עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome
8 בינואר 2010
היסטולוגיה עצם Undecalcified מספק מידע חשוב עבור מגוון של יישומים קליניים ומחקר. זה מאתגר מבחינה טכנית, בעיקר עם דגימות גודל גדול. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם.
היסטולוגיה של עצם דקאלציפיקציה (הסרת סידן) מדגימה את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם ומציגה הן את הרכיבים המינרליים והן את הרכיבים התאיים של העצם, ובכך מספקת מידע חיוני על תחלופת העצם, בניית עצם וספיגת עצם. לדבר זה חשיבות עצומה במגוון יישומים קליניים ומחקריים. שיטה זו מספקת תמונות איכותיות ומאפשרת טכניקות כגון הערכת פלואורסצנציה והיסטו-אופטומטריה.
ביצוע היסטולוגיה של עצם תחת הסתיידה הוא מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בדגימות גדולות. סרטון זה ידגים את הקשיים הטכניים ואת השיטות להתגבר עליהם כדי להשיג חתכים של עצם תחת הסתיידה. הסרטון לא יעסוק בהערכה היסטו-מורפומטרית של חתכים אלו.
לצורך כך, אנו מפנים אתכם לפרסום החשוב הבא. סרטון זה יסקור את הכנת הדגימה ותהליכי הקיבוע, הטמעה וחיתוך (הן באמצעות שיוף והן באמצעות חיתוך), הכנת סליידים וצביעה לאחר איסוף הרקמה. הדגימה.
במקרה זה, עמוד השדרה הצווארי של הכבש מונח בתוך מכל אטום ואטום לאור המכיל תמיסת פוספט חוצבת (phosphate buffered solution) בריכוז 10%. יש להגביל ככל האפשר את החשיפה לאור במידה וייערך ניתוח פלואורוכרום. מכיוון שהפלואורוכרומים רגישים לאור, הדגימה מועברת למעבדה ונחתכת לגודל המתאים, דבר המשפר את הקיבוע ומבטיח התאמה לבלוק.
בשלב זה יש להכיר את כיוון הרקמה על גבי הפלטה כדי שניתן יהיה להכין את הבלוק במישור הנכון. הבטיחות היא בעלת חשיבות רבה ויש להשתמש במכשירים כך שהידיים יישמרו הרחק מהלהב. כעת יש לקצץ את אזור העניין לגודל הרצוי.
לאחר מכן מבוצע עיצוב סופי באמצעות מסור סרט קטן יותר, דבר המוביל לאובדן רקמה מועט יותר. לאחר שבלוק נחתך לגודל הרצוי, הוא מוצב במיכל אטום ואטום לאור המכיל תמיסה טרייה להשלמת הקיבוע. נפח המיכל צריך להיות בערך פי 10 מגודל הדגימה.
כדי להשיג קיבוע הולם, על הדגימה להישאר בנוסחה ובבתמיסה למשך שבוע עד שבועיים, בהתאם לגודלה, ולאחר מכן היא מועברת ל-70% Ethanol. העיבוד מבוצע לאחר מכן באופן איטי, שכן גודלם הרב של הבלוקים והחדירות הנמוכה של העצם גורמים לדיפוזיה איטית של הממסים. התייבשות מבוצעת לאחר מכן באמצעות ריכוזים עולים של ethanol ולאחר מכן הבהרה ב-butanol. הדגימה נשמרת מוגנת מאור ותחת ערבוב מתמיד.
אנו ממליצים על שהייה של כשבוע בכל תמיסה. לכן, תהליך העיבוד נמשך כארבעה עד שישה שבועות. אין להאיץ תהליך זה, שכן הדבר יפגע באיכות הסופית של הסריקים.
קיימות אפשרויות השבהה מגוונות עבור עצם מסוידת. הבחירה בסוג השרף או המתאקרילט תלויה בסוג הבדיקה המתוכננת. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה אינה אפשרית עם כל סוגי השרפים.
שרפי אפוקסי דורשים אור UV לצורך קשיה, דבר שיפריע לאנליזת פלואורוכרום. אנו ממליצים לעיין במפרטי היצרן לפני קבלת החלטה מושכלת. אנו משתמשים ב-TEVI 7, 100 מכיוון שהוא מאפשר השגת חתכים וטחיות איכותיים למיקרוסקופיית אור ולאנליזת פלואורוכרום, והוא יעיל מבחינת עלות.
השיקול החשוב בביצוע השקיעה (embedding) הוא שצפיפות העצם וצפיפות חומר השקיעה צריכות להיות תואמות במידה רבה. דבר זה חשוב מאוד בעת חיתוך הבלוקים בשלב מאוחר יותר, ובמיוחד עבור חיתוך מיקרוטומי (microtome sectioning). התערובת מוכנה על פי הוראות היצרן וננערת בעוצמה. ייתכן שכדאי להשקיע דגימות בדיקה כדי לבצע אופטימיזציה לפרוטוקול.
בניגוד לשימוש בפראפין, זהו שלב בלתי הפיך. הבלוקים מונחים כאשר משטח החיתוך פונה כלפי מטה לתוך התבנית. התבנית תהיה גדולה יותר מהבלוק כדי לספק תמיכה וחוזק.
יש לבצע את חדירת המתאקרילט (meth acrylate) באיטיות כדי לאפשר חדירה מקסימלית של המתאקרילט אל תוך העצם. שוב, יש למזער את החשיפה לאור. לאחר שבוע של שימוש בתמיסת חדירה, מחליפים את תמיסת החדירה ומוסיפים את תמיסת ההקשחה.
לאחר מכן מכינים פלטת תמיכה. לצורך כך אנו משתמשים ב-tevit 30 40. לאחר מכן מקלפים את התבנית והבלוק מוכן כעת.
חיתוך בשיטת ground sectioning מפיק חתכים גדולים יותר בעובי של 20 עד 50 מיקרון. שיטה זו שימושית לאנליזת פלואורסצנציה שכן חתכים עבים יותר מפיקים פלואורסצנציה בהירה יותר. להכנת ה-ground section נדרש מיקרוטום, רצוי עם להב יהלום. אנו משתמשים בלהב יהלום מעוקל בעובי 0.6 מילימטר.
שימוש בחומר סיכה הוא הכרחי. אנו מעדיפים חומר סיכה על בסיס נפט, אם כי חומרי סיכה על בסיס סיליקון פועלים אף הם היטב. לאחר מכן, מניחים את הבלוק בתוך התפסן.
הבלוק מקובע למקרוטום ומונע לעבר הלהב. הפרוסה הראשונה חושפת את פני השטח של החיתוך ומכוון את הזווית של הפרוסה. יש להשליכה.
השחזה היא תהליך איטי ואין לזרז אותו. יש להבטיח סיכוך נאות בעת שחזירת החתך. לאחר מכן מניחים אותו על זכוכית כיסוי.
ניתן לנקות ולהבריק אותו לפי הצורך. לחתך יש נטייה להתכרבל, לכן אנו ממליצים להניח עליו חלק משקית זיפלוק ולהחזיקו שטוח, כאשר זכוכית כיסוי נוספת מקובעת במקומה.
לאחר מכן, הוא מוצב באינקובטור בטמפרטורה של 60 עד 80 °C למשך שעה אחת. פעולה זו מרככת את המתאקרילט ומסייעת לחתך להיצמד לلامסחית באופן שטוח. כאן אנו רואים תמונה פלואורסצנטית מורכבת של שלושה פלואורוכרומים שונים שהוזרקו במרווחי זמן חודשיים.
דבר זה מאפשר זיהוי של אתר המינרליזציה בנקודת זמן מובחנת. את המינונים וההכנה של סמנים אלו ניתן למצוא בטקסט. המיקרו-טרם (micro term) מספק חתכים דקים, דבר המהווה את האפשרות הטובה ביותר למיקרוסקופיה של אור.
זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית. אנו ממליצים להשתמש במיקרוטום מסוג sledge עבור החוזק הנוסף שהוא מספק לחיתוך של הבלוקים הקשים הללו. ניתן להשתמש במגוון להבים, כולל להבי טונגסטן קרביד.
עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בלהב פלדת אל-חלד, מכיוון שניתן להשחיזו בקלות ובתדירות גבוהה לפי הצורך. יש להכווין את הלהב כך שיצור זווית של 45 מעלות עם הבלוק. צפיפות המטיל-אקרילט (methacrylate) רגישה לגורמים רבים, כולל הלחות הסביבתית בחדר.
לכן, יש לאחסן את הבלוק בסביבה יבשה. ניתן להשיג ריכוך על ידי הנחת נייר רטוב על הבלוק במידת הצורך; ייתכן שיהיה צורך בביצוע מספר חתכים עד להשגת תנאי חיתוך נכונים לקבלת חתך איכותי. שוב, שקית הניילון והשקף הנוסף מהודקים כדי להחליק את החתך לפני הצבתו באינקובטור.
הצביעה דומה להיסטולוגיה סטנדרטית של רקמות טבועות בפרפין, למעט העובדה שאין צורך בתהליך ההטמעה בשעווה. הצבעים הנפוצים המשמשים לעצם כוללים VSA עם צביעת נגד של זעפרן, זעפרן, ol light green, ו-mass on golden as trione. הפרוטוקולים עבור אלו מצוינים בטקסט.
הריאגנטים נבחרים ומסוננים לפני השימוש. Golden. הצבע משמש לעיתים קרובות בהיסטו-אופטומטריה. אנו ממליצים לבצע אופטימיזציה של הצבעים על נגבים לבדיקה תחילה.
לאחר כל שלב, ניתן לבחון את הפלטה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא את הצביעות הנכונות. דבר זה מאפשר להגיע לזמנים המדויקים עבור כל צבע של רכיב. לאחר אופטימיזציה של תקן הצביעה, צובעים את כל הפלטות מהניסוי בו-זמנית במגש לפי אותו פרוטוקול, כדי למנוע שונות בצביעה שתשפיע על הגאומטריה התרמית שלו.
לאחר מכן, יש להכין את כיסויי הזריקה (coverslips) באופן סטנדרטי. אנו מאחלים לכם בהצלחה בניסוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
היסטולוגיה של עצם ללא דה-קלציפיקציה היא חיונית להבנת המיקרו-ארכיטקטורה של העצם, כולל הרכיבים המינרליים והתאיים. סרטון זה מדגים את האתגרים הטכניים ואת השיטות להפקת חתכים איכותיים מדגימות גדולות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- היסטולוגיה של העצם
- יישומים קליניים
- מתודולוגיות מחקר
רקע
- תחלופת עצם ובניית עצם חיוניות לבריאות.
- חתכים לא דה-קלציפיים מספקים תמונות מפורטות של מבנה העצם.
- טכניקות כגון הערכת פלואור משפרות את הניתוח.
- קשיים עולים בעבודה עם דגימות גדולות בהכנה היסטולוגית.
מטרת המחקר
- להדגים את התהליך להשגת חיתוכי עצם איכותיים שאינם דקלציפיים.
- להדגיש קשיים טכניים בהכנה היסטולוגית.
- לספק פתרונות להתגברות על אתגרים אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות עצם שאינן דה-קלציפיות.
- טכניקות לחיתוך דגימות גדולות.
- שיטות להערכה חזותית.
- הדגמה של טכניקות היסטולוגיות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של חיתוכי עצם באיכות גבוהה.
- זיהוי אתגרים טכניים נפוצים.
- שיטות יעילות להתגברות על קשיי ההכנה.
- הבנה משופרת של מיקרו-ארכיטקטורת העצם.
מסקנות
- היסטולוגיה של עצם לא מנוונת (undecalcified) חיונית ליישומים קליניים ומחקריים.
- ניתן לנהל את האתגרים הטכניים ביעילות באמצעות שיטות מתאימות.
- חתכים איכותיים מספקים תובנות בעלות ערך לגבי בריאות העצם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
היסטולוגיה של עצם לא דקלציפית מאפשרת ויזואליזציה ישירה של רכיבי עצם מינרליים ותאיים, ובכך מספקת נתונים קריטיים על תחלופה, בנייה וספיגה של העצם. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות במודלים של מחלות שלד על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית לצורך ניתוח כמותי. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להערכה לרוחבית של דינמיקת המינרליזציה באמצעות סימון בפלואורוכרום.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי שימור של תאי העצם והמרכיבים המינרליים של העצם לצורך ניתוח מכניסטי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על תהליכי בנייה וספיגה של עצם בדגימות הרלוונטיות למחלה.
- ערך תרגומי: מסייע בביסוס הוודאות לגבי המטרה הטיפולית על ידי מתאם בין נקודות סיום היסטולוגיות לתוצאות תפקודיות במודלים פרה-קליניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטי של היסטומורפומטריה וכמותית ואנליזה של פלואורוכרומים לצורך הערכה סטנדרטית של קצבי מינרליזציה של העצם.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של חיתוך, צביעה והדמיה, הישימים למסלולי עבודה עם מספר רב של דגימות.
- ערך תרגומי: תומך במוכנות לסריקה על ידי יצירת נתוני מינרליזציה כמותיים ומחולקי זמן, המתאימים להערכת תרכובות בפרמקולוגיה של השלד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק רציפות של מערכת רלוונטית למחלה על ידי אפשור מעקב אורך של תחלופת עצם משלב הגילוי ועד לשלבי תיקוף פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: תומך בקבלת החלטות על קידום הפרויקט בהתאם לסיכון, באמצעות אספקת נתוני פנוטיפ של עצם כמותיים ומתוכפים היסטו-מורפומטרית.
- ערך תרגומי: משפר את הפחתת הסיכונים החזויה באמצעות מתאם ישיר בין דפוסי סימון פלואורוכרום לבין אירועי מינרליזציה זמניים במחקרי התערבות טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם, דרך זיהוי תרכובות מובילות (lead identification) ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד עבור תרופות המכוונות לעצם ופרמקולוגיה של בטיחות השלד.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של פעילות אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים ברקמה שאינה דה-קלציפיקטורית.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של השחייה וחיתוך המניבים פלואורסצנציה ותוצרי היסטומורפומטריה כמותיים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כולל קצב השקיעה המינרלית, קצב בניית העצם ולוחות זמנים של מינרליזציה המופקים מפלואורוכרומים לצורך השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התגליות לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להערכה אורךית של דינמיקת מחזור העצם, החיונית לתיקוף מודלים של מחלות שלד.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת היסטולוגיה לשימוש חוזר עבור תוכניות של פרמקולוגיה של השלד, באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות של שיקוע בשרף, חיתוך וצביעה, הישימות על פני מודלים של עצם ושיטות טיפוליות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הערכה כמותית וישירה של בניית עצם וספיגת עצם ללא ארטיפקטים של דה-קלציפיקציה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות פרוטוקולים מאומתים של שיבוץ, חיתוך וצביעה עבור דגימות גדולות ודחוסות.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) בתרפיה של השלד על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בנקודות סיום של תחלופת עצם.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מועמדים המכוונים לעצם בהתאם לסיכון, באמצעות אותות בטיחות ויעילות פרה-קליניים המאומתים היסטומורפומטרית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה של עצם, בטכניקות של שיבוץ בשרף ובפרוטוקולים לטיפול בפלואורוכרומים.
- מחייב שימוש בציוד ייעודי הכולל מיקרוטומים מסוג Sledge, מקרוטומים בעלי להב יהלום, וסביבות עיבוד מוגנות מאור לשמירה על יציבות הפלואורוכרומים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של לוחות הזמנים לקיבוע, דהידרטציה ואינפילטרציה, כדי להבטיח את איכות החתכים בדגימות גדולות בעלות חדירות נמוכה.
- כולל שיקולי התאמה לצפיפויות עצם וגדלי דגימות משתנים, דבר המחייב שימוש במצעי שיבוץ תואמי צפיפות וזמני עיבוד ממושכים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שלבי שיבוץ בלתי הפיכים, רגישות של פלואורוכרומים לאור, וארטיפקטים של התכמכות חתכים הדורשים יישור מכני במהלך ההרכבה.
