דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

היי, אני אריקה קגי מהמעבדה של שאנון פישר במחלקה לביולוגיה של התא וההתפתחות באוניברסיטת פנסילבניה. אני כריס וובר, גם הוא ממעבדת פישר. ואני שאנון פישר.

היום נראה לך נוהל לניתוח תפקודם של אלמנטים משפרים באמצעות טרנסגנזה של דג הזברה. אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור תקנות שעתוק של גנים חשובים בהתפתחות השלד. אז בואו נתחיל.

כדי לזהות רצפים לא מקודדים סביב גנים מועמדים, אנו משתמשים באלגוריתם מהיר חסרונות, הנגיש כמסלול בדפדפן הגנום uc SC. אנו מתעניינים בעיקר בגנים המתבטאים במהלך התפתחות השלד, אך ניתן להשתמש באותה גישה כדי לחקור גנים המתבטאים בהתפתחות מוקדמת. בדוגמה המוצגת כאן, זיהינו רצפים משומרים.

במרווח המקיף את גן הפגוש האנושי, אנו בוחנים את כל המרווח לגנים הסמוכים וקובעים חתך ציון לוג ספציפי בגודל נמוך המתאים לכ-5% העליונים של רצף לא מקודד. לאחר בחירת רצפים, תכנן פריימרים באמצעות פריימר שלוש כדי להגביר כל רצף מהגנום האנושי, יש לבחור פריימרים של DNA כדי להגביר את האזור השמור בתוספת 30 זוגות בסיסים או יותר משני הצדדים. להגביר את אזור העניין עם פולימראז באיכות גבוהה באמצעות DNA גנומי אנושי, להשתמש בהליכי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים במעבדה כדי לשכפל את המוצר המוגבר לווקטור ביטוי.

הווקטור המשמש בפרוטוקול זה הוא שער PG wc FOS GFPA. וקטור יעד. בעקבות יצירת וקטור נאמר לטרנספוזיציה.

האנזים הנדרש לטרנספוזיציה מתומלל תחילה במבחנה באמצעות ערכת המכונה M message M מבית Ambion והפלסמיד PGB 600 לפני הזרקות ניסיוניות. בדוק את יעילות כל אצווה של טרנספוזיציות על ידי הזרקה עם משפר ידוע כמו גרבי העכבר. 10 משפר.

כדי להתכונן להזרקות, משוך את המחטים המשמשות להזרקת מיקרו מזכוכית נימית נימה בגודל 1.2 מילימטר על חולץ מיקרופיפט Sutter P 97. השתמש בתוכנית שמניבה קצה חזק עם מתחדד חד כדי לחדור לקוריון שלם עם סכין גילוח נקי ומגלשת מיקרומטר. שוברים את הקצוות ביד מתחת למיקרוסקופ סטריאו לקוטר חיצוני של כ -15 מיקרומטר.

ניתן לאחסן את המחטים למשך יום בכלי אחיזה מכוסה. שמרו על אוכלוסיית דגי הזברה במחזור אור כהה רגיל עם 14 שעות אור בתנאים סטנדרטיים ביום שלפני ביצוע הזרקות מיקרו. הכן דגים להזדווגות מתוזמנת במיכלי גידול קטנים.

הניחו שלוש נקבות או שני זכרים לכל מיכל בשורות מקבילות בבוקר זריקות המיקרו זמן קצר לאחר תחילת מחזור האור. שלב זכרים ונקבות במים שטופלו במערכת נקייה לייצור ביציות. בדוק את הדגים לעתים קרובות ואסוף את הביצים תוך מספר דקות מהייצור כדי לקבל קבוצות מסונכרנות היטב.

שמרו על ייצור הביצים במשך שעתיים-שלוש על ידי המשך שילוב קבוצות דגים טריות לאורך כל הבוקר עם פיפטה רחבה של חמישה ורבע אינץ' זכוכית המצוידת בנורת לטקס. מיין את העוברים שנאספו לצלחות פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר, מלאות חלקית במדיום עוברי בקבוצות של 50 עוברים. סמן את הזמן שנאסף על מכסה כל מנה.

עבור כל מצמד של עוברים שנאספו, שמרו צלחת של 50 עוברים לבקרה שהוזרקה בין אוספי הביציות. הכן תמיסות הזרקה טריות על ידי ערבוב המרכיבים הבאים בצינור מיקרו פוגה ואחסן על קרח. הניחו את מחטי ההזרקה בכלים מחזיקים ומלאו ב-1.5 עד שני מיקרוליטר של תמיסת הזרקה.

על ידי פיפטינג של 500 ננוליטר טיפות על הקצה הרחב של כל מחט. הנוזל יימשך לקצה באמצעות פעולה נימית. הכן לפחות שתי מחטים לכל תמיסת הזרקה.

טען את המחט המלאה לתוך מחזיק המחט הידני של משאבת פיקו פנאומטית או מזרק לחץ דומה. מוגדר ומחובר למיכל חנקן לפי הוראות היצרן. כיול נפחי הזרקה על ידי מדידת קוטר הטיפות הנפלטות לשמן מינרלי בשקופית מיקרומטר, בדרך כלל זמן הזרקה של 120 אלפיות השנייה.

בלחץ של 20 כ"ס, אני מניב טיפה של כ-1 ננו-ליטר באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 6 עד 10. החזיקו את העובר במקומו עם זוג מלקחיים עדינים ודחפו את מחט ההזרקה בלחץ קבוע דרך הקוריון לתוך החלמון של עובר בשלב של תא אחד או שני תאים מוקדמים, מקמו את קצה המחט בחלמון ממש מתחת לבלסטומרים, הוציאו כליטר אחד של תמיסת הזרקה ומשכו את המחט עבור כל מבנה שאנו מזריקים גדול או שווה ל-200 עוברים לאחר השלמת ההזרקה. מיין את העוברים על ידי הסרת ביציות לא מופרות, עוברים פגומים וזריקות כושלות או עוברים ללא פנול אדום בחילול הקודש.

לאחר מכן אנו דוגרים על העוברים והמדיום העוברי בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לזמן המתאים לתצפיות. כעת נראה לך כמה תוצאות מייצגות של אלמנטים משפרים המייצרים דפוסים ספציפיים לרקמות של ביטוי GFP בעובר דג הזברה. אנו חוקרים גנים המתבטאים בעצם או בסחוס במהלך.

הנה דוגמה לאלמנט משפר במעלה הזרם של גן האקאן המווסת את הביטוי בסחוס הפנים הגולגולתי שלושה ימים לאחר ההפריה. הנה משפר נוסף, הפעם מגן הפגוש המווסת את הביטוי בתאי העצם. בחמישה ימים מתוך המשפרים הרבים שזיהינו, אנו מוצאים מתאם מועט בין המיקום ביחס לגן לבין ויסות הביטוי.

בבחירת רצפים לבדיקה, חשוב לזכור שמשפר יכול להיות מאות קילו-בסיסים במעלה הזרם או במורד הזרם של גן או באחד האינטרונים כפי שניתן לראות בעובר זה. נראה שחלק ניכר מהרצפים אינם מווסתים את הביטוי הספציפי לרקמה. אלה מראים לעתים קרובות מעט מאוד פלואורסצנטיות או שיש להם כמה תאים מפוזרים בשני אתרים נפוצים לביטוי חוץ רחמי, האפידרמיס ושריר השלד.

זה עתה הראינו לך כיצד לזהות אלמנטים משפרים פוטנציאליים באמצעות שימור רצף ולבדוק את תפקודם באמצעות טרנסגנזה של פסיפס בדג הזברה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבחון את איכות ה-DNA וה-RNA שלך להזרקות. כמו כן, הקפד לבחון היטב את כל העוברים המוזרקים שלך, במיוחד אם אתה מצפה לביטוי רק בקבוצה קטנה של מכירות.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.