כריסטופר יוז: במודל חוץ גופית לחקר אנגיוגנזה (ראיון)
28 באפריל 2007
כריסטופר CW יוז מתארת את השירות של מערכת התרבות שלו ללימוד אנגיוגנזה במבחנה. הוא מסביר את החשיבות של fibroblasts כי להפריש ביקורתית, בלתי מזוהה עדיין, גורם מסיס המאפשרים לתאי האנדותל כדי ליצור כלי בתרבות כי הסניף, טופס לומן ראויה, לעבור anastamosis.
היי, שמי ד"ר כריסטופר יוז. אני פרופסור באוניברסיטת קליפורניה באירווין, והמעבדה שלי עובדת על אנגיוגנזה. ואנחנו מתעניינים במיוחד בגנים המווסתים את תהליך האנגיוגנזה.
ביצענו אופטימיזציה של מבחני מבחנה המבוססים על עבודתו של נלסון, ובבדיקה זו אנו יכולים להסתכל על כל התהליכים השונים המתרחשים במהלך אנגיוגנזה, אנו מצפים חרוזי טדקס, חרוזים קטנים בתאי אנדותל. לאחר מכן אנו מטמיעים אותם בג'ל פיברין. אנו מספקים גורמי צמיחה.
ובמהלך מספר ימים, תאי האנדותל נובטים מהחרוזים. הם נודדים, הם מתיישרים זה עם זה, הם מתרבים, הם מייצרים צינורות, הם מסתעפים והם יוצרים אנסטומוזיס. כך שבערך ב-10 ימים יש לנו נימים שלמים כמו רשת בתרבות.
ובכן, חלק מהבעיות עם בדיקות envivo ואנגיוגנזה, למשל, אלה שנעשות בעכברים הן שזה הרבה, זה לא מאוד קל לתמרן את המערכת. קשה לדמיין שכאשר זה קורה בתוך חיה, אתה, אתה לא באמת יכול לראות אנגיוגנזה מתרחשת. ואם אתה רוצה לתמרן את המערכת בתרביות המבחנה שלנו, קל מאוד לתמרן גנטית את תאי האנדותל, להפעיל ולכבות אותם, ולהסתכל על ההשפעות של זה על אנגיוגנזה של הנבטה.
והרבה יותר קשה לעשות את זה בכל החיה. אתה צריך לעשות נוקאאוט או נוקאין. אז אלה שני היתרונות העיקריים.
זה, קל לתמרן את זה וקל לדמיין את זה. אז במהלך השנים, פותחו מספר מבחני אגנזה שונים במבחנה ולכולם, לכולם יש את היתרונות והחסרונות שלהם. ובמיוחד ידוע הוא מבחן ג'ל מטריצה, שבו תאי אנדותל ממוקמים על גבי המטריצה החוץ-תאית הזו הנקראת מטריג'ל.
והבעיה שם היא שתאי האנדותל יוצרים מבנים דמויי חוט, אבל הם אף פעם לא באמת מייצרים כלי אלומיניום ראויים. אתה לא רואה נביטה, אתה לא רואה אנסטומוזיס. ישנם דגמי ג'ל קולגן, שיכולים להיות טובים.
יש הרבה כאלה: אתה לא רואה התפשטות של תאי האנדותל. אתה לא נוטה לראות אנסטומוזיס. בדיקת ג'ל הפיברין שפיתחנו מבוססת על מודל של נלסון קאר שפורסם באמצע שנות התשעים.
ועכשיו שיפרנו את זה באופן דרמטי כך שנוכל לראות את כל שלבי האנגיוגנזה. אנחנו יכולים לראות את הנביטה הראשונית, את הנדידה. אנו רואים התפשטות של תאים, אנו רואים היווצרות לומן, אנו מקבלים הסתעפות, ולבסוף אנו מקבלים אנסטומוזה ליצירת רשת כלי דם שלמה במבחנה.
אז הבדיקה הזו היא באמת, אנו מאמינים שהמערכת הטובה ביותר במבחנה אם אתה רוצה להסתכל על כל השלבים השונים של אנגיוגנזה. יתרון נוסף שיש לנו עם מבחן מבחנה זה הוא שאנחנו יכולים לבצע לכידת לייזר, מיקרו דיסקציה, אנחנו יכולים לסובב את התרבית כך שהיא תהיה שטוחה מאוד, ואז להשתמש במיקרוסקופ מיקרו דיסקציה ללכידת לייזר. אנו יכולים למעשה להוציא תאים בודדים ובמיוחד אנו מתעניינים בתאי הקצה.
אז אנחנו חותכים אותם ואנחנו יכולים להסתכל על ביטוי גנים, במיוחד בתאי הקצה לעומת תאי הגזע, התאים שלמעשה מייצרים את הלומן. וההשערה שלנו היא שיהיה ביטוי גנים דיפרנציאלי בין שתי אוכלוסיות התאים הללו. אנחנו יכולים להסתכל על זה, זה יהיה כמעט בלתי אפשרי לעשות את זה במערכת in vivo.
אז אנחנו חושבים שזה עוד יתרון משמעותי בשימוש בזה בבדיקה חוץ גופית. בעבודה המוקדמת שנעשתה בזה, כפי שציינתי נלסון רקון, הם השתמשו בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים. ויש הרבה מחשבה שתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, התאים שהייתם רוצים להשתמש בהם לבדיקה כזו, מכיוון ש-in vivo, ה-EC המיקרו-וסקולרי הוא זה שבאמת יוצר כלי דם חדשים.
החלטנו לנסות ולעשות את זה עם ve. מדובר בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי מכמה סיבות. אחד מהם הוא שקל מאוד להשיג את התאים האלה.
אתה יכול ללכת לבית החולים, אתה יכול לקבל חבל טבור מחדרי הלידה, ואתה יכול לבודד את התאים בקלות רבה. וגם תאים אלה שימשו בתרבית במשך שנים רבות. הם מאופיינים היטב.
אז הקמנו את הבדיקה הזו וביצענו אופטימיזציה כדי שנוכל להשתמש בתאים האלה לסיבות האלה. ומעניין שמתברר שתאי האנדותל הגדולים הללו לובשים צורה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ותרבות. הם מאבדים הרבה גנים שבדרך כלל מתבטאים על ידי ec של כלי דם גדולים והם מתחילים לבטא גנים שבדרך כלל קשורים לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים.
והם מסוגלים באופן מושלם ליצור נימים כמו נבטים של יצירת לומן ולגרום למה שכל העולם נראה כמו נימים אמיתיים בתרבות. אז הם קלים לשימוש, קלים לשימוש, והם עושים את מה שאנחנו רוצים שהם יעשו. הם נובטים והם מייצרים כלי אלומיניום מתאימים.
כאשר אנו רוצים לכמת את הבדיקה הזו, יש באמת כמה דרכים שבהן אנו יכולים ללכת. אנחנו יכולים להסתכל על קריטריונים כמותיים באמת כמו מספר הנבטים, אורך הנבטים, קוטר הנבטים, מספר נקודות הענפים, מספר האנסטומוזיס, אבל אנחנו מסתכלים גם על קריטריונים איכותיים. וכך נוכל להסתכל האם הם יוצרים לומן?
וזה כנראה מה שהכי מעניין אותנו. בהרבה מהבדיקות שאנו עושים היא היווצרות הלומן הנכונה שלהם. וזו באמת יותר הערכה איכותית, אם כי ככל שהכלים גדלים, אפשר למעשה למדוד גם את הקוטר של הלומן הזה.
אז אנחנו משתמשים בפיברובלסטים בתרבויות האלה. אנו מטמיעים את החרוזים בג'ל הפיברין ואנו מצלחים פיברובלסטים על גבי הג'ל. הפיברובלסטים חיוניים לחלוטין להנבטה נכונה ולהיווצרות לומן.
בהיעדר פיברובלסטים, אנו מקבלים קצת נביטה. עם זאת, תאי האנדותל נוטים לא להישאר מחוברים זה לזה. מה שקורה הוא שהם, הם נודדים זה מזה.
ולכן כל מבנה שאתה מפתח על הנבט הזה נוטה להתפרק. ואחרי מספר ימים, תאי האנדותל עוברים אפופטוזיס. אז נראה שפיברובלסטים מייצרים גורמים חיוניים לאנגיוגנזה, לפחות במערכת החוץ גופית הזו.
והיינו מאוד מעוניינים לדעת מהם הגורמים האלה. מה שמצאנו הוא שהפיברובלסטים מפרישים משהו לתוך המדיום, כך שנוכל לקחת מדיום מצב מהפיברובלסטים וזה יתמוך בהנבטה תקינה ובהיווצרות לומן. אז אנחנו בהחלט מתמודדים עם גורם מסיס.
אז ברור שאנחנו מאוד מעוניינים לדעת מה הפיברובלסטים מייצרים שחשוב כל כך לאנגיוגנזה במערכת הזו. ניסינו את כל החשודים הרגילים, VEGF, fg F בסיסי הם, נמצאים בתרבות, הוספת יותר אינה תחליף לפיברובלסטים. ניסינו גם אנגיופויטין אחד, TGF בטא, H, GF וכו', וכן הלאה.
עד כה לא מצאנו את הגורם החיוני. אז מה שאנחנו עושים עכשיו זה לטהר גורמים ממדיום המצב מפיברובלסטים. אז אנחנו שמים את מדיום המצב על פני עמודות שונות, קטיון, החלפה, אי הכללת גודל, ואנחנו מקבלים שברים מזה שיש להם פעילות.
ועכשיו אנחנו עוקבים אחר הפעילות הזו ואנחנו לוקחים את השברים האלה, מוצאים אילו מהם פעילים, ומשם אנחנו יכולים להריץ אותם על ג'לים, לוודא שיש לנו רק מספר קטן יחסית של רצועות על הג'ל ואז אנחנו יכולים לחתוך אותם ולרצף אותם לפי מפרט מסה. וזה נותן לנו הרבה ימים מעניינים. יש לנו לא מעט גנים מועמדים עכשיו שאנחנו בודקים בנפרד כדי לראות אם הם למעשה הגורם שאנחנו מחפשים.
אז בדקנו הרבה גורמים אנגיוגניים ידועים ואנחנו יודעים ש-GF צמחי ו-FGF בסיסי הם למעשה חיוניים להנבטה נכונה בבדיקה זו. אבל הם לא כל הסיפור. ישנם גורמים נגזרים שהם חשובים, כפי שציינתי, ואחת הדרכים שבדקנו את זה היא שלקחנו תאי גידול, שהם מאוד אנגיוגניים in vivo, הם מייצרים גידולים גדולים בעכברים והם בעלי כלי דם גבוהים.
והסתכלנו על תאי הגידול האלה והם מבטאים רמות גבוהות מאוד של צמחים והכנסנו אותם לתרביות שלנו. אז החלפנו את הפיברובלסטים בתאי הגידול הללו והם אינם תומכים באנגיוגנזה חזקה בבדיקה זו. וזה, זה מאוד מעניין.
מה שזה מרמז הוא, וזה הוצע גם על ידי אנשים אחרים, הוא שיש דיבור צולב בין הגידול, ה-S stroma, שהוא הפיברובלסטים ותאי תמיכה אחרים ברקמה לבין תאי האנדותל. ויכול להיות שתאי הגידול מייצרים כמה גורמים שעובדים ישירות על תאי האנדותל, אבל הם גם מייצרים אחרים שממריצים את הפיברובלסטים ותאי סטרומה אחרים כדי לייצר גורמים שתומכים גם באנגיוגנזה חזקה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
ד"ר כריסטופר סי וו יוז מציג מערכת תרבות המיועדת לחקר אנגיוגנזה in vitro, ומדגיש את תפקידם של פיברובלסטים בתהליך זה. הוא מדגיש את הפרשת גורם מסיס קריטי, אך לא מזוהה, על ידי פיברובלסטים המאפשר לתאי אנדותל ליצור מבנים וסקולריים מורכבים בתרבות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אנגיוגנזה
- טכניקות תרבות תאים
- ביולוגיה של תאי אנדותל
רקע
- אנגיוגנזה היא יצירת כלי דם חדשים מכאלה קיימים.
- פיברובלסטים ממלאים תפקיד מכריע בתמיכה בתפקוד תאי האנדותל.
- הבנת האנגיוגנזה היא חיונית לפיתוח טיפולים למחלות שונות.
- מודלים in vitro יכולים לספק תובנות למנגנוני האנגיוגנזה.
מטרת המחקר
- לייעל מבחן in vitro לחקר אנגיוגנזה.
- לחקור את האינטראקציות בין פיברובלסטים לתאי אנדותל.
- לזהות גורמים המקדמים יצירת מבנה וסקולרי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ציפוי חרוזים קטנים בתאי אנדותל.
- הטמעת חרוזים בג'לים של פיברין.
- מתן גורמי גדילה לגירוי אנגיוגנזה.
- תצפית על יצירת כלי דם בתרבות.
תוצאות עיקריות
- תאי אנדותל יצרו כלי דם מסועפים עם לומנים נאותים.
- גורמים מסיסים שמקורם בפיברובלסטים היו קריטיים ליצירת כלי דם.
- מערכת התרבות אפשרה תצפית מפורטת על תהליכים אנגיוגניים.
- התובנות שהושגו יכולות להודיע על אסטרטגיות טיפוליות למחלות וסקולריות.
מסקנות
- מערכת התרבות המותאמת יעילה לחקר אנגיוגנזה.
- פיברובלסטים הם חיוניים לתפקוד תאי האנדותל in vitro.
- יש צורך במחקר נוסף לזיהוי הגורמים המסיסים המעורבים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Robust in vitro angiogenesis models are critical for de-risking early-stage vascular target discovery and clarifying the mechanistic basis of vessel formation. This system enables precise genetic and environmental manipulation, supporting predictive confidence in target validation and functional screening. Its ability to recapitulate all key stages of angiogenesis in a controlled setting positions it as a reusable platform for portfolio-wide vascular biology initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of angiogenic gene function through controlled genetic manipulation of endothelial cells.
- Supports mechanistic de-risking by allowing isolation and analysis of tip versus trunk endothelial cell populations.
- Facilitates functional validation of candidate targets affecting sprouting, lumen formation, and anastomosis.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, quantitative system for measuring sprout number, length, diameter, and branching.
- Supports assay standardization by enabling consistent visualization and manipulation of angiogenic processes.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening and pathway analysis.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant angiogenic processes, supporting translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by mirroring in vivo vessel formation stages.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying stromal-endothelial interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This in vitro angiogenesis model bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling hypothesis testing and quantitative analysis of vessel formation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through genetic and environmental manipulation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for comparing angiogenic responses across conditions.
- Analytics: Enables measurement of sprout metrics and gene expression in defined endothelial subpopulations.
- Translational Research: Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling stromal-endothelial crosstalk.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized, scalable platform for vascular biology research across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in angiogenesis research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of vascular assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target function early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and genetic manipulation.
- Needs access to imaging, microdissection, and quantitative analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different endothelial or stromal cell sources.
- Identification of critical fibroblast-derived factors remains an ongoing challenge.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:07
Weaknesses of in vivo angiogenesis studies
1:56
Advantages of the fibrin gel/bead assay
6:30
Significance of fibroblasts
5:47
Quantifying angiogenesis in vitro
7:21
Angiogenic factors secreted by fibroblasts
4:10
Why use HUVEC (Human Umbilical Vein Endotheleial Cells)
8:57
Angiogenic factors in vivo vs in vitro
