינים פלטת תמיכה. לצורך כך אנו משתמשים ב-tevit 30 40. לאחר מכן מקלפים את התבנית והבלוק מוכן כעת.חיתוך בשיטת ground sectioning מפיק חתכים גדולים יותר בעובי של 20 עד 50 מיקרון. שיטה זו שימושית לאנליזת פלואורסצנציה שכן חתכים עבים יותר מפיקים פלואורסצנציה בהירה יותר. להכנת ה-ground section נדרש מיקרוטום, רצוי עם להב יהלום. אנו משתמשים בלהב יהלום מעוקל בעובי 0.6 מילימטר.שימוש בחומר סיכה הוא הכרחי. אנו מעדיפים חומר סיכה על בסיס נפט, אם כי חומרי סיכה על בסיס סיליקון פועלים אף הם היטב. לאחר מכן, מניחים את הבלוק בתוך התפסן.הבלוק מקובע למקרוטום ומונע לעבר הלהב. הפרוסה הראשונה חושפת את פני השטח של החיתוך ומכוון את הזווית של הפרוסה. יש להשליכה.השחזה היא תהליך איטי ואין לזרז אותו. יש להבטיח סיכוך נאות בעת שחזירת החתך. לאחר מכן מניחים אותו על זכוכית כיסוי.ניתן לנקות ולהבריק אותו לפי הצורך. לחתך יש נטייה להתכרבל, לכן אנו ממליצים להניח עליו חלק משקית זיפלוק ולהחזיקו שטוח, כאשר זכוכית כיסוי נוספת מקובעת במקומה.לאחר מכן, הוא מוצב באינקובטור בטמפרטורה של 60 עד 80 °C למשך שעה אחת. פעולה זו מרככת את המתאקרילט ומסייעת לחתך להיצמד לلامסחית באופן שטוח. כאן אנו רואים תמונה פלואורסצנטית מורכבת של שלושה פלואורוכרומים שונים שהוזרקו במרווחי זמן חודשיים.דבר זה מאפשר זיהוי של אתר המינרליזציה בנקודת זמן מובחנת. את המינונים וההכנה של סמנים אלו ניתן למצוא בטקסט. המיקרו-טרם (micro term) מספק חתכים דקים, דבר המהווה את האפשרות הטובה ביותר למיקרוסקופיה של אור.זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית. אנו ממליצים להשתמש במיקרוטום מסוג sledge עבור החוזק הנוסף שהוא מספק לחיתוך של הבלוקים הקשים הללו. ניתן להשתמש במגוון להבים, כולל להבי טונגסטן קרביד.עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בלהב פלדת אל-חלד, מכיוון שניתן להשחיזו בקלות ובתדירות גבוהה לפי הצורך. יש להכווין את הלהב כך שיצור זווית של 45 מעלות עם הבלוק. צפיפות המטיל-אקרילט (methacrylate) רגישה לגורמים רבים, כולל הלחות הסביבתית בחדר.לכן, יש לאחסן את הבלוק בסביבה יבשה. ניתן להשיג ריכוך על ידי הנחת נייר רטוב על הבלוק במידת הצורך; ייתכן שיהיה צורך בביצוע מספר חתכים עד להשגת תנאי חיתוך נכונים לקבלת חתך איכותי. שוב, שקית הניילון והשקף הנוסף מהודקים כדי להחליק את החתך לפני הצבתו באינקובטור.הצביעה דומה להיסטולוגיה סטנדרטית של רקמות טבועות בפרפין, למעט העובדה שאין צורך בתהליך ההטמעה בשעווה. הצבעים הנפוצים המשמשים לעצם כוללים VSA עם צביעת נגד של זעפרן, זעפרן, ol light green, ו-mass on golden as trione. הפרוטוקולים עבור אלו מצוינים בטקסט.הריאגנטים נבחרים ומסוננים לפני השימוש. Golden. הצבע משמש לעיתים קרובות בהיסטו-אופטומטריה. אנו ממליצים לבצע אופטימיזציה של הצבעים על נגבים לבדיקה תחילה.לאחר כל שלב, ניתן לבחון את הפלטה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא את הצביעות הנכונות. דבר זה מאפשר להגיע לזמנים המדויקים עבור כל צבע של רכיב. לאחר אופטימיזציה של תקן הצביעה, צובעים את כל הפלטות מהניסוי בו-זמנית במגש לפי אותו פרוטוקול, כדי למנוע שונות בצביעה שתשפיע על הגאומטריה התרמית שלו.לאחר מכן, יש להכין את כיסויי הזריקה (coverslips) באופן סטנדרטי. אנו מאחלים לכם בהצלחה בניסוי.

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונדרוציטים לתוך תאי עצם.

שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות ולכמת את רמות החלבון במהלך הגולגולת מורפולגנזה/פתוגנזה על ידי מכתים באמצעות העכבר ברקמות הגולגולת כמו דוגמאות. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכנה והקפאה של רקמות קשות בלתי מתויטות מעכברים צעירים לצורך חיסוני.

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

אדיפוציטים קיימות במחסנים נפרדים ויש להם תפקידים מגוונים בתוך המיקרו-סביבות הייחודיות שלהם. כמו הבדלים אזוריים אופי ותפקוד הפונקציה נחשפים, זיהוי סטנדרטית בידוד של מחסני חיוני לקידום השדה. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי כריתה של מחסני שומן בעכבר.

זיהוי וניתוח של מחסני עכבר מגוונים

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

פרוטוקול זה מציג מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית לחקר השינויים המכנוביולוגיים של התפר ועיצוב מחדש של העצם תחת העמסת כוח מתיחה.

טכניקת הדמיה תלת-ממדית לעיצוב מחדש של עצם במודל עכבר הרחבת תפר

פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת decalcification של רקמות עצם שהושגו טרי ושימור של RNA באיכות גבוהה. שיטה מודגמת גם לחיתוך דגימות פורמלין קבוע פרפין משובץ (FFPE) של עצמות לא demineralized כדי להשיג תוצאות באיכות טובה אם רקמות טריות אינן זמינות או לא ניתן לאסוף.

שיטות להפעלת תעתיק מרחבי של רקמות עצם

פרוטוקול זה כולל תהליך עבודה שלב אחר שלב עבור דגימות וסקולריות מסוידות: טיפול ברקמות, דה-קלציפיקציה, אימות RNA, זיהוי רמות סיידון ואסטרטגיות בחירת אזור עניין ב-Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). המטרה היא להציג שיטה מקיפה לשימור מורפולוגיית רקמת כלי דם ו-RNA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי אמין.

הכנה ועיבוד עורקים מסויד עם מורפולוגיה ו-RNA משומרים לפרופילינג מרחבי דיגיטלי

למד הכנת עצם לא מופחת לצורך היסטולוגיה והיסטומורפומטריה באמצעות שיטות חיתוך וטכניקות הדמיה מתקדמות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבנה העצם והרכבה התאי ליישומים קליניים ומחקריים.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

גלה סרטונים נוספים