ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

קביעת תכולת הליגנין וההרכב של דפנות תאי הצמח מתחילה בחומר צמחי מיובש, הנתון למיצויים שונים. החומר המתקבל מורכב מדפנות תאים בלבד ולאחר מכן מפוצל כדי לקבוע את תכולת הליגנין. חומר הקיר נתון להידרוליזה על ידי אצטיל ברומיד והמונו-אלים המסיסים מכומתים על ידי ספקטרומטריית UV לקביעת הרכב הליגנין.

חומר הקיר עובר הידרוליזה על ידי ציטוליזה. רכיבי הליגנין המסיסים נגזרים לאחר מכן לנגזרות הטרימתיל המלח הנדיפות שלהם, אותן ניתן להפריד ולכמת באמצעות כרומטוגרפיה של גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. קביעת הרכב הפוליסכריד של המטריצה ותכולת התאית מודגמת בסרטון אחר שכותרתו ניתוח קומפוזיציה מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק שני פחמימות.

היי, אני מרקוס פאולי, ראש המתקן האנליטי של וול במרכז המחקר לביו-אנרגיה של האגמים הגדולים כאן באוניברסיטת מישיגן. אני קליף פוסטר מנהל מתקן דופן התא האנליטי. אנו נראה לך את הנוהל כיצד לקבוע את התוכן וההרכב של דגימות ביומסה צמחית.

צמחים ממירים אנרגיית אור מהשמש לאנרגיה כימית כמו ביומסה. ביומסה צמחית מורכבת בעיקר מדפנות תאים, רשת מורכבת של מגוון פולימרים העוטפים את כל תאי הצמח. כאן אנו קובעים את ההרכב של חומרי דופן תא הצמח כדי להעריך את הפוטנציאל להפיכת הליגנין Cellose X, שהם משאב מתחדש בשפע רב לדלקים ביולוגיים.

היום נתמקד בפוליפנול ליגנין בסרטון נוסף שכותרתו ניתוח קומפוזיציה מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק שני פחמימות. נתמקד בניתוח הפוליסכריד. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף שלושה כדורי נירוסטה בגודל 5.5 מילימטר לצינור מכסה בורג של שני מיליליטר וכ-60 עד 70 מיליגרם של אוויר או חומר צמחי מיובש בהקפאה.

ניתן לטחון את החומר לאבקה דקה באמצעות דופן העין, רובוט טחינה וחלוקה. דופן העין לוקחת את הצינור ומנערת אותו למשך 30 שניות, כאשר בשל כדורי המתכת, החומר נטחן לאבקה דקה, ואז אבקת הצמח הטחונה, אך הקומפקטית, משוחררת הליך חלופי שאינו רובוטי בתפוקה נמוכה. הקלה על רטרו מוצגת בחלק השני, הוסף 1.5 M של אתנול מימי 70% למערבולת חומר הקרקע ביסודיות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר.

טיפול זה מסיס את רוב החלבונים ואברוני התא, שואב את הסופרנטנט ומוסיף נפח אחד לאחד לנפח. תמיסת מתנול כלורופורם לאלכוהול הבלתי מסיס לנער היטב כדי לסובב את הגלולה והצנטריפוגה. הכלורופורם מתנול מחלץ את התרכובות ההידרופוביות כגון ליפידים לאחר צנטריפוגה, שואב את הסופרנטנט ומשעה מחדש את הגלולה ו-500 מיקרוליטר אצטון.

כדי לייבש את הדגימה לאדות את הממס בזרם אוויר בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס עד לייבוש, ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורת החדר עד לעיבוד נוסף. כדי ליזום את הסרת העמילן מהדגימה reus, השעו את הגלולה ו -1.5 מיל של pH נתרן אצטט מולארי 0.1 מכסים את הצינורות ומחממים אותם בגוש חימום כדי לג'לטין את העמילן. לאחר קירור התרחיף על קרח, מוסיפים את תערובת האנזים המשפיל את העמילן, מכסים את הצינור ומערבולת מדגרים היטב את התרחיף למשך הלילה.

בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שייקר סיבוב מבטיח ערבוב נכון. לאחר הדגירה של הלילה, יש להפסיק את העיכול על ידי חימום בבלוק חימום בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט, המכיל עמילן מסיס.

שטפו את הכדור הנותר שלוש פעמים באמצעות 1.5 מיל מים בכל פעם על ידי מערבולת, צנטריפוגה וניקוי כפי שהודגם קודם לכן. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר אצטון ואידו את הממס בזרם אוויר ב -35 מעלות צלזיוס עד לייבוש. הדגימות המיובשות המכילות דופן תא או רגל מבודדות, ללא תאית מוכנות לניתוח נוסף וניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר.

התחל בשקילה של 1 עד 1.5 מיליגרם של חומר דופן תא מוכן. ניתן לשקול את החומר ביד או באופן אוטומטי עם דופן העין כפי שמודגם בחלק השני. שוטפים את קירות הצינור עם 250 מיקרוליטר אצטון כדי לאסוף את חומר דופן התא בתחתית הצינור ולאדות את האצטון בעדינות רבה תחת זרימת האוויר.

לאחר שהאצטון התאדה בעדינות, הוסף 100 מיקרוליטר של נפח טרי של 25% לנפח אצטיל ברומיד בחומצה אצטית קרחונית לאורך שני הקירות. כדי למנוע התזה, ברומיד עדין מפרק את פולימר הליגנין למונוס האצטילציה שלו. לאחר מכן מכסים את הבקבוק הנפחי ומחממים על 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

מחממים שעה נוספת עם ארבע הודעות טקסט כל 15 דקות, ולבסוף מצננים על קרח בטמפרטורת החדר לאחר קירור הבקבוק מוסיפים 400 מיקרוליטר של שני נתרן הידרוקסיד מולארי ו -70 מיקרוליטר מערבולת הידרוקסיל לאמין הידרוכלוריד טרי שהוכנה, צלוחיות הנפח. לאחר מכן, נטרל את התמיסה על ידי מילוי הבקבוק הנפחי בדיוק עד לסימון שני מיליליטר במכסה חומצה אצטית קרחוני והפוך מספר פעמים כדי לערבב פיפטה 200 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה את המונו לאל ההידרוליזה והמסיס לתוך צלחת 96 באר ספציפית UV וקרא את הצלחת בקורא צלחות באר ב-280 ננומטר. קרא את הצלחת לפחות שלוש פעמים וצמצם את הספיגה מכיוון שחלקיקים יכולים לגרום לשינוי קל בערכי הספיגה.

קבע את האחוז של ליגנין מסיס ברומיד עדין או BSL באמצעות מקדם הצמח המתאים עם הנוסחה המוצגת בפרוטוקול הכתוב. ליגנין היא רשת פוליפנולים המורכבת בעיקר משלוש יחידות משנה, P hydroxy phenol, gua ACell ויחידות ספרינג רול במטרה לקבוע את הרכב הליגנין בחומר הצמחי. התחל בהעברת כשני מיליגרם של חומר דופן התא לתוך צינור זכוכית עם מכסה בורג לציטוליזה.

לאחר מכן, התכוננו להכין את תמיסת 2.5% בורון טרי פלואוריד אתיל אט, ותמיסת אתאן תיול 10% בדיוקסן. מכיוון שדיאוקסאן מסוכן מאוד, אל תוציא דגימות או ציוד ממכסה המנוע. זכרו לעבוד בזהירות רבה ולהשתמש בבלון מלא בגז חנקן כדי לעקור את הנפח האבוד בבקבוק הדיאוקסאן עם חנקן.

הכן את התמיסה על ידי ערבוב הנפחים הבאים לדגימה: 175 מיקרוליטר דיאוקסן, 20 מיקרוליטר ETSH, חמישה מיקרוליטר BF שלושה. לאחר הערבוב מוסיפים 200 מיקרוליטר מהתמיסה לכל דגימה. נקה את מרווח הבקבוקון עם גז חנקן ומכסה.

המשיכו מיד לחמם את הדגימות בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות עם ערבוב עדין בכל סוף שעה. תגובת ליזה של תיאו אייס על קרח במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של 0.4 נתרן ביקרבונט מולארי לנטרול ומערבולת.

לניקוי מוצרי פירוק הליגנין, הוסף מיל מים ו -0.5 מיל מערבולת אצטט ותן לשלבים להיפרד. שכבת אתיל אצטט תהיה למעלה ומים בתחתית. העבירו 150 מיקרוליטר משכבת אתל אצטט העליונה המכילה את רכיבי הליגנין לתוך צינור של שני מיל, וודאו שלא מועברים מים.

לאחר ההעברה משכבת אתל אצטט העליונה, מאדים את הממס באמצעות רכז עם אוויר. מוסיפים 200 מיקרוליטר אצטון ומתאדים. חזור על הטיפול באצטון פעמיים כדי להסיר עודפי מים.

לאחר מכן נגזר את רכיבי הליגנין לנגזרות הטרימתיל הנדיפות שלהם Cy Lane. הוסף לכל צינור 500 מיקרוליטר של אתיל אצטט, 20 מיקרוליטר פורין ו-100 מיקרוליטר של NO biss trimethyl cyl acetamide. דגירה במשך שעתיים בחום של 25 מעלות צלזיוס.

בתום השעתיים, העבירו 100 מיקרוליטר מהתגובה לבקבוקון GC MS והוסיפו 100 מיקרוליטר אצטון. נתח את הדגימות על ידי GC המצויד בספקטרומטר מסה מרובע או גלאי יינון להבה. לטור ופרטים על הריצה, אנא עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף.

להלן כמה תוצאות מייצגות של ניתוח הליגנין תוך שימוש בעץ צפצפה כחומר הצמחי. על פי ניתוח זה, 22% מחומר הצפצפה מורכב מהפוליפנול ליגנין. הרכב רכיבי הליגנין נותח על ידי GCMS.

שיאים מזוהים על ידי זמני שמירה יחסיים באמצעות תקן פנימי של טטרה קואן או על ידי סמלי ספקטרום מסה אופייניים של 2 99 MZ 2 69 MZ ו-2 39 MZ עבור המונומרים sg ו-h בהתאמה. הרכב רכיבי הליגנין מכומת על ידי הגדרת שטח השיא הכולל ל-100%הניתוח הקומפוזיציוני מראה שהדגימה הספציפית הזו מכילה בעיקר יחידות מחרוזת או S. עם זאת, יחידות גויה, אאול או G נמצאות גם הן בשפע.

ברור שהכמות והרכב היחידות המונו-ליאליות יכולים להשתנות בהתאם לרקמת הצמח ולמינים. זה עתה הראינו לך כיצד לקבוע את תכולת הליגנין וההרכב של חומר צמחי לניתוח פוליסכרידים. הפוך לחלק השני.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.