Name: דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו שיטת טרנסגנזה בדגי זברה לניתוח רכיבי מגבירים המעורבים בוויסות תעתיק של גנים בפיתוח השלד. שיטה זו מאפשרת זיהוי רצפים רגולטוריים קריטיים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לגב &#39;פאולה רועי עבור בעלי דגים מעולה, סטיב Ekker מתנה סוג של pDB600 פלסמיד. מחקרים אלו מומנו על ידי מענק של עד מד&quot;ב מ NHGRI.

1. בחירה שיבוט של רצפים שימור לבדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צריך קודם כל לזהות רצפים רגולטוריים פוטנציאל בדיקה פונקציונלית. אנו מסתמכים על שימור רצף אבולוציוני כקריטריון לבחור רצפים, ולרוב השימוש PhastCons אלגוריתם, אשר נגיש כמו מסלול בדפדפן הגנום UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). עם זאת, קיימים אלגוריתמים רבים אחרים הזמינים כדי להעריך שימור מינים על פני רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיש לנו נבחרת רצפים שלנו, אנו מתכננים primers כדי להגביר את כל הרצף של הדנ"א הגנומי. Primers יש לבחור כדי להגביר את האזור נשמרת פלוס 30 או יותר זוגות בסיסים בכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הגברה של רצפים נבחר אנו משתמשים במערכת LA TAKARA TaqTM. Polymerases אחרים יעבדו, אך חשוב להשתמש תערובת הכוללת אנזים עם יכולת הגהה, כדי למזער את הסיכוי של טעויות הציג במהלך הגברה. אנו לוודא את גודל amplicon ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 8/GW/TOPO PCR ת"א שיבוט Kit (Invitrogen) לשכפל את המוצר PCR לתוך וקטור המכיל כניסה לאתרים רקומבינציה attL, כדי ליצור את שיבוט כניסה Gateway. התגובה השיבוט יעיל יותר עם מוצר ה-PCR טריים, ולכן עדיף לבצע את השיבוט תוך יום של PCR. טרנספורמציה של זנים DH5α מתבצעת ואחריו מבחר התנגדות spectinomycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לאמת תוצר של שיבוט ת"א על ​​ידי עיכול של ~ 500ng של פלסמיד עם EcoRI לשחרר את הכנס, ולאשר את גודל להכניס את ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. המלצנו רצף לאמת את רצף להוסיף אוריינטציה; primers המשמש הגברה עשוי לשמש גם עבור סידור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאת clone את הערך, רצף ללא קידוד משומר הוא דילג על ידי רקומבינציה LR כדי Gateway וקטור היעד שלנו מוכן, pGW_cfosGFP1, באמצעות Gateway LR Clonase II אנזים מערבבים (Invitrogen). טרנספורמציה של זנים DH5α מתבצעת ואחריו מבחר התנגדות אמפיצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לאמת תוצר של רקומבינציה LR על ידי עיכול של ~ 500ng של פלסמיד עם EcoRV לשחרר את הכנס, ולאשר את גודל להכניס את ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. לאחר שיבוט מדויק זוהה, אנו מכינים פלסמיד דנ"א באמצעות HiSpeed ​​Qiagen ® ערכת Midi פלסמיד. בנוסף, אנו מטהרים את הפלסמיד באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, על פי הפרוטוקולים של היצרן, ה-DNA elute עם 30 מים μL חינם RNase. הפלסמיד הוא מדולל לריכוז של 125 ng / μL ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לפני זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קידוד RNA פונקציונלי אנזים Tol2 transposase הוא עיבד במבחנה מן pDB600 plasmid2. אנו לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת Midi-Prep Qiagen, אז linearize 10-20 מיקרוגרם עם XbaI. סינתזת mRNA מתבצעת בעקבות mMACHINE mMESSAGE ערכת פרוטוקול (Ambion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לטהר לזרז את הרנ"א בהתאם להוראות ערכה. אנו resuspend RNA לריכוז סופי של ~ 1μg/μl, או 20 μl לתגובה אחת, במים RNase בחינם, לכמת ידי לספקטרופוטומטריה UV. אנחנו גם לנתח ~ 1μg של RNA על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאמת שעתוק באורך מלא. למרות טה סטנדרטי או TBE ג'ל הוא מתאים ניתוח זה, למאגר מדגם denaturing הכלול בערכה שעתוק יש להשתמש בהתאם להוראות הערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בודקים כל אצווה חדשה של transposase RNA ליעילות ידי ביצוע זריקות עם (איור 1) ידוע פלסמיד. לאחר האימות, RNA מחולק aliquots קטנים המאוחסנים ב -80 ° C, כדי למנוע הפשרת חוזרות refreezing aliquots של הפרט. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. העובר דג הזברה הוזרקו Sox10 עכבר משפר כביקורת. (למעלה) תמונה brightfield (התחתון) תמונה GFP פלואורסצנטי. כל אצווה חדשה של transposase RNA הוא נבדק על יעילות. </li></ol> 2. Microinjection של עוברי דג הזברה לניתוח פסיפס מהונדס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מסירים את המחטים עבור microinjection מ 1.2 מ"מ זכוכית נימה OD נימי על פולר P-97 סאטר micropipette, עם תוכנית שנועדה תשואה טיפ חזק עם להתחדד חדה למדי לחדור chorions ללא פגע. אנו לשבור את עצות ביד תחת stereomicroscope כדי בקוטר חיצוני של כ 15 מיקרומטר, באמצעות סכין גילוח נקי שקופיות מיקרומטר. המחטים יכול להתבצע יום לפני זריקות, ומאוחסנים צלחת מחזיק מכוסה כדי לשמור על ניקיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו שומרים על דג הזברה שלנו על מחזור קבוע חשוך אור, עם 14 שעות של אור, תחת conditions3 סטנדרטי. יום לפני ביצוע microinjections, הקמנו דגים הזדווגויות מתוזמן במיכלי גידול קטן, כל אחד בהיקף של טנק בבסיס, להכניס מחוררת, ומכסה פלסטיק. אנחנו שמים שלוש נקבות או שני זכרים לכל tank בשורות מקבילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של microinjections, זמן קצר לאחר מחזור אור מתחילה, אנחנו מתחילים שילוב זכרים ונקבות מים מערכת שטופלו נקי לייצור ביצים. חשוב לבדוק את הדגים לעיתים קרובות, לאסוף את הביצים בתוך כמה דקות של הנחת, כדי לקבל קבוצות מסונכרן היטב. ייצור ביצה יכול להישמר במשך שעתיים עד שלוש שעות, על ידי המשך לשלב קבוצות של דגים טריים בכל בוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם משעמם רחב, 5 "1 / 4 כוס פיפטה פסטר מצוידת בנורה לטקס, אנו למיין את העוברים שנאספו לתוך 60 x 15 מ"מ צלחות פטרי, מילאו חלקית עם העובר Medium2, בקבוצות של 50 עוברים, ולסמן את הזמן שנאספו על את המכסה של כל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהדגים החלו בהנחת, אנו מכינים פתרון הזרקת טרי ידי ערבוב הבא צינור microfuge על הקרח: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td></td></tr><tr><td> Transposon מניות פלסמיד (125ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Transposase RNA מניות (175ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> מניות פנול אדום (2% ב H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNase מים חינם </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> המחטים הזרקת מוטלות מחזיק כלים מילא pipetting 500 nl טיפות של תמיסת הזרקה אל הקצה רחב של מחט כל אחד. לאחר נוזלי נשאבים אל קצה דרך פעולה נימי, פתרון נוסף ניתן להוסיף סך של μl 1.5-2. אנחנו מכינים לפחות שתי מחטים לפתרון כל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחט מלא הוא נטען לתוך היד החזיקה מחט בעל פניאומטיים Pico-משאבת ההזרקה או לחץ דומה, מוגדר ומחובר טנק N2 לפי הוראות היצרן. אנו לכייל כרכים הזרקה על ידי מדידת קוטר של טיפות גורשו לתוך שמן מינרלי בשקופית מיקרומטר. בדרך כלל, זמן הזרקה של 120 ms עם לחץ של 20 psi תניב טיפה של כ 1 nl, אבל שינויים קלים בקוטר מחט ישפיע אלה פרמטרים recalibration ייתכן שתידרש בין מחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקות מבוצעות תחת stereomicroscope בהגדלה 6-10X. אנו משתמשים זוג מלקחיים בסדר להחזיק את העובר במקום, לדחוף את המזרק עם לחץ קבוע דרך סיסית לתוך החלמון של העובר על תא אחד או בשלב מוקדם two התא. באופן אידיאלי, אנחנו עמדת קצה מחט החלמון ממש מתחת בלסטומרים. כ 1 nl של פתרון הזרקת מסולק והמחט נסוגה. עבור כל אחד לבנות אנו מזריקים ≥ 200 עוברים. כמו כן, חשוב מאוד עבור כל אחד מצמד של עוברים נאסף, כדי להציל את צלחת של עוברים בקרת uninjected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זריקות הושלמו אנו למיין את העוברים על ידי הסרת ביצים מופרית, עוברים פגומים, וזריקות נכשל (עוברים עם אדום לא פנול ב בלסטומרים). לאחר מכן, אנו עוברים דגירה במדיום העובר על 28.5 מעלות צלזיוס עד השעה המתאימה לתצפיות. </li></ol> 3. ניתוח דפוסי ביטוי פסיפס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן דגירה המתאים, אנו בוחנים את העוברים מוזרק עבור פלואורסצנטי. העיתוי תלוי דפוס הביטוי של הגן הנורמלי דג הזברה אנדוגני, אבל אנחנו נראים בדרך כלל יומי באמצעות הפריה הימים הראשונים שלאחר 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו בודקים את העוברים על הקרינה על macroscope אולימפוס MVX10 המותאם epifluorescence, אבל כל מיקרוסקופ דומה מסוגל הדמיה צריכת חשמל נמוכה יעבוד. אם יש מספר גדול של עוברים שמתו או פיתחו באופן חריג ביום הראשון, מסתכל על שולטת uninjected עבור המצמד כי כדי לראות אם הם נראים נורמליים. אם שולט להיראות נורמלי, הבעיה הנפוצה ביותר היא טוהר מספקת של ה-DNA מוזרק. כמו כן, עוברים בשלבים מוקדמים רגישים הסכום הכולל של פלסמיד מוזרק, ולכן יתכן כי כימות היה מדויק ו-DNA יותר מדי שהוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בוחנים את העוברים, יש לזכור כי הם יהיו כולם בשביל לבנות את פסיפס מוזרק. יהיה צורך לבדוק היטב את כל העוברים, במיוחד אם תחום הצפוי של ביטוי הוא קטן. זכור גם כי הביטוי יכול להיות דינמי, הקרינה חזקה ביום 1 עלול להיעלם על ידי 2 יום, עוברים שלילי הביטוי הראשון 3 ימים יכול להראות משהו ביום 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בוחרים כמה עוברי עם ביטוי נרחב יותר, ולהשתמש אלה כדי לתעד את דפוס הקרינה על ידי photomicroscopy. לאחר 5 ימים של תצפיות, העוברים יש להחזיר את המתקן וגדל כמו מניה. בתוך כמה חודשים, המבוגרים יכול להיות מוקרן להעברת germline של transgenes. </li></ol> 4. תוצאות אנו רואים v רחבariety של דפוסי ורמות הביטוי, בהתאם לאלמנט משפר להיות מנותח. אנחנו בדרך כלל מעוניינים מאוד דפוסי רקמות ספציפיות ביטוי, ולעתים קרובות הם מתמקדים הגנים מתבטאת השלד. ולעתים קרובות הם מתמקדים הגנים מתבטאת השלד. תרשים 2 מציג דוגמאות של דפוסי ביטוי פסיפס צפינו בעוברים מוזרק שלנו, עם משפרי ויסות ביטוי סחוס ועצם. לבסוף, חלק ניכר של רצפי שנבדקו לא לווסת ביטוי ברקמה מסוימת. עבור אלו, אנו רואים לעתים קרובות ביותר פלואורסצנציה מעט מאוד, אולי מפוזרים כמה תאים לכל עובר. לעתים רחוקות יותר, נוכל לראות את הקרינה, אבל רק שני אתרים משותפים עבור הביטוי חוץ רחמי, האפידרמיס ואת שרירי השלד (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה של דפוסי סחוס ועצם הביטוי שנצפתה עוברים מוזרק. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. יש מתאם קטן בין המיקום היחסי של משפר את הגן ורגולציה הביטוי. חלק משמעותי של רצפי שנבדקו לא לווסת ביטוי ברקמה מסוימת. אלה לעתים קרובות יש מעט מאוד פלואורסצנטי, או אולי שני אתרים משותפים עבור ביטוי אקטופי: האפידרמיס שרירי השלד. (למעלה) brightfield (התחתון) תמונה GFP הקרינה התמונה.

<ol><li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li>
<li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).</li>
</ol>

אנחנו הוכיחו את הגישה בשימוש במעבדה שלנו לניתוח יעיל של משפרי פוטנציאליים באמצעות transgenesis דג הזברה. לרוב, אנו משתמשים בגישה זו כדי לחפש רקמות ספציפיות משפרי הקשורים הגנים האנושיים. למרות חוסר הומולוגיה רצף ברור רוב הזמן בין אדם ודגים ללא קידוד רצפים, אנו מוצאים כי גישה זו היא בדרך כלל מצליחה לזהות משפרי עבור הגנים שמעניינים אותנו. גורמים קריטיים להצלחה מטפלים בהכנה של ה-DNA ואת הפלסמיד RNA transposase, והזרקת ובחינת מספר מספיק של עוברי לבנות עבור כל אחד. שיטות הכללי של הבנייה...

<table><tbody><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara Bio Inc</td><td>RR02M</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לשיבוט pCR8/GW/TOPO TA</td><td>Invitrogen</td><td>K2500-20</td><td></td></tr><tr><td>תערובת אנזימי Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>תאי DH5&amp;alpha; כשירים ליעילות ספרייה</td><td>Invitrogen</td><td>12535-019</td><td></td></tr><tr><td>תאי DB3.1 כשירים ליעילות ספרייה</td><td>Invitrogen</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>ערכת mMESSAGE mMACHINE</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>ערכת HiSpeed Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ערכת QIAquick לטיהור PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>משאבת PicoPump פנאומטית</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr></tbody></table>

דג הזברה פסיפס transgenesis להערכת רצפים enhancer

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

השלמת רצף הגנום האנושי, יחד עם זה של מינים רבים אחרים, הדגיש את האתגר של ייחוס תפקיד ספציפי רצפים שאינם קידוד. פונקציה אחת הבולטות שביצעה השבר ללא קידוד של הגנום הוא לווסת את שעתוק הגנים, אולם אין שיטות יעילות רחב לחזות cis-הרגולציה אלמנטים רצף הדנ&quot;א העיקרי. פיתחנו פרוטוקול יעילה מבחינה תפקודית להעריך את הפוטנציאל cis-הרגולציה אלמנטים דרך transgenesis דג הזברה. הגישה שלנו מציעה יתרונות משמעותיים על פני תרבית תאים טכניקות המבוססות על הגנים החשובים מבחינה התפתחותית, שכן הוא מספק מידע על ויסות הגנים במרחב ובזמן. לעומת זאת, הוא מהיר יותר ופחות יקר מאשר ניסויים דומים העכברים הטרנסגניים, ואנחנו שגרתי להחיל אותה על רצפים מבודדים מן הגנום האנושי. כאן אנו מדגימים את הגישה שלנו בחירת האלמנטים לבדיקה המבוססת על שימור רצף פרוטוקול שלנו רצפים שיבוט microinjecting אותם עוברי דג הזברה.

אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

השלמת רצף הגנום האנושי, לצד רצפים של מינים רבים אחרים, הדגישה את האתגר הכרוך בייחוס תפקוד ספציפי לאזורים שאינם...

שלום, אני אריקה קגי מהמעבדה של שאנון פישר במחלקה לביולוגיה של התא והתפתחות באוניברסיטת פנסילבניה. אני כריס ובר, גם אני ממעבדתה של פישר. ואני שאנון פישר.היום נדגים בפניכם פרוצדורה לניתוח התפקוד של אלמנטים מגבירים (enhancer elements) באמצעות טרנסגנזה בדגי zebrafish. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור רגולציה שקיפית של גנים החשובים להתפתחות השלד. אז בואו נתחיל.כדי לזהות רצפים שאינם מקודדים הסובבים גנים מועמדים, אנו משתמשים באלגוריתם fast cons, הזמין כערוץ (track) בדפדפן הגנום של uc SC. אנו מתמקדים בעיקר בגנים המובעים במהלך התפתחות השלד, אך ניתן להשתמש בגישה דומה כדי לחקור כל גן המובע בשלבי התפתחות מוקדמים. בדוגמה המוצגת כאן, זיהינו רצפים שמורים.במרווח הסובב את הגן bumper האנושי, אנו בוחנים את המרווח כולו עד לגנים הסמוכים וקובעים סף ניקוד לוגריתמי (log score) נמוך וספציפי לגודל, המקביל לכ-5% העליונים של הרצף שאינו מקודד. לאחר בחירת הרצפים, תוכנן פריימרים באמצעות Primer3 להגברה של כל רצף מ-DNA גנומי אנושי; יש לבחור פריימרים שיגבירו את האזור השמור בתוספת של 30 זוגות בסיסים או יותר מכל צד. הגבר את אזור העניין באמצעות פולימראז באיכות גבוהה תוך שימוש ב-DNA גנומי אנושי, והשתמש בנהלי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים במעבדה כדי לשבט את התוצר המוגבר אל תוך וקטור ביטוי.הווקטור שבו נעשה שימוש בפרוטוקול זה הוא PG wc FOS GFPA gateway. ווקטור יעד (Destination vector). לאחר יצירת הווקטור, יש לבצע טרנספוזציה.האנזים הדרוש לטרנספוזיציה מתומלל תחילה in vitro באמצעות ערכת M message M machine מבית Ambion והפלסמיד PGB 600 לפני ההזרקות הניסוייות. יש לבחון את היעילות של כל מנת טרנספוזים על ידי הזרקה עם מחזק ידוע, כגון mouse socks. 10 enhancer.להכנה להזרקות, משוך את המחטים המשמשות למיקרו-הזרקה מzכלי זכוכית קפילריים בעלי קוטר חיצוני של 1.2 millimeter באמצעות מכשיר משיכת מיקרו-פיפט מסוג Sutter P 97. השתמש בתוכנית המניבה קצה חזק עם היטרויות חדה כדי לחדור דרך קוריון שלם בעזרת להב תער נקי וסנפליט מיקרומטרי. שבור את הקצוות ידנית תחת מיקרוסקופ סטריאומקרוסקופי עד לקוטר חיצוני של כ-15 micrometers.ניתן לאחסן את המחטים למשך יום בצלחת אחסון מכוסה. יש לתחזק את אוכלוסיית דגי הזברה במחזור אור-חושך קבוע של 14 שעות אור בתנאים סטנדרטיים ביום שלפני ביצוע ההזרקות המיקרוסקופיות. הכינו את הדגים להכלאות מתוזמנות במיכלי רבייה קטנים.הניחו שלוש נקבות או שני זכרים בכל מיכל בשורות מקבילות בבוקר ההזרקות המיקרוסקופיות, זמן קצר לאחר תחילת מחזור התאורה. שלבו זכרים ונקבות במים מטופלים של המערכת הנקייה לצורך הפקת ביצים. בדקו את הדגים בתדירות גבוהה ואספו את הביצים תוך דקות ספורות מההפקה כדי לקבל סדרות מסונכרנות היטב.יש לשמור על ייצור הביצים במשך שעתיים עד שלוש שעות על ידי המשך שילוב קבוצות דגים טריות לאורך כל הבוקר, באמצעות פיפטת זכוכית רחבה בקוטר 5.25 אינץ' המצוידת בנורית לטקס. יש למיין את העוברים שנאספו לתוך צלחוני פטרי במידה של 60 על 15 מילימטר, הממולאים חלקית בתמיסת גידול לעוברים, בקבוצות של 50 עוברים. יש לסמן את זמן האיסוף על מכסה כל צלחון.עבור כל מקבץ עוברים שנאסף, שמור מנה של 50 עוברים כביקורת ללא הזרקה בין איסופי הביצים. הכן תמיסות הזרקה טריות על ידי ערבוב הרכיבים הבאים במבחנה למיקרו-צנטריפוגה ושמור אותן על קרח. הנח את מחטי ההזרקה במ只能ות אחסון ומלא אותן ב-1.5 עד 2 µL מתמיסות ההזרקה.על ידי טפטוף של 500 nanoliter על הקצה הרחב של כל מחט. הנוזל יימשך אל הקצה באמצעות פעולת נימיות. הכינו לפחות שתי מחטים עבור כל תמיסת הזרקה.העמס את המחט הממולאת אל תוך מחזיק המחט הידני של משאבת pico פנומטית או מזריק לחץ דומה, המוגדר ומחובר למיכל חנקן בהתאם להוראות היצרן. כייל את נפחי ההזרקה על ידי מדידת קוטר הטיפות המופלטות אל תוך שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר, בדרך כלל בזמן הזרקה של 120 milliseconds.בלחץ של 20 PS, אפיק טיפה של כננוליטר אחד תוך שימוש במיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 6 עד 10x. החזק את העובר במקומו באמצעות פינצטה עדינה ודחף את מחט ההזרקה בלחץ קבוע דרך הכוריון אל תוך החלמון של עובר בשלב תא אחד או שלב מוקדם של שני תאים; מקם את קצה המחט בחלמון ממש מתחת לבלסטומרים, פלוט כננוליטר אחד של תמיסת ההזרקה ונשוף את המחט. עבור כל מבנה (construct) נזריק ל-200 עוברים או יותר. לאחר השלמת ההזרקות, מיין את העוברים על ידי הסרת ביצים שלא הופרו, עוברים פגומים, הזרקות שנכשלו או עוברים ללא phenol red בבלסטומרים.לאחר מכן אנו מדגירים את העוברים ואת מצע גידול העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C עד למועד התצפיות המתאים. כעת נציג בפניכם מספר תוצאות מייצגות של אלמנטים משפרי ביטוי (enhancer elements) המייצרים דפוסי ביטוי של GFP ספציפיים לרקמה בעובר דג הזברה. אנו חוקרים גנים המבטאים בעצם או בסחוס במהלך.להלן דוגמה לאלמנט משפר (enhancer) שמעלה הגן acan, אשר מווסת את הביטוי בסחוס הפנים-גולגולתי שלושה ימים לאחר ההפריה. להלן משפר נוסף, הפעם מהגן bumper, המווסת את הביטוי בתאי עצם. בחמישה ימים, מתוך המשפרים הרבים שזיהינו, אנו מוצאים מתאם נמוך בין המיקום ביחס לגן לבין ויסות הביטוי.בעת בחירת רצפים לבדיקה, חשוב לזכור שאלמנט מגביר (enhancer) יכול להימצא במרחק של מאות kilobases במעלה הזרם (upstream) או במורד הזרם (downstream) של הגן, או באחד האינטרונים, כפי שניתן לראות בעובר זה. חלק ניכר מהרצפים אינם נראים ככאלה המווסתים ביטוי ספציפי לרקמה. אלו לרוב מראים פלואורסצנציה נמוכה מאוד או עשויים להציג מספר תאים מפוזרים בשני אתרים נפוצים לביטוי אקטופי: האפידרמיס והשריר השלדי.הרגע הדגמנו כיצד לזהות אלמנטים פוטנציאליים של מחזקים (enhancers) באמצעות שימור רצפים, וכיצד לבחון את תפקודם באמצעות טרנסגנזה פסיפסית (Mosaic transgenesis) בדגי zebrafish. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחון את איכות ה-DNA וה-RNA המשמשים להזרקה. כמו כן, יש לבחון בקפידה את כל העוברים המוזרקים, במיוחד אם מצופה ביטוי רק בקבוצה קטנה של תאים.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית...

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

מטרת מחקר זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש באסטרטגיית טרנסגנזה של פסיפס בדגי זברה כדי להעריך במהירות וביעילות את התרומות היחסיות של אונקוגנים מרובים בהתחלת הגידול והתקדמותו in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

למדו שיטת טרנסגנזה בדגי זברה לניתוח רכיבי מגבירים המעורבים בוויסות תעתיק של גנים בפיתוח השלד. שיטה זו מאפשרת זיהוי רצפים רגולטוריים קריטיים בביולוגיה התפתחותית.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

גלה סרטונים נוספים