Name: מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: למדו לבודד נויטרופילים מדם אנושי ולהפעילם ליצירת מלכודות תאיות חוץ-תאיות (NETs) באמצעות גירויים כימיים או ביולוגיים. השיטה כוללת הדמיה במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ואלקטרונים לניתוח מבנה ותפקוד המלכודות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. PMN ניתוק מן דם אדם השתמש על דם אנושי 24 מ&quot;ל עם EDTA או הפרין (10 U / ml) כמו נוגד קרישה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל Histopaque 1119 על צינור פלקון 15 מ&quot;ל ובזהירות 5-7 שכבת מ&quot;ל דם מלא על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 800 XG ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק השכבה העליונה צהבהב ברור ולהעביר שלב נמוך יותר אדמדם המכיל גרנולוציטים טרי לתוך צינורות פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי ממלא את הצינורות פלקון עם PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין פתרון Percoll 100% על ידי ערבוב 18 מ&quot;ל Percoll עם 2 מ&quot;ל PBS 10x. עם 1x PBS להכין 4 פתרונות מ&quot;ל של 85%, 80%, 75%, 70% ו 65% Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מבחנות פלקון עם שיפוע Percoll ידי מ&quot;ל 2 שכבות של אחוז כל אחד על השני בסדר יורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה להסיר את supernatant, לשלב כדורי ותאי משקעים resuspend ב 4 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות שכבה 2 מ&quot;ל של resuspension על כל אחד gradients. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 800 XG ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה להסיר את השכבה העליונה ביותר של שכבה% 65 עם PBMCs ולאסוף interphases הנותרים לבן עד שכבה 85% לתוך צינורות חדשים פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי מילוי את צינורות פלקון עם PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים משקעים supernatant ו resuspend (בדרך כלל&gt; 95% הם PMN) ב 2ml של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> 2. הפעלת PMNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 24 גם תרבות צלחת התא על ידי הצבת סטרילית 13 מ&quot;מ זכוכית עגול לכסות להחליק (# 1,5) לתוך כל טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 2 x 10 5 תאים 500μl RPMI (המכיל 2% אנושי בסרום אלבומין) לכל היטב דגירה עבור 1h ב-CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין 600 nM PMA פתרון RPMI ולהוסיף תאים 100μl לכל טוב. דגירה של 15 דקות עד 4 שעות ב-CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים 4% (ריכוז בסוף) paraformaldehyde מומס PBS. </li></ol> PMA משמש בקרה חיובית היא עד עכשיו הסוכן החזק ביותר כדי לגרום להיווצרות NET. לחלופין, גירויים אחרים או שיתוף טיפוח עם פתוגנים יכול לשמש לזירוז NET. מעמדו של היווצרות בהתאמה NET ניתן לבדוק כמובן בעוד זמן מתנהל, אם דגימות במקביל נוספים מוכנים. אם צבע לא permeant DNA כמו Sytox הירוק (Invitrogen) מתווסף הלא קבוע תאים, רק תאי ה-DNA יזוהו. מאז הקמת רשתות חדשות נפגעת איכשהו בנוכחות Sytox, לכל נקודת זמן דגימה אחת במקביל יש להשתמש. 3. זיהוי על ידי NET immunolabeling NETS הם שבירים מאוד, גם לאחר קיבוע ויהיה צורך לטפל בזהירות רבה, אחרת רוב תלך לאיבוד במהלך תקופת ההכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר מכסה מחליק זכוכית עם תאים המצורפת מהצלחת 24 גם על ידי תרבות מרימה אותו בקצה עם מחט מעוקל לתפוס אותו עם מלקחיים בסדר. שים את הפתק לכסות במהופך על ירידה של PBS. ניתן לעשות זאת על גיליון Parafilm המכסים לעמוד מבחנה. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תלושי לכסות באותו אופן לירידה של 0.5% Triton X-100 דקות ב 1 RT כדי permeabilize תאים. לשטוף 3 פעמים PBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תא לח עם Parafilm וכן רקמות רטוב. Lay לכסות את תלושי במהופך על ירידה של חיץ חסימה (5% חמור בדם) ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים ראשוניים, למשל ms אנטי Histon ו rb נגד נויטרופילים Elastase, בחסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מכסה מחליק בתא לח ישירות חסימת חיץ על ירידה של הנוגדן הראשוני דגירה של 1 ש &#39;ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים 5 דקות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משנית, למשל dk אנטי ms Cy2 ו dk אנטי rb Cy3, בחסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מכסה מחליק לתוך תא לח על ירידה של נוגדנים משני דגירה של 1 ש &#39;ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים 5 דקות עם PBS. בהתאם לאפשרויות שלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי, DNA כתם במשך 5 דקות או עם Hoechst 33,342 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) אשר יצטרכו עירור UV או עם Draq5 עבור עירור אדום רחוק ולשטוף פעמיים עם dist. המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר ירידה של 20μl Mowiol לשקופית זכוכית הר תלושי לכסות עם תאים במהופך. התאים צריכים להיות בין להחליק את המכסה המחליק. ירידה של Mowiol יהוו שכבה דקה של עובי אחיד כאשר להחליק לכסות ממוקם על הירידה. בדרך כלל, אין צורך ללחוץ על מדגם. אם אתה רוצה להשתמש בעדשות-טבילה לא, הדגימה מוכן לבדיקה.ניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה, שלא הדגימה יבש במשך שעה על 1 עד Mowiol יש הקרושה בקצה של המדגם. </li></ol> 4. NETS הכנה מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הודעה על התאים לתקן את מכסה מחליק כוס בצלחת 24-היטב עם glutaraldehyde 2,5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים מהצלחת 24 גם תרבות לשים במהופך על טיפת מים. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הכיסוי האחורי מחליק לתוך צלחת 24 גם תא תרבות המכיל 0.5% OsO4 ו דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים מהצלחת 24 גם תרבות לשים במהופך על טיפת מים. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הכיסוי האחורי מחליק לתוך צלחת 24 גם תא תרבות המכילים חומצה טאני 1% ו דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2-4.4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים באמצעות משטר הבאה (5min כל אחת): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מכסה מחליק לתוך מייבש נקודה קריטית דגימות יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל פני השטח של הדגימה בשכבה פלטין / פחמן 5nm באמצעות המאייד שכבה דקה </li></ol> 5. נציג תוצאות: שיטת בידוד בדרך כלל תשואות נויטרופילים קיימא unstimulated עם טוהר יותר מאשר 95%. כאשר קבוע בנקודות זמן שונות לאחר הגירוי, פרוטוקול immunostaining מציגה את רצף של שינויים מורפולוגיים במהלך תא NETosis משטחת, אובדן האוניות גרעיני, אובדן גרגיר שלמות הגרעין שמוביל חפיפה הגוברת של הגרעין (כלומר היסטון) ו פרטנית (כלומר נויטרופילים Elastase) מכתים. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת מוצא לניתוח אינטראקציות ספציפיות של פתוגנים עם נויטרופילים. אינטראקציה זו יכולה להיות ניתח בפירוט רב יותר באמצעות פרוטוקול כהכנה מיקרוסקופיית אלקטרונים. NET פלואורסצנטי דוגמה של נויטרופילים מגורה מוכתם עבור רכיבים NET (כחול = DNA, אדום = היסטון, ירוק = נויטרופילים Elastase). התמונות מראות, מלבד לוקליזציה NET, לוקליזציה של DNA גרעיני ההיסטונים ואת תבנית פרטנית עבור נויטרופילים Elastase. SEM גירוי PMA סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מראה נויטרופילים מגורה PMA-מגורה לא. לאחר גירוי, נויטרופילים לשטח החוצה לייצר הרשתות. SEM רשתות Shigella רזולוציה גבוהה SEM התמונה של החיידק שיגלה לכודים הרשתות.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

פרוטוקול בתנאי יאפשר את בידודה של נויטרופילים מגורה על טוהר הלא מבוטל, הגיוס של היווצרות NET ועל ניתוח של שינויים מורפולוגיים במהלך NETosis. כאשר הטיפול דגימות בזהירות, כלומר הימנעות כביסה התנאים הקשים אשר תגרום לאובדן של רוב NETS מחוברת באופן רופף, בסכום של היווצרות NET בתנאים גירויים שונים (משך, גירוי) ניתן להשוות. במובן זה, את הפרוטוקולים ובלבד יכול לשמש כנקודת מוצא להקים שיטות לנתח תרחישים מתוחכמים יותר: אינטראקציות נויטרופילים / הפתוגן, רצף של גירויים, יחסי הגומלין עם תאים חיסוניים אחרים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

גרנולוציטים נויטרופילים הם הקבוצה הנפוץ ביותר של לויקוציטים בדם ההיקפי. כפי phagocytes מקצועי, הם חיידקים לבלוע ולהרוג אותם intracellularly כאשר גרגרי הפתיל מיקרוביאלית שלהם עם phagosome. מצאנו כי נויטרופילים יש דרך נוספת של הרג מיקרואורגניזמים: על הפעלה, הם משחררים חלבונים גרגיר וכרומטין כי יחד טופס סיבי תאית כי פתוגנים לאגד. אלו מבנים חדשים, או מלכודות תאי נויטרופילים (סלים), לבזות גורמים ארסיות ו 1 להרוג חיידקים, פטריות וטפילים 2 3. עמוד השדרה הוא מבנה של רשתות ה-DNA, והם מפורקים במהירות בנוכחות DNases. לפיכך, חיידקים להביע DNases הם אלימים יותר 4. באמצעות מיקרוסקופ המצטרף שילוב TEM, SEM, immunofluorescence ולחיות טכניקות הדמיה התא, נוכל להראות כי על גירוי, הגרעינים של נויטרופילים מאבדים את צורתם ואת האיחוד האירופי ו heterochromatin homogenize. מאוחר יותר, את המעטפה גרעיני ממברנות גרגיר להתפורר ומאפשר ערבוב של הרכיבים NET. לבסוף, הנטס משתחררים כמו הפסקות קרום התא. זה מוות של תאים התוכנית (NETosis) הוא נבדל אפופטוזיס ונמק ותלוי הדור של מינים החמצן מגיב על ידי מונואמין NADPH 5. מלכודות תאי נויטרופילים נפוצים באתרים של דלקת חריפה. NETS להיראות סוג של תגובה חיסונית מולדת כי מיקרואורגניזמים לאגד, למנוע מהם להתפשט, ולהבטיח ריכוז מקומי גבוה של סוכני מיקרוביאלית לבזות גורמים ארסיות ולהרוג פתוגנים ובכך מאפשר נויטרופילים למלא פונקציה מיקרוביאלית שלהם גם מעבר תוחלת החיים שלהם. יש להגדיל את הראיות, עם זאת, רשתות, כי הם מעורבים גם מחלות אשר נע בין אוטואימוניות תסמונות לעקרות 6. אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מתוך 7 דם היקפיים האדם לעורר אותם בצורה הרשתות. כמו כן, אנו כוללים פרוטוקולים לדמיין את הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

גרנולוציטים נויטרופיליים הם קבוצת הלוקוציטים השכיחה ביותר בדם הפריפרי. כפאגוציטים מקצועיים, הם בולעים חיידקים והורגים אותם...

מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (Neutrophil extracellular traps או nets) הן מנגנון שזוהה לאחרונה לפינוי פתוגנים בתיווך נויטרופילים, וזאת באמצעות שחרור שילוב של חלבונים ציטופלזמיים וחלבוני גרנולות; בנוסף, נויטרופילים יוצרים סיבים חוץ-תאיים של כרומטין הלוכדים פתוגנים. בסרטון זה, גרנולוציטים מבודלים מדם אנושי מלא באמצעות סנטריפוגציית מדרג צפיפות היסטופתית (histopath density gradient centrifugation). נויטרופילים מבודלים מהכנת הגרנולוציטים באמצעות מדרג Percoll.צנטריפוגה להסמכה על זכוכית כיסוי וגירוי להיווצרות רשתות באמצעות גירויים כימיים או ביולוגיים; לאחר מכן התאים מעובדים לצורך סימון אימונולוגי או EM לוויזואליזציה של הרשתות. שלום, אני כריסטיאן גוסמן ממתקן ליבת המיקרוסקופיה במכון מקס פלאנק לביולוגיה של זיהומים. היום נראה לכם פרוצדורה לניקוי גרנולוציטים נויטרופיליים מדם אנושי וגירויים שלהם כדי לייצר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs).לאחר מכן נדמיין את רשתות ה-NETs באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את המנגנונים המובילים להיווצרות רשתות וכדי לנתח את התכונות האנטי-מיקרוביאליות שלהן. אז בואו נתחיל.התחילו את הפרוטוקול במכסה זרימה למינרית (lamina flow hood) על ידי הכנת שש מיליליטר של histo 1119 בכל אחת מארבעה צינורות פלקון (Falcon tubes) של 15 מיליליטר. העבירו בזהירות שכבה של חמישה עד שבעה מיליליטר של דם מלא מעל ה-histo בכל צינור. סובבו את צינורות הצנטריפוגה במשך 20 דקות במהירות של כ-800 ×g, והבטיחו כי בלימה (brake) כבויה עם סיום הסבוב. הוציאו בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה.המבחנה תכיל ארבעה שכבות נפרדות בבירור מלמעלה למטה. אלו הן שכבה אדומה כהה המכילה erythrocytes, שכבה אדומה בהירה המכילה neutrophil granulocytes עם מספר erythrocytes, שכבה לבנה-צהבהבה המכילה leukocytes וסרום, ושכבה צהובה שקופה של סרום.שוב, עובדים תחת מכן זרימה למינרית. השתמשו בפיפט (perpet) המחובר למערכת ואקום כדי לשאוב בזהירות את השכבה הצהובה העליונה. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט את הפאזה האדמדמה המכילה גרנולוציטים מכל מבחנה למבחנת פלקון חדשה.בשלב הבא, מלאו את המבחנות ב-PBS כדי לשטוף את הגרנולוציטים. לאחר מכן, השקיעו אותם על ידי סבב צנטריפוגה למשך 10 דקות בערך ב-300 ×g בזמן סיבוב התאים. הכינו תמיסת per coll בריכוז 100% על ידי ערבוב של 18 מיליליטר של per co עם שני מיליליטר של 10 vezes PBS.לאחר מכן, השתמש בתמיסת coll בריכוז 100% וב-PBS בריכוז פי 1 כדי להכין ארבעה מיליליטרים מכל אחת מהתמיסות הבאות: 65%, 70%, 75%, 80% ו-85% per call. השתמש בתמיסות אלו להכנת מדרגי per core על ידי שכבה זהירה של שני מיליליטרים מכל תמיסה לתוך כל אחד משני מבחנות. התחל בהוספת שני מיליליטרים של תמיסת ה-85% לכל מבחנה.לאחר מכן, מעל ה-85%per coll, הוסיפו בזהירות כשכבה שני מיליליטר של ה-80%per co. המשיכו להוסיף שני מיליליטר מכל תמיסה בסדר יורד, כך שה-65%solution תהיה השכבה העליונה. הסירו את הלוקוציטים שהשקיעו מהצנטריפוגה תחת מנדף כימיים.שפכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש ב-1 mL של PBS. לאחר מכן, העבירו את התאים התלוים למבחנה חדשה. העבירו בזהירות שתי שכבות של 2 mL של הגרנולוציטים התלוים על כל אחד ממדרגי ה-percoll.לאחר מכן, סבב במ centri-fuge למשך 20 דקות בכ-800 ×g, וודא שהבלימה הכבדה (break) כבויה לאחר הסבב. הממשקים צריכים להיות גלויים בבירור בשל צפיפות התאים הגבוהה ביותר. השלף את השכבה העליונה ואת רוב שכבת ה-65%, המכילות תאי דם פריפריים חד-גרעיים (p BMCs).אספו את הממשק של 65%70% יחד עם הממשקים של 70%75% ו-80%85% מכל מדרג ריכוזים והעבירו אותם לפראלקונים (falcon tubes) חדשים ונקיים. שטפו את התאים על ידי מילוי המבחנה ב-PBS וסבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של כ-300 ×g כדי לשקיע את התאים לאחר הסבב. הסירו את העילאי וסספנדו מחדש את המשקע של הלוקוציטים הגרעוניים והגרעיניים או ה-PMNs בשני מיליליטר של PBS.בשלב זה, 95% או יותר מהתאים בתמיסה יהיו mns. השתמשו במגש ספירה של תאי דם (hemocytometer) כדי לקבוע את מספר התאים, ולאחר מכן העבירו 200,000 תאים ב-500 µL של RPMI אל כיסויות זכוכית עגולות סטריליות המונחות בלוחיות תרבית עם בארות בגודל 15 mm. הדגרירו למשך שעה אחת באינקובטור עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לתאים להיקשר לכיסויות הזכוכית; לאחר שעה אחת.הוסיפו 100 µL של RPMI המכיל את המעורר הרצוי. עבור ניסוי של סדרת זמנים, הוסיפו את המעורר באופן רצופי, החל מזמן הגירוי הארוך ביותר עבור כל נקודת זמן מותנית. הקפידו להכין בקרת חיובית על ידי הוספה של 600 nM של PMA ב-RPMI.בנוסף, עבור כל תנאי או נקודת זמן, הכין ביקורת שלילית על ידי הוספת RPMI בלבד. הדגר למשך עד ארבע שעות באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס; במהלך הגירוי, ניתן לנטר את היווצרות הרשתות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר. זמן קצר לאחר הגירוי, הגרעינים שינו את צורתם באופן דרמטי. הם מאבדים את הלווחיות שלהם, מעגלים, ואז מתרחבים. בנקודת הזמן הרצויה, הוסף 600 µL של תמיסת 8% פאראפורמאלדהיד בטמפרטורת החדר לכל באר.כדי להביא את הריכוז הסופי ל-4%, דגרו למשך שעתיים עד ארבע שעות לצורך סימון אימונולוגי. הניחו גיליון פראפורם על גבי מעמד למבחנות בעל 24 חורים (שלוש כפול שמונה) בקוטר של כ-15 מילימטר. כדי ליצור בארות, מלאו את הבארות ב-PBS.השתמשו במחט מעוקלת כדי להרים כל אחת ממכסי הזזית (cover slips) מהפראלדהיד שבצלחת התרבית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, אחזו במכס הזזית והפכו אותו אל תוך טיפה של PBS על גבי הפאראפורם. בשלב זה, מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (neutrophil extracellular traps) הן שבירות מאוד ויש לנהוג בזהירות רבה במהלך המניפולציה כדי למנוע אובדן תאים.לאחר חמש דקות, חזרו על השטיפה על ידי העברת ליתרת כיסויי הזכוכית לטיפות חדשות של PBS. חזרו על הפעולה עד לשלושה שטיפות בסך הכל. לאחר מכן, העבירו את כיסויי הזכוכית לטיפה של 0.5% Triton X 100 בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי להגדיל את חדירות התאים.לאחר מכן, שטפו שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה אחת בכל פעם בעקבות השטיפה. המשיכו בצביעה בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף. בצעו כל אחד משלבי האינקובציה והשטיפה על ידי היפוך זכוכית הכיסוי על הפרפורם.לאחר שצבעו את התאים, הניחו טיפה של 20 µL של MO על סרטית זכוכית והניחו את כיסויי הזכוכית (cover slips) כאשר הפנים הפונה לתאים כלפי מטה, כך שהתאים יהיו בין כיסוי הזכוכית לסרטית. לאחר שעה, ה-MOY אמור להתמצק והתאים יהיו מוכנים לניתוח מיקרוסקופי. בשימוש בעדשות טבילה, הכינו את התאים למיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת תחת מנדף כימי.בצעו קיבוע משני לתאים שעל לוחות הכיסוי מזכוכית בתוך פלטת 24 בארות באמצעות 2.5% glutaraldehyde ב-PBS למשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הניחו גילי פאראפורם על פיית מבחנה בעלת שלושה טורים של שמונה חורים בקוטר של כ-15 מילימטרים.ליצירת בארות. מלאו את הבארות במים מזוקקים. השתמשו במחט מעוקלת כדי להרים כל אחת מזכוכית הכיסוי מתוך תמיסת הגלוטראלדהיד.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, תפסו את כיסוי הזריקה והעבירו אותו לטיפה של מים מזוקקים על שטיפת ה-paraform, על ידי העברת כיסיי הזריקה לטיפות של מים מזוקקים על Paraform. חזרו על הפעולה עבור סה"כ שלושה שטיפות, חמישה דקות לכל העברה. העבירו את כיסיי הזריקה בחזרה לבארים של פלטת תרבית התאים המכילה 0.5% osmium tetroxide במים מזוקקים והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את כיסיי הזריקה מהפלטה ושטפו שלוש פעמים במים מזוקקים כפי שנעשה קודם לכן.לאחר מכן, החזיר אותם לפלטת 24 הבארות עם 0.5 milliliters של 1% tannic acid בכל בארה והדגר למשך 30 דקות. בשלב הבא, שטוף את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, חזור על הקיבוע עם osmium tetroxide ועל השטיפה.לאחר מכן, כסו את מבחנת הבדיקה בעזרת פיסת פאראפילם (Parafilm) חדשה. בצעו דהידרציה לתאים באמצעות סדרה של דגירה בתמיסות האתנול הבאות, למשך חמש דקות בכל אחת מהן: 30, 50, 70, 80, 90, 100.ולסיום, פעם אחת נוספת ב-100% ethanol. טבול את הראק בתוך סירת דגימות מלאה ב-ethanol. העבר במהירות את כיסויי הזריקה אל תוך הראק המתכתי, תוך כדי וידוא שהדגימות לא יתייבשו.לאחר מכן, העבירו את סירת הדגימה למייבש נקודה קריטית מקורר או CPD. מלאו את תא ה-CPD ב-CO2 נוזלי. השאירו את שסתום הכניסה פתוח לרווחה כדי לשמור על מפלס הנוזל, וברגע שמופיעה פאזה של אתנול תחת פאזת ה-CO2 בתחתית התא, פתחו את שסתום הניקוז בתחתית.כדי להסיר את מרבית האתנול. אפשרו לתא להישטף במשך כ-30 דקות. לאחר השטיפה, סגרו את שסתום הכניסה והורידו את מפלס הנוזל לסמוך מתחת לחלקו העליון של הסירה.העבירו מים חמים דרך המעטפת של ה-CPD. כאשר הטמפרטורה תגיע ל-36 עד 38 °C והלחץ יעלה ל-1,200 pounds per square inch, קו הגבול בין הנוזל לגז ייעלם והדגימות יהיו מעל הנקודה הקריטית. לאחר ההגעה לנקודה הקריטית, פתחו את הגז באיטיות לאורך תקופה של חמש דקות.כדי למנוע עיבוי, יש לשמור על טמפרטורה של כ-40 °C. במהלך זמן זה, פתח את הדלת והוצא את סירת הדגימה. ודא שהממס המייבש התאדה.הדביקו את לבי coverslips עם הצד העליון כלפי מעלה לדבק שעל מחזיק הדגימות מאלומיניום והעבירו אותם למערכת הציפוי ברזולוציה גבוהה. בצעו ריקום של צילינדר הציפוי עד ללחץ של 2×10⁻⁵ millibars. לאחר מכן, הגדירו את המכשיר ל-1.8 kilovolts ו-70 milliamps, ועקבו אחר עובי שכבת הפלטינום קרבון באמצעות גביש קוורץ למדידת עובי עד שהשכבה תגיע ל-5 nanometers.שחררו את האוויר מצילינדר הציפוי של מערכת הציפוי ברזולוציה גבוהה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הוציאו את הדגימות מהמצפה. החזירו את תא ה-SEM ללחץ רגיל.פתח את הדלת. לאחר מכן, הכנס את הדגימות למחזיק הדגימות ורוקן את התא. לצורך אנליזה ב-SEM.בעת קיבוע בנקודות זמן שונות לאחר הגירוי, ניתן להבחין בשינויים מורפולוגיים במהלך NETosis באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה. באיור זה, ה-DNA מוצג בכחול, קומפלקס histon-DNA מוצג באדום ו-neutrophil elastase.סמן גרנולות מוצג בירוק במהלך השלב הראשון של NETosis, רק בפריפריה הגרעינית של גרעינים מעובים. מאוחר יותר, כאשר הכרומטין דה-קונדנסיבי (פתוח) יותר, רוב הגרעין נצבע ברשתות הדה-קונדנסיביות. הצביעה היא הומוגנית.לוח תמונות זה מפרט את החפיפה של צביעה גרעינית וגרנולרית המתרחשת במהלך NETosis. מיקרוגרף זה, שצולם במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מציג נויטרופילים שאינם מעוררים; לאחר גירוי באמצעות חיידק Ella, הנויטרופילים נשטחים ומייצרים מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs). כאן ניתן לראות חיידק ג'ל שנלכד ברשתות.חיידקים כגון ג'ל ממויצבים ומוהרגים על ידי האנזימים הנמצאים ברשתות. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבודד גרנולוציטים נויטרופיליים מדם אנושי ולגרות אותם על מנת להשרות יצירת רשתות חוץ-תאיות של נויטרופילים. אלו ניתנות לניתוח נוסף באמצעות אימונופלורסצנציה או מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הרשתות שבריריות מאוד גם לאחר הקיבוע. כדי למזער את אובדן הרשתות, אנו מוציאים את לביבות הזכוכית עם הנויטרופילים המגורים מחללי הבארים ומבצעים את מרבית הפרוצדורה על פני טיפות של תמיסת בופר. גם במצב זה, חשוב להעביר את הדגימות בעדינות ובאיטיות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הצביעה הפלואורסצנטית של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), רכיבי הדנ"א החוץ-תאיים הנפלטים על ידי נויטרופילים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציה דבק בין תאים סרטניים ו- NETs.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לצפייה באינטראקציה דבקית בין תאים סרטניים לבין NETs

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

למדו לבודד נויטרופילים מדם אנושי ולהפעילם ליצירת מלכודות תאיות חוץ-תאיות (NETs) באמצעות גירויים כימיים או ביולוגיים. השיטה כוללת הדמיה במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ואלקטרונים לניתוח מבנה ותפקוד המלכודות.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

גלה סרטונים נוספים