ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לגידול ולהתרחבות של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מסגמנטים ברונכיאליים אנושיים שבודדו לאחרונה. פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: קידוד וגירוד, צלחות תרבית של מאה מילימטר, תיקון רקמה ברונכיאלית, השתלות של רקמה ברונכיאלית, מעבר (passage) של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים הגדלים עם ריסונים, ותאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים על transwells. לפני שתתחילו, שימו לב שכל השלבים מבוצעים בתוך קבינט בטיחות ביולוגית.

אלא אם צוין אחרת, נא לקרוא את סעיף החומרים, הריאגנטים וההכנה ולוודא שאתם מוכנים בסיסית. הפעולות הבאות: קידוד, תרביות תמיסות מלאי, מדיום, תמיסות דיסוסיאציה (פירוק), ציפוי ושריטה, יש לבצע בצלחות תרבית של 100 מילימטר ב-bst.

שמרו על סטריליות מלאה. הכינו פלטות תרבית סטריליות של 100 מילימטרים ותמיסת ציפוי. בעזרת פיפט BST, העבירו 2 מיליליטר של תמיסת ציפוי לפלטה של 100 מילימטרים וסובבו אותה כדי לצפות את בסיס הפלטה.

וודאו שתמיססת הציפוי מכסה את בסיס הצלחת באופן אחיד. שאבו החוצה את שארית התמיסה והשתמשו בה לציפוי צלחת שנייה בקוטר מאה מילימטר. חזרו על הפעולה עבור מספר הצלחות הדרוש.

מספר הצלחות הנדרש משתנה בהתאם למספר רגמני הרקמה. ודאו שתמיסת הציפוי מכסה את בסיס הצלחות באופן אחיד, כפי שהודגם.

כסו את הצלחות במכסיהן. הניחו לצלחות להתייבש באינקובטור במשך שעה עד שעתיים ושאבו את התמיסה העודפת לפני השימוש להרחבת רקמה ברונכיאלית. ניתן להניח צלחות תרבית מצופות שלא נעשה בהן שימוש בתוך שקית סטרילית ולאחסנן בטמפרטורה של 4 °C לשימוש מאוחר יותר.

נקה באמצעות תרסיס מספריים קטנים וחדים, סכין מנתחים ופינצטה ב-70% ethanol, והכנס למכבה זרימה למינרית (BSC) צלחות מצופות שריטות על ידי לחיצה חזקה בעזרת סכין המנתחים ליצירת סימני X קטנים ועמוקים, לפחות ארבעה לכל צלחת. אם השריטות אינן עמוקות מספיק, חתיכות הרקמה לא יתיישבו במזרקים ויצופו בחוץ. מחוץ ל-BSC, הנח את הרקמה בצלוחית P3. שטוף היטב את רקמת הסימפוניקה הברונכיאלית האנושית המבודדת ב-Bss.

פתחו את מקטעי הסימפונות. העבירו את הרקמה אל ה-BS והעבירו אותה לצלחת תרבית רקמה סטרילית של 100 מילימטר המכילה DMEM/F-12 קר עם 1% antibiotic antimycotic. השתמשו במספריים קטנים וחדים כדי לחתוך את הרקמה לקוביות בגודל של 2 עד 3 מילימטר.

הניחו בעזרת פינצטה חתיכה אחת של רקמה חתוכה במרכז כל X ולחצו. אפשרו לחתיכות הרקמה או לשתלי ה-X להיצמד לצלחות למשך מספר שניות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 10 mils של מצע גידול מלא. אם הרקמה צפה לאחר הוספת המצע, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את הרקמה לתוך החריצים של ה-X או צרו X חדש. ייתכן שיהיה צורך ליצור X-ים חדשים אם החריצים אינם עמוקים מספיק.

הניחו את הפלטות באינקובטור והחליפו את המצע בכל שלושה עד ארבעה ימים עד שהרקמות מוכנות להשתלה. כאשר צומחו תאים אפיתליאליים מספיקים סביב הרקמות כך שיכסו שטחים של 1-2 סנטימטר, תהליך זה אורך כארבעה שבועות. השתמשו בפלטות מצופות ונשורות בקוטר 100 מילימטר.

מאחר שחלק מהספלחיים של הרקמה עלולים שלא להצליח, מספר הצלחות תלוי במספר חלקי הרקמה המועברים. אם נעשה שימוש בצלחות שצופו מראש ואוחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, יש להביא אותן לטמפרטורת החדר לפני השימוש. בעזרת פינצטה, הרם בזהירות את הרקמה מהצלחת המקורית, הנח אותה במרכז הציר בצלחת החדשה ולחץ בעדינות. רקמות ללא צמיחה חיצונית (outgrowth) יש להשליך.

הניחו לרקמה להיקשר לפלטה. הוסיפו מצע למשך מספר שניות והדגירו. הוסיפו כפי שתואר קודם לכן עבור הסבר X.

הוסיפו 2 mL של תמיסת סטוק של trips And EDTA עבור כל צלחת תרבית רקמה בנפח 100 mm. דללו את הסטוק עם 6 mL של PBS סטרילי בריכוז 0.01 M, כך ש-2 mL של תמיסת הסטוק ב-6 mL של PBS יניבו ריכוז סופי של trypsin בריכוז 250 µg/mL ושל EDTA בריכוז 100 µg/mL. לאחר העברת האקספלאנטים לצלחת חדשה, שאבו את המצע מהצלחות בעזרת טבעות של 1-2 cm של תאים.

הוסיפו שמונה מיליליטרים של תמיסת טפטופים מהולה וחמימה ושל תמיסת edt לכל צלחת של מאה מילימטר. והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 עד 15 דקות. בדקו בתדירות גבוהה.

השארת טריפסין למשך זמן רב מדי תגרום לנזק לתאים. יש לבדוק את הצלחות המערכת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שרוב התאים הוסרו; התאים יהפכו לעגולים ויתנתקו כפי שמוצג ב-eight Mils of warmth. יש להוסיף 10%FBS במצע לכל צלחת כדי לנטרל את תמיסת ה-EDTA.

אחדו את הנפחים מכל הפלטות לשפופרת אחת או לשפופרות נפרדות עבור רקמות שונות. ספרו את התאים באמצעות Hema Cytometer לאחר צנטריפוגה במהירות של 100G למשך חמש דקות. משקע תאים ייווצר בתחתית השפופרת; השביו את משקע התאים במצע מלא עד להשגת ריכוז התאים הרצוי.

העבירו שני עד 3 מיליון תאים לכל בקבוק T 75 והוסיפו מצע מלא לפי הצורך. דגרו והחליפו את המצע. מדי שלושה עד ארבעה שבועות, התאים מגיעים לצפיפות תת-מלאה (sub confluence) בבקבוקי D 75.

בתוך כארבעה שבועות, יש להרים ולהרחיב את התאים או להשתמש בהם לפני שהגיעו למצב של התמסכות (confluence) כדי למנוע הזדקנות תאית (senescence). התחילו בהכנת הממברנות המאווררות של ה-transwells. השתמשו באינסרטים בקוטר 6.5 מילימטר המתאימים לפלטות עם 24 בארות.

הוסיפו מצע לשני צדי הממברנה. 0.6 מיליליטר למטה ו-0.1 מיליליטר למעלה. הדגרימו למשך שעה אחת באינקובטור לתרביות תאים.

הסיר בזהירות את המדיום משני צדדיה של הממברנה. התחל תחילה בנפח הבזאלי; שים לב כי הממברנה עלולה להינזק בקלות. לכן, העבר את המדיום באמצעות פיפטה לאורך דופן התמיכה של התרבית (culture insert), והשתמש בנפח המומלץ.

אי-ביצוע פעולה זו יוביל לדליפה של המצע לבארים אחרות שבהן זרעו תאים. לאחר דגירה מוקדמת של התמיכה המאפשרת חדירה, העבירו בזהירות באמצעות פיפטה את תרחיף התאים לצד האפיקלי של הממברנה עבור בארות של 6.5 millimeter, בנפח של 0.1 mils של תרחיף תאים לצד האפיקלי של הממברנה. העבירו בפיפטה 0.6 M של מצע לצד הבזאלי של הממברנה.

הזינו את התאים מהצדדים האפיקליים והבסאליים למשך 10 ימים. כדי להקים תרבית מובחנת היטב, החליפו את המצע פעמיים בשבוע. בשיטה שהודגמה, הסירו את הנפח הבסאלי.

ראשית, להחלפת הנפח האפיקלי, יש להוסיף 0.6 mL של מצע לצדו הבזאלי של הממברנה. שיטה זו מקדמת היצמדות של תאים לממברנה ומונעת חשיפה של התאים לאוויר לפרקי זמן ממושכים. יש להחליף את המצע במהירות ולהחזיר את הדגימות לאינקובטור.

צרו ממשק אוויר-נוזל (air liquid interface) ביום ה-10 על ידי הסרת מצע ה-AAL והחלפת ה-0.6 ml של המצע בצד הבסיסי של הממברנה. תחזקו את התאים בממשק אוויר-נוזל למשך שישה שבועות והחליפו את המצע פעמיים בשבוע. תאים מוצליים יתחילו להופיע ארבעה שבועות לאחר יצירת הממשק.

ממשק נוזלי. תאים יעברו דיפרנציאציה אחידה לתאים ריסניים. שישה שבועות לאחר יצירת הממשק הנוזלי של האוזן.

מקטעי סימפונות אנושיים עם תאים אפיתליאליים בריאים מרקמות שהוצאו (explan) והשתלות. במחקרנו, השגנו תרביות מוצלחות מרקמות סימפונות בשמונה מתוך תשע דגימות. מכיוון שאחת מתרביות הרקמות הוצמחה במצב של זיהום, טבעות התאים האפיתליאליים הגיעו לרדיוס של 1-2 סנטימטרים תוך שלושה עד ארבעה שבועות.

שבתי X מוצלחים תורבעו שוב עד שש פעמים. כל התרביות המוצלחות הראו עדות לנדידת תאים בתוך 48 שעות מתחילת ההשתלה, או ששבתי X כפי שמוצג בתאים B בעלי מראה של "ריצוף" (cobblestone) האופייני לתאים אפיתליאליים אלו כפי שמוצג ב-B. ובדמויות הבאות, צביעה אימונולוגית של תכשירים ציטוזוליים של תאים מהשבתי ותאים שנזרעו על לבישות זכוכית חשפה כי כל התאים היו חיוביים לציטוקרטין ספציפי לאפיתליום; תאי סיבוב תת-קונופלואנס (sub confluence) ברונכיאליים אנושיים שגודלו בבקבוקי T 75 מוצגים כאן. שימו לב למראה הריצוף.

תאי סימבלי ברונכיאליים אנושיים שהוצגו הראו צביעה אימונוהיסטוכימית חיובית ואחידה לקריטין ו-E.Can. צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים ספציפיים לסוגי תאים אחרים לא הראתה כל אינדיקציה לזיהום של התרביות על ידי פיברובלסטים, תאים מזנכימליים או תאים אנדותליאליים. לפרטים נוספים, אנא עיינו באיור חמישה ובמקרא שלו בטקסט. תאים שגודלו על ממברנות פוליאסטר חדירות או ב-transwells עם ממשק נוזלי התבדלו לאפית מוששערת כפי שהודגם כאן; יש להשליך את התאים ואת השתילים שלהם אם מתחילים להופיע תאים בעלי מורפולוגיה שונה מזו שהודגמה כאן. בפרוטוקול זה, הצגנו שיטות מפורטות לתרבית ולהרחבה של תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים ראשוניים.

מחקרים המבוססים על תאי אנוש נחוצים לקביעת מסלולים חשובים של מנגנוני מחלות ריאה באדם ולביצוע סריקות רעילות וסריקות פרמקולוגיות של תרופות חדשות. אנו מקווים שהשיטות המתוארות כאן יעודדו אתכם לגדל תאי אפיתל ברונכיאליים אנושיים מתוך נתיחים ולהשתמש בתאים אלו במערכות המחקר שלכם. תודה ובהצלחה.