רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

בהליך זה, הדינמיקה של ביטוי גנים ברקמות הצמח מצולמת לאורך זמן באמצעות רובוטיקה, תחילה זרעי שעועית לימה מעוקרים ומונחים בין מגבות נייר לחות במיכל תרבית רקמות לנביטה. לאחר ארבעה ימים, הקואן מוסר ומופגז במבנה DNA המכיל מקדם התמזג ל-GFP קואן המונח בצלחות פטרי מורכב על מערכת איסוף תמונות רובוטיקה דו-ממדית בהתאמה אישית. הרובוט מתוכנת לצלם תמונות של כל פיסת רקמה כל שעה במשך 100 שעות.

התמונות נתונות לניתוח תמונה, נתונים כמותיים על עוצמת ביטוי ה-GFP לאורך זמן. היי, אני ג'ון פיינר, מנהל המעבדה לשינוי צמחים במחלקה לגננות ומדעי היבול באוניברסיטת אוהיו. אני קרלוס הרנדז גרסיה, דוקטורנט במעבדת הגמר באוניברסיטת אוהיו.

היום קרלוס יראה לכם את הפרוטוקול שפיתחנו לניתוח ביטוי גנים ורקמות צמחים באמצעות החלבון הפלואורסצנטי הירוק. אנו משתמשים בהליך זה שפיתחנו במעבדה למדידת המתח של פעילות OD. כדי לעשות זאת מקדם את הכתר הראשון שלנו במעלה הזרם של גן GFP, שהוא הגנים המדווחים שלנו.

אני אראה לך כיצד אנו מכניסים את בקרת המקדם לווריד לימה Cataly ושולחים אפליקציה במערכת לכידת התמונות הרובוטית בעיצוב מותאם אישית שלנו. אסיים במעבר על הפרוטוקול שלנו לניתוח תמונה. אז בואו נלך כדי להתחיל בהליך זה זרעי שעועית לימה מעוקרים באמצעות נהלים סטנדרטיים.

מניחים את הזרעים המעוקרים במג'נטה GA שבעה מיכלים בין שכבות של מגבות לחות ונייר ודוגרים אותם במשך ארבעה ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס. כאן אנו משתמשים בווקטור ביטוי מספר עותק גבוה, שימושי לניתוחי אלמנטים של מקדם ומקדם. וקטור זה מכיל את הגן GFP, המשמש להמחשת תפקוד המקדם או אלמנט המקדם ברקמות שעברו טרנספורמציה כשעה עד שעתיים לפני ההפצצה.

בלו שעועית לימה CU עופרת ממעילי זרעים. CU leadin המתאים להפצצה צריך להיות צהוב עד ירוק בהיר, שטוח וללא כל נזק שעלול להפריע לניתוח תמונה נוסף מיד לאחר הכריתה, הנחת 12 cu leadin בצלחת פטרי עם מדיום תרבית OMS המכיל מלחי טרשת נפוצה B, חמישה ויטמינים, 3% סוכרוז ו-0.2% שיעור ג'ל ב-pH 5.7. לאחר מכן, זרז את מבנה ה-DNA על חלקיקי טונגסטן M 10 ראשית, ממש לפני השימוש השעו את החלקיקים במים סטריליים לריכוז של 100 מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן, בצינור פוגה של 0.6 מיליליטר, הוסיפו 25 מיקרוליטר חלקיקים, חמישה מיקרוליטר DNA במיקרוגרם אחד למיקרוליטר, 25 מיקרוליטר של 2.5 סידן כלורי מולארי ו -10 מיקרוליטר של 100 מילי-מולארי זרע. דגרו את תכשיר ה-DNA על קרח למשך חמש דקות, ואז הסירו והשליכו 50 מיקרוליטר מהתמיסה על גבי החלקיקים. השעו מחדש את החלקיקים המצופים ב-DNA שנשארים בתחתית הצינור על ידי מערבולת.

ומיד לאחר המערבולת, הסר Eloqua של שני מיקרוליטר. חזור על שלב מערבולת זה. בכל פעם שמסירים Eloqua, יש לשמור את החלקיקים המצופים על קרח ולהשתמש בהם תוך 15 דקות.

כעת, כשהדנ"א מצופה על החלקיקים, הניחו שני מיקרוליטרים של חלקיקים דרך החלק העליון של מסנן מזרק באמצע מסך מסנן. לאחר מכן הנח את מסנן המזרק ביחידת החזקת המסנן בתוך אקדח זרימת החלקיקים או תא ה-PIG. מניחים שעועית לימה עופרת בצד צירי כלפי מעלה על מבלבל המורכב ממסך מומס לתחתית.

הנח את המבלבל, המשמש כפלטפורמה לתמיכה ברקמות במהלך הפצצה בתא אקדח החלקיקים. כדי להפציץ את הרקמה, פתח תחילה את השסתום המוביל לוואקום כדי לפנות את החדר. כאשר הוואקום מגיע ל -760 מילימטרים של כספית, הפעל את הסולנואיד ושחרר את ההליום כדי להניע את החלקיקים.

לחץ ההליום המשמש להאצת חלקיקים הוא 50 עד 60 PSI. לאחר הפצצת החלקיקים, סגור את שסתום קו הוואקום ושחרר את הוואקום באמצעות שסתום הפליטה. כאשר הוואקום משתחרר, פתח את דלת החדר כדי להחזיר את ה-co leadin המופגז ולהחזיר את ה-co leadin בצד דאל.

עד מדיום תרבית OMS לכימות ופרופיל ביטוי. הפציצו מינימום של שלושה עופרת משותפת לכל מבנה DNA. כלולה גם בקרה חיובית, הנותנת פרופיל ביטוי גנים שנחקר היטב.

המובילים השותפים מוכנים כעת להדמיה. הפעל את הכספית lamp והמתן 30 דקות עד שהמנורה תתחמם. הפעל את מקורות הכוח עבור מצלמת SPOT R-T-C-C-D ובקר המנוע, המניע את התנועה של פלטפורמת הרובוטיקה המעוצבת בהתאמה אישית, המכילה שמונה לוחות.

הגדר את סט המסננים לגילוי GFP על ידי בחירת סט מסנני GFP שני בעירור של 480 ננומטר ופליטה של 510 ננומטר במיקרוסקופ MZ L שלוש ניתוח. לאחר מכן, יש לעקר את מכסי צלחת הפטרי המעובים מפוליקרבונט על ידי ריסוס באתנול 70%. המכסים המיוחדים המשמשים לכיסוי בסיס צלחת הפטרי, מונעים עיבוי במהלך איסוף התמונות.

הנח את הלוחות המכילים קואן מופגז על פלטפורמת הרובוטיקה והדק את בורג הסט הרוחבי כדי להדק אותם במקומם. כעת פתח את יישום התוכנה המותאם אישית השולט הן בפלטפורמת הרובוטיקה והן ברכישת התמונות. פתח גם את מתג בקר האור הלבן של התוכנה באמצעות התוכנה, כוון את הפלטפורמה למצב הבית.

זה נעשה לפני כניסה לתפקידים. עבור כל עופרת בלשונית המנוע, בחר את הצלחת הראשונה. הפלטפורמה תמקם את מרכז צלחת הפטרי תחת מטרת המיקרוסקופ.

באמצעות לחצני מרחק התנועה מקם במדויק את ה-CU LEADIN הראשון לאיסוף תמונות. באמצעות תכונת מצב החי, הזז את עופרת החיבוק לאזור המתאים viewאזור עבור עופרת החיבוק הראשונה, השתמש בכפתורים הידניים במיקרוסקופ החיתוך כדי להגדיר את המיקוד ולהגדיר את ההגדלה ל-1.6 x. לאחר הגדרת אזור העניין, לחץ על כפתור הוסף עמדה זו.

התוכנה תוסיף את הקואורדינטות של אזור זה לקובץ לוח זמנים של מיקום והפלטפורמה תחזור למרכז מיקומי הגדרת הלוחות עבור כל הקואנים הנותרים על הלוחות. באמצעות לחצני מרחק הנעים, השתמש בשלושת ברגי הרמה הידניים הממוקמים מתחת לכל צלחת בפלטפורמת הרובוטיקה כדי להתאים את המיקוד עבור הקואן הנותר באותה צלחת. לאחר הזנת כל הקואורדינטות של כל הקואן, שמור את קואורדינטות לוח הזמנים של המיקום.

הזן את פרמטרי איסוף התמונות כגון סוג האור, שהוא כחול עבור GFP והגדרת חשיפה, וכן ציין היכן לאחסן את התמונות כמתואר בפרוטוקול הכתוב הנלווה. עבור אל הכרטיסייה בקרת זמן לכידה והגדר את מרווח הזמן לרכישת התמונות ואת המספר הכולל של מחזורי איסוף התמונות. תמונות נאספות בדרך כלל כל שעה במשך 100 שעות.

יצירת פרופילי ביטוי גנים מוגדרים היטב. התחל ברכישת תמונה על ידי פתיחת לשונית לוח הזמנים של הפוזיציות ולאחר מכן לחיצה על כפתור לוח הזמנים להפעלה. בודד את מערכת איסוף התמונות מאור חיצוני בסוף 100 שעות איסוף התמונות.

התמונות ברזולוציה גבוהה של כחמישה מגה-בייט כל אחת מוכנות לניתוח תמונה. השתמש בתמונה מוכנה כדי להרכיב את 100 התמונות הרציפות מכל תיקייה. ייבא את כל התמונות הרציפות כמסגרות ושנה את גודלן ל-800 על 600 פיקסלים כדי להאיץ את עיבוד התמונה.

לאחר מכן, השתמשו בסימנים בשכבה חדשה שהוצגה, הגלויה בכל המסגרות והשתמשו בנקודות GFP שנבחרו בהפניה לתמונה. יישר כל תמונה באופן ידני לאחר השלמת היישור, מחק את השכבה המשמשת כהפניה ושמור את הקובץ כקובץ PSD יחיד. כמו כן, ייצא את כל המסגרות כקובץ MOV יחיד ברזולוציה הגבוהה ביותר.

הקבצים מוכנים כעת להתחיל בכימות GFP. השתמש בתמונה J כדי לפתוח את קובץ ה-MOV ולחתוך שטח של 400 על 300 פיקסלים. לאחר מכן הפרד את התמונות הרציפות לערוצים אדומים, כחולים וירוקים בעזרת הכלי פיצול RGB לערוצים אדומים וירוקים.

הפחיתו את הקרינה ברקע באמצעות החזר ה-ROI הנמדד עבור כל כלי תוסף פרוסה. חשב את ביטוי ה-GFP על ידי התאמת רמות הסף ושימוש בתוסף שנועד למדוד את הערך הממוצע של גווני אפור לפיקסל ואת המספר הכולל של פיקסלים המבטאים GFP. העתק ערכי פלט בתמונה J.לבסוף הדבק את ערכי הפלט עבור ערוצים ירוקים ואדומים ב- Microsoft Office.

Excel לטיפול נוסף בנתונים כדי לתת לך מושג לגבי התוצאות של יישור תמונה. אנימציה ראשונה זו מראה את חוסר הדיוק של המיקום מחדש של פלטפורמת הרובוטיקה במהלך הניסוי בן 100 השעות. תנועה נקודתית היא חפץ הנובע מחוסר היכולת של פלטפורמת הרובוטיקה לחזור לאותו מיקום בדיוק בכל נקודת זמן לאחר יישור תמונה ידני, ניתן לצפות בקלות בתאי הביטוי של GFP וניתן לדמיין בקלות את התכונות הייחודיות של מערכת מעקב זו.

כפי שהאנימציה הזו חוזרת על עצמה, התא המבטא GFP המוקף בעיגול, התא המוקף באדום מראה ירידה מהירה מאוד בביטוי 18 עד 20 שעות לאחר ההפצצה בעוד שהתא המוקף בלבן מראה התחלה מאוחרת של ביטוי GFP. מלבד האנימציות, הליך זה מאפשר כימות מהיר של ביטוי GFP לאורך זמן ברקמת המטרה של שעועית הלימה. תוצאות מייצגות אלו מראות את הכימות ההשוואתי של עוצמת המקדם באמצעות מקדם CAMV 35 S וארבעה מקדמי סויה שונים.

זה עתה הראינו לך כיצד להכניס DNA לקטלין של הנבטה. זרעי וריד לימה מניחים את הקטלין על הרובוט, אוספים תמונות לניתוח תמונה ומנתחים את התמונות הללו. אנו משתמשים בהליך זה באופן שגרתי במעבדה שלנו לאימות מקדמי צמחי שיבוט.

אפשר לייצר כמות גדולה של נתונים מהכנסת מקדם צמחים שונים. עם זאת, הליך זה מסובך עם שלבים רבים שיכולים להשתבש כאשר ביצוע הליך זה חשוב להתחיל עם זרעי שעועית קו טריים או לפחות להשתמש בזרעים באיכות גבוהה שאוחסנו כראוי. חשוב גם לחתוך את מכסה הבומברד ולהתקין אותו על הרובוט במהירות ולהשתמש במכסה הכלים העבה לחיות מחמד כדי למזער בעיות עיבוי.

ולבסוף, שימו לב שה-GFP שבו אנו משתמשים הוא גרסה אחרת הנקראת SGFP, חזית מעבדת HIN באוניברסיטת הרווארד. GFP זה אינו יציב במיוחד ועשוי להיות טוב יותר למעקב אחר שינויים מהירים בביטוי גנים. וזה מה שאנחנו צופים בנו.

ובהצלחה בניסויים שלך.