ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לגידול ולהרחבה של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מסגמנטים ברונכיאליים אנושיים שבודדו לאחרונה. פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: קידוד ושריטה, צלחות תרבית של מאה מילימטר, תיקון רקמה ברונכיאלית, השתלות של רקמה ברונכיאלית (explant), מעבר של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים הגדלים עם ריססונים, ותאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים על transwells. לפני תחילת העבודה, שימו לב כי כל השלבים מבוצעים בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.

אלא אם צוין אחרת, אנא קראו את סעיף החומרים, الريאגנטים וההכנה ווודאו שאתם ערוכים כראוי. הפעולות הבאות: קידוד, תרבית תמיסת אם, מדיום, תמיסות דיסוציאציה, ציפוי ושריטות, בלוחות תרביה של מאה מילימטר, יש לבצע באופן מיטבי.

שמרו על סטריליות מלאה. הכינו צלחות תרבית סטריליות בקוטר 100 מילימטר ותמיסת ציפוי. בעזרת פיפט BST, העבירו 2 מיליליטר של תמיסת ציפוי לצלחית בקוטר 100 מילימטר וסובבו את הצלחת כדי לצפות את בסיסה.

וודאו שתמיסת הציפוי מכסה את בסיס הפלטה באופן אחיד. שאבו החוצה את שארית התמיסה והשתמשו בה לציפוי פלטה שנייה של מאה מילימטרים. חזרו על הפעולה עבור מספר הפלטות הדרוש.

מספר הצלחות הדרוש משתנה בהתאם למספר רגעי הרקמה (explants). ודאו שתמיסת הציפוי מכסה את בסיס הצלחות באופן אחיד, כפי שמוצג בסרטון.

כסו את הצלחות במכסיהן. הניחו לצלחות להתייבש באינקובטור למשך שעה עד שעתיים ושאבו את תמיסת העודפים לפני השימוש להשתלה של רקמה ברונכיאלית. ניתן להניח צלחות תרבית מצופות שלא נעשה בהן שימוש בתוך שקית סטרילית ולאחסנם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

השתמשו במספריים קטנים וחדים שעברו ניקוי בתרסיס, בסכין מנתחים (scalpel) ובפינצטה שחוממו ב-70% ethanol, ובצעו חריצים בצלחות בתוך ה-BSC על ידי לחיצה חזקה עם הסכין ליצירת סימני XS קטנים ועמוקים, לפחות ארבעה לצלחת. אם החריץ לא יהיה עמוק מספיק, חתיכות הרקמה לא יתקבעו במזרקים ויצופו בחוץ. הניחו את הרקמה בצלחת P3 מחוץ ל-BSC. שטפו ביסודיות את רקמת הסימפונות האנושית המבודדת ב-Bss.

פתחו את חלקי הסימפונות. העבירו את הרקמה לתוך BS והעבירו אותה לפיתה סטרילית לתרבית רקמות של 100 מ"מ עם DMEM/F12 מקורר בתוספת 1% antibiotic-antimycotic. השתמשו במספריים קטנים וחדים כדי לחתוך את הרקמה לקוביות בגודל של 2-3 מ"מ.

הניחו בעזרת פינצטה פיסה אחת של רקמה חתוכה במרכזו של כל X ולחצו. אפשרו לחתיכות הרקמה או למשתילים (explants) מה-X להיצמד לצלחת למשך מספר שניות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 10 mils של מצע גידול מלא. אם הרקמה צפה לאחר הוספת המצע, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את הרקמה אל תוך החריצים של ה-X או צרו X חדש. ייתכן שיהיה צורך ליצור Xs חדשים אם החריצים אינם עמוקים מספיק.

הניחו את הפלטות באינקובטור והחליפו את המצע בכל שלושה עד ארבעה ימים עד שהרקמות יהיו מוכנות להשתלה. כאשר תגדל כמות מספקת של תאי אפיתל מסביב לרקמות כך שיכסו שטחים של 1-2 סנטימטר, תהליך זה אורך כארבעה שבועות. השתמשו בפלטות מצופות ושרוטות בקוטר 100 מילימטר.

מאחר שחלק מהשתלות הרקמה עשויות שלא להצליח, מספר הצלחות המבחנה תלוי במספר חתיכות הרקמה שאתם מש transplanted. אם אתם משתמשים בצלחות שעובו מראש ואוחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, יש להביא אותן לטמפרטורת החדר לפני השימוש. בעזרת פינצטה, הסירו בזהירות את הרקמה מהצלחת המקורית, הניחו אותה במרכז הציר בצלחת החדשה ולחצו בעדינות. רקמות ללא צמיחה חיצונית (outgrowth) יש להשליך.

הניחו לרקמה להיקשר לפלטה. הוסיפו מצע גידול למשך מספר שניות והדגירו. הוסיפו כפי שתואר קודם לכן עבור הסבר X.

הוסיפו 2 mL של תמיסת סטוק של trypsin ו-EDTA לכל צלחת תרבית רקמה בנפח 100 mm. דללו את הסטוק עם 6 mL של PBS סטרילי בריכוז 0.01 M, כך ש-2 mL של תמיסת סטוק ל-6 mL של PBS יניבו ריכוז סופי של trypsin של 250 µg/mL ושל EDTA של 100 µg/mL. לאחר העברת האקספלאנטים לצלחת חדשה, שאבו את המצע מהצלחות שבהן קיימים טבעות תאים בקוטר של 1-2 ס"מ.

הוסיפו שמונה מיליליטר (ml) של טיפות מדוללות חמימות ותמיסת edt לכל צלחת של מאה מילימטר (mm). והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 עד 15 דקות. בדקו את הדגימות בתדירות גבוהה.

השארת טריפסין למשך זמן רב מדי תפגע בתאים. יש לבדוק את הפלטות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שרוב התאים הופרשו; התאים יהפכו לעגולים וייפרדו כפי שניתן לראות ב-8 מיל של חימום. יש להוסיף 10% FBS למצע לכל פלטה כדי לנטרל את תמיסת ה-EDTA.

Combine את הנפחים מכל הפלטות לשפרוּרה אחת או לשפרוּרות נפרדות לפי רקמות שונות. ספרו את התאים באמצעות Hema Cytometer לאחר צנטריפוגה ב-100 G למשך חמש דקות. משקע תאים ייווצר בתחתית השפרוּרה; השעיקו מחדש את משקע התאים במצע מלא עד לריכוז התאים הרצוי.

העבירו בין שניים ל-3 מיליון תאים לכל בקבוק T 75 והוסיפו מצע מלא לפי הצורך. דגרו והחליפו את המצע. מדי שלושה עד ארבעה שבועות, התאים מגיעים למצב של sub confluence בבקבוקי D 75.

בתוך כארבעה שבועות, יש להסיר את התאים ולהרחיבם, או להשתמש בהם כאשר הם אינם במצב של התמסרות מלאה (sub confluence) על מנת למנוע הזקנה תאית. התחילו בהכנת הממברנות המהווררות של ה-transwells. השתמשו במאזיקים (inserts) בגודל 6.5 מילימטר המתאימים לפלטות עם 24 בארות.

הוסיפו מצע לשני צידי הממברנה. 0.6 mils בחלק התחתון ו-0.1 mils בחלק העליון. דגרו למשך שעה אחת באינקובטור לתרביות תאים.

הסיר בזהירות את המצע משני צדדיו של הקרום. התחל תחילה עם הנפח הבזאלי; יש לנהוג בזהירות שכן הקרום עלול להינזק בקלות. לכן, שפוף את המצע במורד דופן המבנית לתרבית (culture insert), תוך שימוש בנפח המומלץ.

אי-ביצוע פעולה זו יגרום לדליפת מדיום לבארים אחרות שבהן זרעו תאים. לאחר דגירה מוקדמת של התמיכה המאווררת (permeable support), העברו בזהירות באמצעות פיפטה את תרחיף התאים לצד האפיקלי של ממברנה בבארים בעלות קוטר של 6.5 millimeter, בנפח של 0.1 mils של תרחיף תאים לצד האפיקלי של הממברנה. העבירו בפיפטה 0.6 M מדיום לצד הבסאלי של הממברנה.

הזינו את התאים מהצדדים האפיקליים והבזאליים למשך 10 ימים. כדי להקריב תרבית מובחנת היטב, החליפו את המצע פעמיים בשבוע. הסירו את הנפח הבזאלי באמצעות השיטה שהודגמה.

ראשית, החליפו את נפח המצע העליון, והוסיפו 0.6 mils של מצע לצד הבזאלי של הממברנה. שיטה זו מקדמת היצמדות של תאים לממברנה ומונעת חשיפת תאים לאוויר למשך פרקי זמן ממושכים. החליפו את המצע במהירות והחזירו למדגרה.

צרו ממשק אוויר-נוזל (air liquid interface) ביום ה-10 על ידי הסרת מצע ה-AAL והחלפת 0.6 mil של מצע בצד הבסיס של הממברנה. תחזיקו את התאים בממשק אוויר-נוזל למשך שש שבועות והחליפו את המצע פעמיים בשבוע. תאים מוצליים יתחילו להופיע ארבעה שבועות לאחר יצירת הממשק.

ממשק נוזלי. תאים יעברו דיפרנציאציה אחידה לתאי ריסים. ששה שבועות לאחר יצירת הממשק הנוזלי של האוזן.

מקטעים ברונכיאליים אנושיים עם תאים אפיתליאליים בריאים מתוך רקמות שהוצאו (explan) ושתלים. במחקר שלנו, השגנו תרביות מוצליחות מש transplanted bronchial tissue בשמונה מתוך תשעת הרקמות. כיוון שאחת מתרביות ה-explan נדבקה בזיהום, טבעות התאים האפיתליאליים הגיעו לרדיוס של 1-2 ס"מ תוך שלושה עד ארבעה שבועות.

דגימות X explan מוצלחות תירבייה שוב עד שישה פעמים. כל התרביות המוצלחות הראו עדות לנדידת תאים תוך 48 שעות מתחילת השתלות, או שדגימות X explan, כפי שמוצג בתאי B, הראו מראה של "cobblestone" האופייני לתאים אפיתליאליים אלו, כפי שמוצג ב-B. ובאיורים הבאים, צביעה אימונוהיסטוכימית של תכשירי ציטוזין של תאים מה-explan ותאים שנזרעו על כיסויי זכוכית (cover slips) גילתה כי כל התאים היו חיוביים לציטוקרטין הספציפי לאפיתל; תאי ברונכיים אנושיים מתרבית משנית שגודלו עד למצב של סוב-קונופלואנס (sub confluence) בבקבוקי T 75 מוצגים כאן. שימו לב למראה ה-cobblestone.

תאי ברונכיאליים אנושיים בתרבית משנית הראו צביעה אימונוהיסטוכימית חיובית אחידה לקריטין ו-E.Can. צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים ספציפיים לסוגי תאים אחרים לא הראתה כל סימן לזיהום של התרביות על ידי פיברובלסטים, תאים מזנכימליים או תאים אנדותליאליים. לפרטים נוספים, אנא עיינו באיור 5 ובלגיון שלו בטקסט. תאים שגודלו על ממברנות פוליאסטר חדירות או ב-transwells עם ממשק נוזלי התמיינו לאפית מוצלילית, כפי שמוצג כאן; יש להשליך תאים ואת התרביות שלהם אם מתחילים להופיע תאים בעלי מורפולוגיה שונה מזו המוצגת כאן. בפרוטוקול זה, הצגנו שיטות מפורטות לתרבית ולהרחבה של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים ראשוניים.

מחקרים מבוססי תאי אנוש נחוצים לקביעת מסלולים חשובים של מנגנוני מחלות ריאה באדם, ולסריקות רעילות וסריקות פרמקולוגיות של תרופות חדשות. אנו מקווים שהשיטות המתוארות כאן יעודדו אתכם לתרבת תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מתוך נדבגי רקמה (explants) ולהשתמש בתאים אלו במערכות המחקר שלכם. תודה ובהצלחה.