Name: ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: חקור אפיון מולקולרי של Drosophila melanogaster חיה באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית HRMAS 1H-MRS. שיטה זו מאפשרת ניתוח מטבוליטים בתוך הגוף ללא פגיעה בנמלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) כדי להעניק AI063433 לורנס ג רחמה, מכון המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מרכז גרנט (P50GM021700) כדי רונלד ג טומפקינס (א &#39;אריה ציקה, מנהל הליבה NMR), ובית החולים של שריינרים לילדים מענק מחקר (# 8893) א &#39;אריה ציקה. אנו מודים Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. סיוע בשלבים הראשונים של פיתוח זה פרוטוקול Ovidiu ג Andronesi Ph.D. לקבלת סיוע עם רצף הדופק TOBSY.

חלק 1: תסיסנית הכנה מדידות HRMAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תקן flylab נהלים 1, לאסוף החדש eclosing זבובים במשך 3 ימים ולהעביר אותם לטוס צלוחיות המכילות מזון לעוף טרי. דגירה הזבובים שנאספו במשך 5 ימים, כך הזבובים יהיה 5-8 ימים רק לפני הניסוי. רק מין אחד (בדרך כלל גברים) משמש עבור ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בריאים, סוג בר שלם זבובים להשוות עם טיפול בטראומה למשל או שינו גנטית זבובים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום זבובים בודד לתוך צינורות 2ml המכילה פיסה (~ 0.2ml) של מזון לטוס 24 שעות לפני הניסוי. צינורות אלה לשאת חור כוס הצינור עשוי באמצעות מחט להבה מחומם אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינורות מיד לפני ואחרי הכניסה את הזבוב באמצעות איזון דיוק גבוהה להגדיר משקל של כל זבוב ידי הפחתת הערך הראשון של הלה. זבוב זכר יחיד שוקל בדרך כלל 0.7-1 מ"ג. </li></ol> חלק 2: הכנת HRMAS רוטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינור יחיד על קרח פחות מדקה להרדים בתוך לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את זבוב על שכבה של נייר אלומיניום דגש על קרח לדחוף בעדינות לטוס לחלל חלול semispherical של להכניס את הרוטור NMR בעזרת מברשת רכה כדי להבטיח חיבור לעוף שלם, תוך הימנעות מפגיעה לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להכניס תחמוצת זירקוניום (ZrO 2) צינור הרוטור (4 מ"מ קוטר, 50 μl) כדי לאתר את הזבובים בין להכניס את הרוטור התחתון של הרוטור (ראה figure1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הכנס עם בורג ולכסות אותו עם parafilm (ראה figure1) כדי למנוע את המגע בין זבוב לבין פתרון סטנדרטי כפית (כפית: trimethylsilyl-propionic-2-D4 ,2,3,3 חומצה, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 מ"מ deuterated מים-D 2 O, כי הפונקציה כהתייחסות למשמרת הן תהודה כימיים וכימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של פתרון כפית רגילה על גבי להכניס את הרוטור. (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure והדק את כל להגדיר את הרוטורים עם כובע העליון (ראה תרשים 1). </li></ol> חלק 3: HRMAS Data Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את הרוטור לתוך החללית HRMAS ומקם אותה בזווית הקסם 54.7 ° (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הטמפרטורה 4 מעלות צלזיוס על ידי יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידת MAS פנאומטי. זבובים נשמרים בעוד 4 מעלות צלזיוס בתוך הספקטרומטר לשמור על הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את H 1 HRMAS שיעור ספינינג גברת ב 2 MAS קילוהרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את התדר MAS סיבוב ב 2.0 ± 0.001 kHz על ידי בקר MAS מהירות (תדירות סיבוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכנת מגנט: המנגינה ולהתאים את סליל עבור ביצועים אופטימליים פחית מגנט באיכות אופטימלית של הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את אחת ספקטרה ממדי 1 H באמצעות הרוטור מסונכרן קאר, פרסל, Meiboom-גיל (CPMG) ספין הד הדופק רצף 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-רכישה], אשר פועל כמסנן T 2 ל להסיר את הרחבת הספקטרום 1 H NMR יחיד לטוס ספקטרה כדי רכשה חד ממדי נתונים על כל הדגימות. סנכרן את העיכוב בין דופק (τ = 500μs) לתדר MAS את הסיבוב (2 קילוהרץ). הגדר את מספר הארעיים ב 256 עם 32,768 (32K) נקודות נתונים. זמן רכישת 9 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת דו ממדי (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR יחיד לטוס ספקטרום על כל הדגימות באמצעות רצף TOBSY עם פולסים adiabatic 3. הפרמטרים רכישת הם: 2k נקודות נתונים מימד ישיר (11 עמודים לדקה רוחב הספקטרום), 1 של מים מראש הרוויה במהלך העיכוב הרפיה, 8 סריקות לכל תוספת, במרווחים של 128, זמן החזרה סך של 2, 45 ms זמן ערבוב, רכישה בסך הכל זמן של 29 דקות. </li></ol> חלק 4: עיבוד נתונים / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות MRspectra MestReC באמצעות תוכנה (Mestrelab המחקר, www.mestrec.com) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קו הרחבה פונקציה apodization של הרץ 0.5 וחלים על כל 1 FIDs HRMAS H לפני השינוי פורייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפניה ספקטרה MR ביחס כפית עמודים לדקה δ = 0.0 (תקן חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ספקטרום ידני ולהחיל אומד הבסיס וויטאקר תפחית את הרכיבים רחב של הבסיס לפני החישובים אזור השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אומדן שטחים שיא באמצעות תוכנת MestReC. סולם גבהים שיא ביחס כפית עבור כל קשת רכשה (כפית גובה שיא = 1). השתמש t-בדיקות (שני זנב, p &lt;0.05), להשוות בתוך הקבוצה בין קבוצות יחסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2D פרמטרים TOBSY התהליך הם: QSINE = 2 פונקציה חלון בשני המימדים, FT עם נקודות 2k בממד ישיר אפס מילוי כדי 1k בממד השני, תיקון פאזה בשני הממדים תיקון הבסיס בממד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר את ספקטרום 2D באמצעות ספרקי התוכנית (TD גודארד ו DG Kneller, ספרקי 3, USCF, <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/</a>בית / ספרקי /) </li></ol> חלק 5: ספקטרה נציגת חיים תסיסנית melanogaster זבובים הנהלים שתוארו לעיל היתר לאסוף ספקטרה לשחזור מתוך לחיות זבובי תסיסנית melanogaster. איורים 2 ו -3 מראים נציג MR ספקטרה שנרכש wild-type (wt) אורגון-R זבובים. תרשים 2 מציג 1D 1 H ספקטרה HRMAS CPMG. השומנים המרכיבים העיקריים [ג H 3 (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm)], גליצרול (1,3 C-H ו - 4.10 ppm 4.30 עמודים לדקה; 2-CH 2 5.24 ppm), ומטבוליטים קטנה: β-אלאנין (β-עלא , 2.57 ppm), אצטט (AC, 1.97 ppm), phosphocholine (PC, 3.22 לדקה) ו phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) התגלו והוצב על פי הדיווחים לפני 4, 5. איתותי עמודים לדקה 2.02 חולקו פרוטונים מתילן של מחצית H2-CH = CH-C של מונו חומצות שומן בלתי רוויות (כלומר palmitoleic). חומצות בלתי רוויות זוהו על ידי אות עמודים לדקה 5.33 המיוצר על ידי פרוטונים של מחצית-CH-CH =. מטבוליטים קטנים שלא ניתן היה מוקצה, או שלא נראו באמצעות ספקטרום 1D התגלו באמצעות 2D 1 H-1 H TOBSY HRMAS (ראה איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ניסיוני להגדיר של in vivo HRMAS 1H גברת לחקירת לחיות תסיסנית על חומצה 14.1 ,2,3,3-D4 ט חיצוני סטנדרטי trimethylsilyl-propionic-2 במים deuterated (כפית / D 2 O). בכיכר: מיקום הרוטור בזווית קסם HRMAS בדיקה. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Vivo ב 1D HRMAS ספקטרה 1 CPMG H של זבוב חי תסיסנית wt melanogaster. שומנים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), אצטט (AC), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), β-אלאנין (β-עלא), phosphocholine (PC) ו phophoetanolamine (PE), גליצרול (1,3 C-H 4.10, 4.30 עמודים לדקה; 2-C H 2 5.22 ppm) , C = C H H (5.33 ppm). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Vivo 2D 1H-1H TOBSY ספקטרום HRMAS של זבוב תסיסנית לחיות wt melanogaster ב 14.1 מטבוליטים ט קטנים ורכיבים השומנים זוהו. מטבוליטים: אלאנין (עלא), β-אלאנין (β-עלא), ארגינין (Arg), גלוטמין (Gln), גלוטמט (Glu), phosphocholine מחשב (PC), phophoetanolamine (PE), טאורין (טאו), α-גלוקוז (α-Glc) ו גליצרול. ליפידים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית החולים הכללי מסצ&#39;וסטס ועדת המחקר מוסדיים בעלי חיים הדירקטוריון סקירה.

למעט הדוח האחרון של היתכנות של MRI in vivo בפרי זבובים 6, in vivo גברת לימודי תסיסנית טרם דיווחו. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את יישום רומן בגישה vivo HRMAS H-1 גברת לאיתור מולקולות חשובות מבחינה ביולוגית. במפורש, זיהינו שומנים מטבוליטים קטנים לחיות תסיסנית זבובים ב 14.1-T ב כ 45 דקות, המאפשר רכישת זמן הולם, תוך השגת התמותה לטוס אפס. השימוש רוטור-מסונכרן נקניקיות-8 adiabatic הדופק (C9 1 15) ב...

<table><tbody><tr><td>דהוטריום אוקסיד</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; חומצה</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>אגר, סוכרוז, שמרים, קמח תירס</td><td>מזון</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>זבובים מסוג Oregon RS או Canton-S</td><td>קווי זבובים בוגרים</td><td>מרכז מאגרי הזנים של בלומינגטון (Bloomington Stock center)</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מכחול</td><td>ציוד</td><td></td><td></td><td>(גודל 0)</td></tr><tr><td>מבחנות של 2 מ"ל</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטורים לזבובים</td><td>ציוד</td><td></td><td></td><td>קיבולת לחות גבוהה (60-75%), טמפרטורה ניתנת לכיוונון, ומחזור אור:חושך של 12 שעות:12 שעות.</td></tr><tr><td>ספקטרומטר NMR מדגם Bruker Bio-Spin Avance (600.13 MHz) עם גשש תהודה משולשת (triple resonance) של 4 מ"מ (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;ג', &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) גשוש HRMAS </td><td>ציוד</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידה פנאומטית ל-MAS</td><td>ציוד</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור זירקוניום אוקסיד 4 מ"מ (קיבול 50 מיקרוליטר)</td><td>ציוד</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (חנות Bruker)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td>ניתוח ספקטרומי NMR חד-ממדיים (1D NMR)&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td>ניתוח ספקטרוסקופיית NMR דו-ממדית&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג (HRMAS) פרוטון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS) היא טכניקה רומן הרסני המשפרת ספקטרלי, רוחב קו ומאפשר ברזולוציה גבוהה ספקטרה להיות המתקבל תמציות, תאים שלמים, תרביות תאים, ורקמות יותר שלם וחשוב לחקור את היחסים בין מטבוליטים ועל תהליכים תאיים.<em&gt; ב-vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS מחקרים טרם דווח על זבוב הפירות לחיות<em&gt; תסיסנית melanogaster.</em&gt;<em&gt; תסיסנית,</em&gt; כאורגניזם גנטית פשוטה, מאפשר תפקודים ביולוגיים רבים ומגוונים מסלולי איתות שמור באבולוציה להיבחן ברמת האורגניזם השלם, וזה מודל שימושי לחקר הגנטיקה ופיזיולוגיה. לשם כך, פיתחנו ויישמנו<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS שיטה לחקור לחיות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב 14.1 ט &#39;הנה, אנחנו המתאר HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS פרוטוקול לאפיון מולקולרי של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עם ספקטרומטר MR קונבנציונאלי מצויד בדיקה HRMAS. טכניקה זו היא רומן,<em&gt; In vivo,</em&gt; שאינו הרסני<em&gt; תסיסנית</em&gt; גישת מדידה המטבוליט, המאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים למחלה ולכן עשויים לתרום לפיתוח טיפולית חדשנית.

טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של חיים<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; עם קונבנציונלית 14.1 טסלה ספקטרומטר מצויד בדיקה HRMAS.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של פרוטונים (1H-MRS) בסיבוב זווית קסם ברזולוציה גבוהה (HRMAS) היא טכניקה חדשנית לא הרסנית המשפרת את הרזולוציה הספקטרלית...

24 שעות לפני הניסוי, זבוב זכר מוצב בתוך מבחנה בנפח שני מיליליטר. לאחר הרדמה קצרה בקור קיצוני של קרח, הזבוב נדחף לתוך התא של רוטור ה-NMR, ולאחר מכן מוצב בתוך מבחנת הרוטור. תמיסת סטנדרט TSP מתווספת מעל לתא הרוטור, ולאחר מכן הרוטורים נסגרים עם מכסה עליון.את הרוטור מכניסים אל תוך גשש ה-H-R-M-A-S וממקמים אותו בזווית הקסומה (magic angle) של 54.7 מעלות. הספקטרומטר מוגדר לביצוע ניסויים חד-ממדיים ודו-ממדיים. לבסוף, מבוצע ניתוח של ה-Mr.Spectra של הדגימות.אני ולריה ריגי מהמעבדה הניתוחית ל-NMR במחלקה לכירורגיה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ובבית הספר לרפואה של הרווארד. היי, אני Y AB מהמעבדה לכירורגיה מולקולרית במחלקה לכירורגיה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ובבית הספר לרפואה של הרווארד. שלום, אני לורנס אכמן, המנהל של המעבדה לכירורגיה מולקולרית והמחלקה לכירורגיה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ובבית הספר לרפואה של הרווארד.ואני מריו זיקה, מנהל מעבדת ה-NMR הכירורגית בבית החולים של מסצ'וסטס ג'ורנל ובזיקה למרכז אולה מרטין בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נראה לכם הליך לאפיון מולקולרי של Melanogaster גדול באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) במיקום ספציפי. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור מטבוליטים של Sila in vivo במטרה לזהות סממנים ביולוגיים למחלות התורמים לפיתוח טיפולים חדשניים. אז בואו נתחיל.התחילו את ההכנה על ידי איסוף זבובים שבקעו לאחרונה במשך שלושה ימים, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנות זבובים המכילות מזון טרי לזבובים. דגרו את הזבובים שנאספו במשך חמישה ימים, כך שיהיו בני חמישה עד שמונה ימים בדיוק לפני הניסוי. אנו משתמשים בזכרים בלבד עבור הניסויים שלנו.הכינו מבחנות ניסוי בנפח שני מיליליטר עבור הזבובים, על ידי שימוש במחט אינסולין שחוממה בלהבה כדי ליצור חור במכסה המבחנה. כעת, מקמו זבובים בודדים בתוך המבחנות המכילות פיסת מזון לזבובים, 24 שעות לפני הניסוי. השתמשו במאזני דיוק גבוהים כדי לשקול את המבחנות מיד לפני ואחרי הכנסת הזבוב, והגדירו את משקלו של כל זבוב על ידי חיסור שני הערכים.זבוב זכר בודד שוקל בדרך כלל בין 0.7 ל-1 מיליגרם כאשר הזבובים מוכנים. נבחן כעת את הכנת הרוטור לספין בזווית קסמה ברזולוציית גבוהה (H-R-M-A-S). כדי להתחיל.הניחו מבחנה אחת על קרח למשך פחות מדקה. כדי להרדים את הזבוב שבתוכה, הניחו את הזבוב על שכבת נייר אלומיניום המונחת על קרח והשתמשו במברשת רכה כדי לדחוף אותו בעדינות אל תוך החלל החלקי-ספירי של תא ה-NMR. ודאו שהזבוב הוכנס במלואו תוך הימנעות מגרימת פגיעות כלשהן.הניחו את המבואת (insert) לתוך צינור רוטור הזרקוניום-אוקסיד כדי למקם את הזבובים בין המבואת לבין תחתית הרוטור. כעת סגרו את המבואת באמצעות בורג וכסו אותה בפאראפילם (paraform) כדי למנוע כל מגע בין הזבוב לבין תמיסת הסטנדרט של TSP, המשמשת כייחוס הן להסתה כימית של התהודה והן לכימות. הוסיפו שמונה מיקרוליטרים (8 µL) של תמיסת סטנדרט TSB מעל המבואת של הרוטור, אבטחו והדקו את כל מערך הרוטור עם המכסה העליון. כעת נראה כיצד לרכוש נתוני H-R-M-A-S.הכנס את הרוטור לתוך הגשושית של ה-H-R-M-A-S ומקם אותו בזווית הקסם, 54.7 degrees. לאחר מכן, הגדר את קצב הסיבוב של ה-H-R-M-A-S-H one MRS לשני kilohertz MAS והשתמש בבקר מהירות MAS כדי לייצב אותו. הגדר את הטמפרטורה ל-four degrees Celsius באמצעות יחידת BTO 2000.בשימוש בשילוב עם יחידת ה-MAS הפנאומטית. הזבובים נשמרים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בזמן שהם בספקטרומטר כדי לשמר את ההרדמה, לצורך הכנת המגנט, כוונון והתאמה של הסליל לביצועים אופטימליים וביצוע shim למגנט לאיכות ספקטרה מיטבית. עם סיום ה-shimming, סנכרנו את עיכוב ה-INTERPULSE לתדר הסיבוב של ה-MAS.הגדירו את מספר הטרנזיינטים (transients) ל-256 עם 32,768 נקודות נתונים. רכשו ספקטרום חד-ממדי של מעוף בודד (single fly spectrum) באמצעות רכב מסונכרן לרוטור, רצף פולסים מסוג Purcell MEO kill או רצף פולסים מסוג CPMG spin echo. רצף זה פועל כמסנן T2 להסרה של הרחבה ספקטרלית.כעת רכשו ספקטרום דו-ממדי של זבב בודד (single fly spectrum) עבור כל הדגימות, תוך שימוש ברצף topsy עם פולסים של atic. פתחו את הרוטור והוציאו את הזבב. כעת נראה כיצד לנתח את הנתונים.אנו משתמשים בתוכנת mare כדי לנתח את ספקטרום ה-MR של הדגימות שלנו. ראשית, השתמשו בפונקציית הרחבת קו של 0.5 hertz והחילו אותה על כל ה-HRM A SH one fis לפני ביצוע טרנספורמציית פוריה. בצעו כיול של ספקטרום ה-MR ביחס ל-TS P בערך delta השווה ל-0.0 parts per million.בצעו פאזינג (Phasing) ידני לספקטרום והחילו מעריך בסיס (baseline estimator) מסוג Whitaker כדי להחסיר את הרכיבים הרחבים של קו הבסיס לפני חישובי שטחי הפסגות. העריכו את שטחי הפסגות באמצעות תוכנת mastre. נרמלו את גבהי הפסגות ביחס ל-TSP עבור כל ספקטרום שנרכש.כעת נבחן מספר תוצאות MRS מייצגות; המוצג כאן הוא ספקטרום מייצג של DH 1 H-R-M-A-S-C-P-M-G שנרכש מזבובים מסוג Oregon R. רכיבי ליפידים עיקריים, גליצרול ומטבוליטים קטנים כגון beta alanine, acetate, phosphocholine ו-phosphoethanolamine זוהו ושויכו בהתאם לדיווחים קודמים. אותות ב-2.02 parts per million שויכו לפרוטונים של המטילן ביחידת הפרופאן של חומצות שומן חד-בלתי רוויות. החומצות הבלתי רוויות זוהו באמצעות אות ב-5.33 parts per million שנוצר על ידי פרוטונים של יחידת האלקין.מטבוליטים קטנים שלא ניתן היה לשייך או שלא היו נראים באמצעות הספקטרום החד-ממדי (1D) זוהו באמצעות שתי תוכניות DH one H one top Z-H-R-M-A-S. כך שהראינו לכם לראשונה כיצד לחקור את הפרופיל הביוכימי של זבובי פירות (drosophila) חיים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית עם סיבוב בזווית קסמה ברזולוציה גבוהה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בפינצטה רכה כדי להכניס את הזבובים מבלי לפצוע אותם.ודאו שאינכם מהדקים את הבורג יותר מדי, כדי למנוע פגיעה בחרק, ואל תבצעו רכישת ספקטרה למשך יותר משעה שכן הזבובים עלולים שלא לשרוד. זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.

magnetic-resonance-spectroscopy-live-drosophila-melanogaster-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

מוצג כאן פרוטוקול להעברה קריוגנית של דגימות קפואות לזווית הקסם הדינמית של הקיטוב הגרעיני (DNP) המסתובב (MAS) גשושית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הפרוטוקול כולל הוראות לאחסון רוטור לפני הניסוי וכיוונים למדידות כדאיות לפני ואחרי הניסוי.

דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

המבנים המולקולריים והדינמיקה של מוצקים, נוזלים, גזים ותערובות הם בעלי עניין קריטי בתחומים מדעיים מגוונים. טמפרטורה גבוהה, לחץ גבוה באתרו MAS NMR מאפשר זיהוי של הסביבה הכימית של המרכיבים במערכות פאזה מעורבת תחת סביבות כימיות מבוקרות היטב.

טמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה באתרו זווית קסם ספינינג ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לכלי פופולרי יותר ויותר לבחינת הפנוטיפ של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מדגים את שיטות הדרושים כדי להשיג תפוקה גבוהה phenotyping של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות מרובות עכבר MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

כלי optogenetic מקודד גנטי מאפשרים מניפולציה לא פולשנית של תאי עצב ספציפיים...

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

חקור אפיון מולקולרי של Drosophila melanogaster חיה באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית HRMAS 1H-MRS. שיטה זו מאפשרת ניתוח מטבוליטים בתוך הגוף ללא פגיעה בנמלה.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

גלה סרטונים נוספים