קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

לאחר שהוצאו דיונוני בובטייל (bobtail squid) בוגרים מהמיכלים שלהם והורדמו באמצעות תמיסת מי ים מסוננים עם 2% ethanol, הם עברו דימום דרך כלי הדם הצפלי. באמצעות מזרק במידה 26.5, ההמולימפה שהופקה נראית כחולה.

בשל נוכחותו של המוציאנין, המהמוציטים מדוללים לריכוז הרצוי ומחולקים לאליקוטיים על גבי לית גסיס בעל שמונה תאים. לאחר שהמהמוציטים נצמדו לית הגסיס, הם נצבעים ב-CellTracker Orange, צבע פלואורסצנטי, ונחשפים לחיידקים המסומנים ב-GFP, אותם ניתן להדמיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שלום, אני ספנסר אולם מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קונטיקט.

ואני אנדרו קולינס מ-NY Home Lab. היום נראה לכם הליך להוצאת המולימפה או דם מהדיונון המנקה ההוואי. אתם מכינים את ה-opis.

דיונוני הזנב הקצר הם בעלי חיים ליליים הנמצאים מול חופי הוואי בקרבת שוניות אלמוגים, והם משתמשים באור המופק על ידי הסימביוזה שלהם כדי להסוות את עצמם בלילה כאשר הם יוצאים לצוד את מזונם המועדף, שרימפס. אנו משתמשים בקשר זה במעבדה כדי לחקור כיצד חיידקים מועילים מקולנזים רקמות של בעלי חיים. אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות בין מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של המארח לבין השותף הבקטריאלי הביולומינסצנטי שלו, VIO ide.

אם כן, נתחיל. לפני הפקת ההמולימפה (Hemolymph), הרדימו דיונון בוגר אחד בכלי כימי של ליטר אחד המכיל תמיסה שהוכנה טרייה של 2% ethanol ב-500 milliliters של מי ים מלאכותיים שעברו סטריליזציה באמצעות סינון. לאחר 10 דקות, הדיונון ייראה שוחה ולא יגיב באופן פעיל למגע.

עם זאת, עדיין יש להבחין בנשימה מתמשכת, כפי שמעידה תנועת המעטפת ופעילות הכרומטופורים המעידה על פעילות של תאי הפיגמנט. שפכו חלק מתמיסת מי הים הסטריליים והאתנול מהכלי למגש נתיחה סטנדרטי משעווה והטביעו את הדיונון במגש כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. באמצעות טיפ סטנדרטי של פיפט של 200 µL, משכו לאחור את המשפך ואת המעטפת כדי לחשוף את כלי הדם הצפלי הראשי הממוקם בין שתי העיניים.

השתמש במזרק סטרילי עם מחט במידה 26.5 כדי לדקור את כלי הדם הצפלי (cephalic) ולשאוב בין 50 ל-100 µL של המולימפה או 10 ל-20 µL. אם בעל החיים ישמש כתורם מספר פעמים, העבר את ההמולימפה למבחנה סטרילית של 1.5 mL על קרח. שים לב שאם שלב זה בוצע נכון, דם הדיונון צריך להיראות בכחול כהה.

העבירו את בעל החיים למכל עם מי ים רגילים להחייאה, לאחר מכן סובבו את ההמולימפה במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר כדי לשקע את ההמוציטים והסירו את הנוזל העלון בעזרת פיפטה. השעיקו מחדש את ההמוציטים ב-500 µL של תמיסת ריינגר לדיונונים לשטיפה. לאחר מכן, סובבו שוב כדי לשקע את התאים והסירו את הנוזל העלון.

לבסוף, השהו מחדש את דם הדיונונים (hemos) ואת תמיסת רינגר לדיונונים (squid ringer solution). קבעו את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר מכן, הוסיפו כ-2000 תאים לכל תא של זכוכית כיסוי.

יש לאפשר לתאים להיצמד לזכוכית למשך כ-10 דקות. בצפיפות זו, ה-hemos אמורים ליצור שכבה אחת אחידה (monolayer) על פני השטח של הזכוכית. יש להקפיא את ה-hemos על קרח בזמן הכנת החיידקים במנער אורביטלי בטמפרטורה של 28 °C.

גדלו זן אחד או יותר של חיידקי Vireo המכילים גן רפורטר פלואורסצנטי ירוק עד לשלב ה-mid log בתווך מי מלח עם טריטון. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 כדי לקבוע את צפיפות התאים; רכזו את החיידקים באמצעות סבב בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את המשקע. במיליליטר אחד של תמיסת רינגר לדיונונים, הוסיפו את החיידקים להמוציטים.

במטריצות של שקופיות זכוכית עם 100,000 חיידקים לכל תא. דגרו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. כדי להשיג קישור מקסימלי, הוסיפו cell tracker orange בריכוז סופי של 0.005% לצביעת הציטופלזמה.

דגרו למשך 30 דקות ולאחר מכן שטפו עם 150 µL של תמיסת ringer טרייה של דיונון. בעזרת מיקרוסקופ קונפוקאלי, בחנו את ההמיציטים הצבועים ואת החיידקים הנלווים אליהם, וספרו את החיידקים על פני כל שטח ההמיציט. כעת נציג לכם מספר תמונות מייצגות של המיציטים שנחשפו לחיידק Filio Harvey Eye הבלתי-סימביוטי המסומן ב-GFP ולחיידק הסימביוזה הטבעי של הדיונון, Filio fii.

כאן מוצגת תמונה של אתר המו (hemo site) שלא נחשף לחיידקים כלשהם. התא נראה אדום והפך לפעיל. לפיכך, ניתן לראות את תוספתיו הדמויות פסאודופודיה.

כאשר התא נחשף לחיידק הסימביוטי filio fii, ניתן לראות מספר קטן של חיידקים נקשרים לפני השטח של התא. עם זאת, כאשר החיידק הלא-סימביוטי filio Harvey Harveyi נחשף להמוס, נקשר מספר רב יותר של חיידקים באופן משמעותי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד למצות המולימפה מדיונון זנב-קצר, לבודד את ההמוס ולהשתמש בהם בניסויים לאפיון היצמדות חיידקים לתאי הדיונון הללו.

ניתן לשנות פרוטוקול זה לצורך אימונוכימיה על ידי קיבוע ההמוציטים לאחר היצמדותם למשטח של זכוכית הכיסוי. ניתן להפיק גם R-N-A-D-N-A וחלבונים לאחר שההמוציטים הופקו מהבעל החיים. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.