הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

כדי לדמות את ההתנהגות של תאים בודדים בפלזמה in vivo, DNA המכיל מקדם ספציפי לתא, מניע ביטוי של פלורה ארבע או חיישן ביולוגי מוזרק לעוברי דג הזברה. שינויים דינמיים בהשפעה בחלוקה מוצגים in vivo באמצעות חיישן ביולוגי המבוסס על אפקט F ותחום הקישור של אוטרופין. עוברים שזה עתה הופרו מסודרים לאורך מגלשת ההזרקה וממוקמים בפינה שנוצרה בין המגלשה העליונה והתחתונה.

DNA המקודד ארבע פלואורו או חיישנים ביולוגיים מוזרק לתא. למחרת. העוברים מותקנים ב-aros.

בשקופית ההדמיה, העוברים ממוקמים עם התאים המסומנים כלפי מטה והתא אטום עם פתק כיסוי. היי, אני אריקה אנדרסון מהמעבדה של מרי האלין ומהמחלקות לזואולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת ויסקונסין מדיסון. אני נאם טאורי, גם הוא ממעבדת האלין.

ואני מאט קליי ממעבדת האלין. היום נראה לך הליך להדמיה חיה של תאים המסומנים בנפרד בעוברי דג הזברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את תנועתיות התאים ודינמיקת האקטין במהלך צמיחת אקסונים ונדידת תאי פסגה עצבית.

אז בואו נתחיל. כדי להרכיב תחילה שקופיות הזרקה, הכינו אלסטומר סיליקון מגן גליל בהתאם להוראות היצרן. מערבבים 10 חלקים מבסיס האלסטומר עם חומר ריפוי חלק אחד.

השתמש במגן הגליל כדי לחבר שלוש שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטיות יחד. מסדרים שתי שקופיות זו לצד זו בקצוות הארוכים. החל ARD על השקופית השלישית והנח אותה על גבי שתי השקופיות האחרות.

השתמש בכמות מספקת של סיגר כדי לאטום את המגלשות מבלי לזלוג עודף מבין המגלשות. ניתן להסיר כל עודף למחרת בעזרת סכין גילוח. תן למגן ה-SIL להתייצב למשך הלילה עבור שקופיות הדמיה.

אנו משתמשים במלבנים מנירוסטה שנחתכו באותו גודל כמו מיקרוסקופ זכוכית רגיל שקופית עם חור של 1.5 סנטימטר שנחתך במרכז. פתק כיסוי בגודל 22 מילימטר מרובע מודבק למלבן הפלדה עם מגן סיל. גם שקופיות ההזרקה וגם שקופיות ההדמיה ניתנות לשימוש חוזר וניתן לנקות אותן בין שימושים עם אתנול 70%, ולאחר מכן שטיפה במים לפני הזרקת עוברים.

לדלל את ה- DNA לריכוז סופי של 10 עד 50 מיקרוגרם למיליליטר. DNA ב-0.2% פניל אדום במים. הפניל האדום מאפשר הדמיה במהלך ההזרקה.

לאחר מכן, מלא וכייל את המחט. מילוי חוזר של מחט נימית אפול עם כמיקרוליטר של תמיסת DNA. המתן עד שהמחט תתמלא ולאחר מכן הכנס אותה למחזיק המחט של מכשיר ההזרקה באמצעות מלקחיים עדינים.

שברו את קצה המחט כך שפתח הקצה יהיה בקוטר של כ -10 מיקרומטר. מדוד את קוטר הטיפה בשמן מינרלי בעזרת מיקרומטר עיני. כדי לחשב את נפח ההזרקה, התאם את הגדרת משך הזמן של שפריצר הפיקו.

אז קוטר הטיפה הוא 0.12 מיקרומטר או בערך ננוליטר אחד בנפח. משך זמן של 10 עד 30 אלפיות השנייה הוא אופייני. אסוף עוברים בשלב תא אחד במדיום E שלושה עוברים והעביר כ-30 עד 60 עוברים למגלשת ההזרקה.

מקם את העוברים לאורך קצה המגלשה העליונה והסר את רוב שלושת ה-E כך שהעוברים מוחזקים למגלשה על ידי מתח פנים בעזרת סיכת חיתוך כפופה. סובב את העוברים כך שהתא יהיה צמוד לדופן מגלשת ההזרקה. השתמש במניפולטור מיקרו כדי להנחות את המחט דרך קוריון העובר דרך החלמון ולתוך התא הבודד של העובר.

הזרקו 0.5 עד ננוליטר אחד של תמיסת DNA לתא. העבירו את העוברים המוזרקים לצלחות פטרי ב-E 3 והניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. במידת הצורך ניתן להאט את ההתפתחות על ידי דגירה של עוברים בטמפרטורה נמוכה יותר ביום שלאחר ההזרקה.

הכינו את העוברים להדמיה כשעה לפני שהעוברים מגיעים לגיל הרצוי להדמיה. הסר את ה-COR מהעוברים בעזרת מלקחיים עדינים. בדרך כלל אנו מתחילים לדמות עוברים בערך 14 עד 17 שעות לאחר ההפריה.

לאחר מכן בחר עוברים עם תאים מסומנים באמצעות מיקרוסקופ מנתח המצויד בפלואורסצנטיות, אנו משתמשים במטרת מט"ח בטווח Nikon A Z 100 בגלל השילוב של מרחק עבודה ארוך והגדלה גבוהה. הנח עובר לתוך צינור מיקרו פוגה עם כ -50 מיקרוליטר של V שלוש. הוסף ציר טריקה ואגרוס נקודת התכה נמוכה של 1% מותך כדי ליצור ריכוז סופי של 0.02% טריקה באמצעות פיפטת זכוכית בורג רחבה.

העבירו מיד את העובר באגרו טיפה להחלקת הכיסוי של שקופית ההדמיה לפני שה-aros מתקשה, מקמו את העובר כך שהאזור עם התאים המסומנים פונה כלפי מטה כנגד החלקת הכיסוי התחתונה. לאחר מכן, הרכיבו את תא ההדמיה. מצפים צד אחד של טבעת פלסטיק בשומן ואקום סיליקון ומדביקים אותו להדמיית המתכת.

החלק את הצד השני של הטבעת בשומן. מלאו את החדר ב-E שלוש המכילות 10 ערימות מילי-מולריות, ו-0.02% טריקה אטמה את החלק העליון של החדר על ידי קיבוע החלקת כיסוי בגודל 22 מילימטר מרובע למשטח המשומן העליון של הטבעת. העובר מוכן כעת להדמיה של ארבעה מימדים כפי שיוצג בסעיף הבא.

פרטי רכישת התמונה יהיו תלויים בפרטים הספציפיים של מערכת המיקרוסקופ שלך. כאן אנו מדגימים את תהליך הרכישה של זמן-lapse עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי Olympus FB 1000. ראה פרוטוקול JO קודם לרכישת זמן-lapse עם המערכת הקונפוקלית Zeiss LSM five 10

הנח את תא ההדמיה לתוך מחזיק השקופיות על במת המיקרוסקופ והתמקד בעובר באמצעות מטרה של 10 x או 20x. תחת אור מועבר, עבור לצמצם מספרי אובייקטיבי של פי 60 של 1.2 ומעלה, והתמקד בתא מסומן עם פלואורסצנציה אפי בתוכנת FV. לחץ על xy repeat כדי להתחיל בסריקת לייזר.

התאם את הגדרות הרכישה ובקרות רכישת התמונות כדי למטב את התמונה לרכישת סדרת Z. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של הזאק יחד עם גודל המדרגה. השתמש בסמל העומק בחלון בקרת רכישת התמונות והתחל ברכישה על ידי לחיצה על סמל XY, Z suite כדי לרכוש סדרת דולג זמן.

הגדר את מרווח הזמן ומספר נקודות הזמן תחת סריקת הזמן. בכותרת בחלון הגדרות הרכישה, לחץ על סמל הזמן בחלון בקרת רכישת התמונות והתחל ברכישה על ידי לחיצה על סמל חבילת XYZT. אנו מציגים כאן סרטים מייצגים ותמונות של תאים מסומנים בודדים.

כאשר נוירונים בודדים מסומנים, האקסונים שלהם אינם מוסתרים על ידי תאים מסומנים אחרים ולכן הרחבות ה-OD על האקסונים וחרוטי הגדילה נראות בבירור. סרטון זה מציג נוירון חושי המסומן בתג ממוקד ממברנה RFP. הוא משתרע על שני אקסונים בכיוונים מנוגדים שצומחים מחוץ לשדה הראייה.

אקסון שלישי משתרע באופן אורתוגונלי מגוף התא ויוצר ענפים. באופן דומה, תיוג של תאי פסגה עצבית בודדים מאפשר הדמיה של תהליכים תאיים עדינים הקשורים לתנועתיות התאים. כאן שני תאי פסגה עצבית מסומנים עם GFP ממוקד ממברנה.

הם מפגינים פעילות בולטת נרחבת תוך כדי נדידה לכיוון קדמי. לעתים קרובות שימושי לתייג תאים בודדים בתוך קו טרנסגני כדי לדמיין אינטראקציות בין תאים שכנים בתוך אוכלוסייה. תמונה זו מציגה עובר עם ביטוי יציב של GFP בכל הנוירונים החושיים שהוזרק עם תג קידוד DNA RFP כדי לסמן נוירון אחד באדום ברקע של הזרקת נוירונים ירוקים של קידוד DNA.

בדיקת החיישן הביולוגי של אקטין מראה השפעה חזקה יותר באות בקונוסים של גדילה ובליטות דינמיות לאורך אקסונים חדשים שנוצרו בהשוואה לגוף התא. בשלב מאוחר יותר האות נשאר חזק בקונוסים של גדילה בעוד שלאקסונים בוגרים יש אות חלש משמעותית. זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע הדמיה חיה של נוירונים ותאי פסגה עצביים המסומנים בנפרד בעוברי דג הזברה.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבחור עוברים שבהם ה-DNA אינו מתבטא ברמות גבוהות מספיק כדי לגרום לרעילות או למוות של תאים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.