ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

קביעת הרכב הפוליסכריד של המטריצה ותכולת התאית הגבישית של דפנות תאי הצמח מתחילה בחומר צמחי מיובש, הנתון למיצויים שונים. החומר המתקבל מורכב מדפנות תאים בלבד ואז מפוצל כדי לקבוע את הרכב הפוליסכריד של המטריצה. חומר הקיר מטופל בחומצה חלשה להידרוליזה, פוליסכרידים לא גבישיים, שהם בעיקר תאי ההמו לחד-סוכרים שלהם.

לאחר מכן נגזרים החד-סוכרים לאצטטים הנדיפים המתאימים להם, אשר לאחר מכן מנותחים ומכומתים על ידי כרומטוגרפיה של גז יחד עם ספקטרומטר מסה לקביעת תאית גבישית. קירות תוכן מטופלים במגיב הגרף, תערובת של חומצות המסירות רכיבי קיר לא גבישיים. התאית הגבישית שנותרה מתפרקת לגלוקוז המונומר שלה, אותו ניתן לאמוד, באופן מטרי.

קביעת תכולת הליגנין והרכבו מודגמת בפרסום וידאו אחר של J שכותרתו ניתוח קומפוזיציה מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק ראשון ליגנין. היי, אני מרקוס פאולי, ראש המתקן האנליטי של וול במרכז המחקר לביו-אנרגיה של האגמים הגדולים כאן באוניברסיטת מישיגן. אני קליף פוסטר מנהל המתקן האנליטי של קיר התא.

היום נראה לכם כיצד לקבוע את הרכב הפוליסכרידים הקיימים בחומר דופן תא הצמח שהוא תאית בהומו צלולוזות שונות. כאן במרכז המחקר לביו-אנרגיה של האגמים הגדולים, אנו מפתחים טכנולוגיה להמרת הסוכרים האלה לדלקים ביולוגיים. על מנת לזהות חומר גלם צמחי אופטימלי, אנו צריכים קודם כל להעריך את סוג ושפע הסוכרים שנמצאים בביומסה הזו.

בסרטון אחר שכותרתו ניתוח קומפוזיציה מקיף של דפנות תאי צמחים, חלק ראשון ליגנין, נתמקד בניתוח הפוליפנולים. אז בואו נתחיל. התחל הליך זה על ידי בידוד דפנות התאים.

טוחנים בערך 60 עד 70 מיליגרם של חומר צמחי מיובש עם כדורי נירוסטה 5.5 מילימטר בצינור מכסה בורג SAR TED של שני מיל. השתמש בטחנת REM כחלופה לתפוקה גבוהה, השתמש ברובוט שחיקה וחלוקה המכונה דופן עין כמתואר בחלק הראשון. בסיום הטחינה, הסר את כדורי הפלדה.

המשך לבודד את דפנות התא ולהסיר שאריות עמילן כפי שמוצג בחלק הראשון ומתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. שקלו שני מיליגרם של חומר דופן תא עמילן DS לתוך צינור של שתי טחנות. דרך תפוקה גבוהה לביצוע משימה זו היא רובוט דופן העין.

הרובוט לוקח צינור המכיל חומר צמחי טחון ותוקע חור בתחתית הצינור. לאחר מכן מניחים את הצינור המנוקב על מזין VI. צינור ריק מונח על איזון ומועבר מתחת למזין VI דרך חומר רטט המחלחל דרך החור בצינור העליון הטעון לתוך הצינור התחתון הריק עד להצטברות כמות החומר הרצויה.

הוסף 100 מיקרוגרם אצטול כתקן פנימי. שוטפים את קירות הצינור באצטון כדי לאסוף את חומר דופן התא בתחתית הצינור ולאדות את האצטון בעדינות רבה תחת זרימת האוויר. לאחר מכן, בצע הידרוליזה של חומצה חלשה.

הוסף בזהירות 250 מיקרוליטר של שתי חומצה טריכלורואצטית טוחנת או TFA לכל דגימה, וודא ששום חומר לא ניתז על דפנות הצינור. מכסים היטב את הצינורות ומדגרים בחום של 121 מעלות צלזיוס בגוש חימום למשך 90 דקות. לאחר מכן יש לקרר את גושי החימום והדגימות על קרח ולצנטריפוגה את הצינורות ב-10,000 סל"ד למשך 10 דקות.

העבירו 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט החומצי המכיל את הסוכרים המסיסים של הפוליסכריד המטריצה לבקבוקוני הברגה, והקפידו לא להפריע לחומר הגלולה. הגלולה יכולה לשמש לבדיקת התאית הגבישית. אידוי ה- TFA בצינור זכוכית מתחת לזרם אוויר עדין במכשיר אידוי.

הוסף 300 מיקרוליטר של שני פרופנול כדי להסיר עודף מערבולת חומצה ולהתאדות ב-25 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה בסך הכל שלוש פעמים. על מנת לאפשר זיהוי של החד-סוכרים על ידי כרומטוגרפיה של גז, יש לבצע נגזרת של אלדול אצטט.

ראשית, צמצם את החד-סוכרים לאלדולים הטבעתיים הפתוחים המתאימים להם, אשר לאחר מכן עוברים אצטילציה. עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף לקבלת הוראות מפורטות. כל שלב בהליך עוקב אחר הפרוטוקול שהוצג קודם לכן, תוספת של אידוי דגירה של ריאגנט מתחת לזרם אוויר, ואחריו הסרת עודף מגיב על ידי שלבי כביסה שונים.

בשלבים האחרונים מופקים אצטטים של אלדול. ראשית, מוסיפים 500 מיקרוליטר של אתיל אצטט ומערבבים קלות. לאחר מכן מוסיפים שני מיל מים, מכסים את הצינורות והמערבולת, צנטריפוגה את הצינורות ב-2000 סל"ד למשך חמש דקות כדי לקבל שכבות נפרדות ברורות עם אתיל אצטט למעלה המכילה את אל-דטול אצטטים ומים בתחתית פיפטה 50 מיקרוליטר של שכבת אתיל אצטט לתוך בקבוקוני GCMS עם תוספות מדללות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר אצטון לבקבוקון ה-GC וניתן לאחסן את בקבוקון ה-GC בארבע מעלות צלזיוס.

אם ניתוח ה- GCMS אינו מתקדם מיד, הזרקו את הדגימות לצלם כרומה גז המצויד בספקטרומטר מסה מרובע. לטור ופרטים על הריצה, אנא עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף. חומר המוצא לקביעת תכולת התאית הגבישית יכול להיות חומר דופן תא מבודד או חומר קיר שכבר טופל בחומצה החלשה TFA, מיד לאחר טיפול בחומצה או בצורה מיובשת הניתנת לאחסון.

לאחר הסרת עודפי TFA עם איזו פרופנול כפי שהוצג קודם לכן, הוסף לכדור ה-TFA בשני ה-M sars לצינור M אחד של מגיב דגרה המורכב מחומצה אצטית, חומצה חנקתית ומים, הוסף יחס של שמונה לאחד עד שניים נפח לנפח. מכסים היטב את הצינור מערבולת ומחממים על גוש חימום בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כתוצאה מטיפול זה נותרה רק תאית גבישית בגלולה.

כל שאר הפוליסכרידים הם דגימות קרות שעברו הידרוליזה בבלוק על קרח לטמפרטורת החדר או קריר יותר. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 סל"ד למשך 15 דקות לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט כדי להבטיח שהגלולה לא תופרע ושום חומר מהגלולה לא יוסר. לשם כך, השאירו כ -150 מיקרוליטר של הסופרנטנט בצינור, שטפו את הגלולה מספר פעמים במים.

לאחר מכן, בצע את אותו הדבר והידרוליזה עם החומצה הגופרתית המרוכזת על מנת להידרוליזה לחלוטין של הגביש וכדור התאית לגלוקוז. התחל בהוספת 175 מיקרוליטר של חומצה גופרתית 72% לצינור הסרטה ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה הראשונית, מערבלים את הדגימה ודוגרים למשך 15 דקות נוספות.

לאחר מכן מוסיפים 825 מיקרוליטר מים ומערבולת וצנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 סל"ד למשך חמש דקות. ייתכן שיש חומר חום ומסיס, בעיקר ליגנין שנשאר בצינור בזמן שהגלוקוז נמצא בסופרנטנט. תכולת הגלוקוז של הסופרנטנט נבדקת באמצעות בדיקת האנטון הקולורמטרי.

בדיקה זו מבוצעת בצלחת מיקרוטיטר פוליסטירן 96 באר. תקן עקומת גלוקוז סטנדרטית בשכפול בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף. הכן את הדגימות על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר מכל דגימה, סופרנט ו-90 מיקרוליטר מים לבארות נפרדות של אותה לוחית מיקרוטיטר כמו הגימור הסטנדרטי על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מגיב טרי שהוכן ונזרק.

לאחר מכן, מחממים את הצלחת למשך 30 דקות בחום של 80 מעלות צלזיוס בתנור עם מפזר חום מאלומיניום. שימו לב שהדגימות המכילות גלוקוז הופכות מצהוב לירוק כחול בסיום החימום. נותנים לצלחת להתקרר לטמפרטורת החדר ומנערים היטב.

קרא את הספיגה ב-625 ננומטר באמצעות קורא לוחות מיקרוטיטר. תכולת הגלוקוז, אבן הבניין של התאית מחושבת על סמך הספיגה בהשוואה לעקומה הסטנדרטית שנקבעה על אותה צלחת. להלן כמה תוצאות מייצגות של ניתוח פוליסכריד של חתיכת עץ צפצפה.

שיאי כרומטוגרמת הגז מזוהים על ידי פרופילי מסה ו/או זמני שמירה של תקנים. החד-סוכרים מכומתים על סמך עקומות סטנדרטיות. ניתוח הסוכר של פוליסכרידי המטריצה מראה שפע גבוה של קסילוז המייצג תאית המי xam, אך קיימים גם סוכרים אחרים.

על פי הניתוח, 40% מחומר הצפצפה מורכב מקריסטל ותאית. שימו לב שתכנים והרכבים אלה יכולים להשתנות מצמח לצמח או בין אנטומיות צמחים שונות. זה עתה הראינו לך כיצד לקבוע את תכולת הפוליסכריד וניתוח ההרכב של ביומסה תאית ליניאנו לניתוח פוליפנול ליגנין.

התכווננו לחלק הראשון. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.