Name: טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: למדו את פרוטוקול טיהור החלבון MamAΔ41 מ-Magnetospirillum magneticum באמצעות כרומטוגרפיית אפיניות ויון. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני ופונקציונלי של חלבוני מגנטוזום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים ד&quot;ר אמיר אהרוני על תמיכתו וגאולה דוידוב, נועם גרימברג חן גוטמן עצה והערותיהם.

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

טיהור חלבון היא הצעד העיקרי כל החלבונים או הביוכימיות מחקרים מבניים. מאז החלבון הוא ייחודי עם ההתנהגות שלו, צריך להגדיר את המאפיינים שלו ולשנות טיהור שלה בהתאם. היעד חלבון יש לנתח כצעד ראשון לקראת טיהור שימוש בכלים לביואינפורמטיקה. הם משמשים כדי לחשב את נקודת iso חשמלי יעד, להעריך את הצורך שלה עבור הפחתת / חמצון הסביבה ועל הצורך שלה עבור יונים / ligands מיוחד. ישנם מספר שינויים קריטיים של פרוטוקול שלנו אשר משקפים את הייחודיות היעד. שינויים אלה כוללים, חיץ טמפרטורות עבודה והתאמות ה...

<table><tbody><tr><td>French Press</td><td>ציוד</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>תא לחץ</td><td>ציוד</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>ציוד</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>רוטור</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות לאולטרה-צנטריפוגה; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>עמודי כרומטוגרפיה מסוג Glass Econo-Column, קוטר 2.5cm</td><td>ציוד</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>שרף Ni-NTA His Bind</td><td>ציוד</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>ציוד</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>קובית קוורץ</td><td>ציוד</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרפיית נוזלים מהירה (FPLC) - AKTA purifier 10</td><td>ציוד</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>עמוד חילוף יונים &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>ציוד</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>עמוד מילוי מראש להפרדה לפי גודל (Size exclusion) - HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>ציוד</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 MWCO</td><td>ציוד</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת שולחן</td><td>ציוד</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>ציוד</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl ((hydrotymethyl) aminomethane)</td><td>ריאגנט</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>ריאגנט</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>ריאגנט</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז ללא EDTA</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (Deoxyribonuclease I)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Thrombin</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ריאגנט</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>ריאגנט</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;thanol</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>ריאגנט</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>ריאגנט</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 magnetosome חלבון associated mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

חיידקים Magnetotactic מהווים קבוצה מגוונת של מיקרואורגניזמים ימיים המסוגלים להתמצא עצמם לאורך שדות geomagnetic. התנהגות זו הוא האמין סיוע בחיפוש אחר בסביבה מתאימה<em&gt; (1)</em&gt;. יכולת זו היא שמעניקה magnetosome, אברון subcellular שמורכבת הרכבה לינארית שרשרת של כל השומנים שלפוחית ​​מסוגל biomineralize ולתחום ~ 50 ננומטר של גביש מגנטיט או greigite. רכיב עקרון magnetosome כי הוצגה להידרש להקמת שלפוחית ​​פונקציונלי היא אמא. אמא הוא נרחב ביותר magnetosome הקשורים חלבון שהוא אחד magnetosome הקשורים חלבונים מאופיין ביותר<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. מאמר זה מתמקד טיהור של אמא, אשר אף נחקר<em&gt; In vivo</em&gt;, או פרטים לא תפקודית מבנית ברורה זוהו על זה. ביואינפורמטיקה ניתוח הציע כי אמא היא לחזור טטרה tricopeptide (TPR) המכיל חלבון. TPR הוא מוטיב מבני גילו כחלק כזה או להרכיב של קיפול גדול יותר במגוון רחב של חלבונים, היא משמשת כתבנית חלבונים אינטראקציות ומתווך רב חלבון מתחמי<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs מעורבים משימות חיוני לתהליכים רבים בתא אוקריוטים אברון מסלולים חיידקים רבים<em&gt; (8-14).</em&gt; על מנת להבין את אמא, TPR ייחודי המכיל חלבון, חלבונים מטוהרים נדרש כשלב ראשון. במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור עבור יציבה אמא ​​המחיקה מוטציה (MamAΔ41) מ<em&gt; מ magneticum</em&gt; השגריר-1.

אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41) מ<em&gt; מ magneticum</em&gt; השגריר-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

חיידקים מגנטוטקטיים מהווים קבוצה מגוונת של מיקרואורגניזמים מימי המסוגלים להכווין את עצמם לאורך שדות מגנטיים גיאומגנטיים. התנהגות זו היא...

תהליך הטיהור מתחיל עם משקעי תאים המבטאים את החלבון הרקומביננטי Mame. Delta 41. לאחר פירוק ממברנת התאים מתבצעת הפרדה בין הפракציה המסיסה לפракציה הבלתי מסיסה. כדי למצות את החלבון הרקומביננטי המסיס, כרומטוגרפיית זיקה מפרידה את החלבון הרקומביננטי המסומן מחלבונים תאיים אחרים.כרומטוגרפיית חילוף יונים מפרידה את mamma Delta 41 מחלבונים תאיים אחרים שנותרו לאחר כרומטוגרפיית ספיחה וא exclusion של גודל. כרומטוגרפיה מפרידה עוד יותר את mamma Delta 41 וחושפת את המצב האוליגומרי שלו. לבסוף, נותחים את טוהר וההומוגניות של החלבון הרקומביננטי.שלום, אני רזה, ראש מעבדת XVA במחלקה למדעי החיים באוניברסיטת Benon of the Negative. ואני נטלי, גם אני ממעבדת Z. היום נדגים לכם הליך לניקוי חלבון רקומביננטי.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור חלבונים הקשורים למגנטיות. לכן, בואו נתחיל. בתחילת פרוטוקול זה, חלבון ה-MAME Delta 41 מבוטא כחלבון היתוך עם 10 hiss.בתוך תאי BL 21 e coli, גדלו את התאים במצע השראה אוטומטית (auto induction media) המכיל Epi Brazilin בטמפרטורה של 310 K למשך שלוש שעות. לאחר מכן, העבירו את טמפרטורת הטיפוח ל-300 K והניחו לתאים להדגירה למשך 48 שעות. לאחר ההדגירה, קצרו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, שפכו את העלייה (supernatant) ושקלו את משקע התאים שהתקבל.שמונה ליטרים של תרבית אמורים להניב כ-60 גרם של משקע תאים רטוב. לפני טיהור החלבון, הכין תמיסות מלאי בנפח של 200 מיליליטר של 4 molar ile, 5 molar sodium chloride, ו-1 molar tris H-C-L-P-H 8.השתמש במים מזוקקים פעמיים (DDW) כדי לערבב את התמיסות ב-vortex עד להמסה מלאה, וסנן אותן דרך מסנן של 0.22 µm. סנן את תמיסות המקור שהוכנו טריות ואת באפרים A עד F כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. כדי להתחיל בטיהור החלבון, השהה את התאים בבאפר A ביחס של 1:2 בין מסת התאים לנפח הבאפר.עבור כל 10 גרם של חיידקים, יש להוסיף 10 µL של dna, אחד כדי לעכל מקטעי DNA בדגימה. לאחר מכן, יש להוסיף 1 mL של E dt, תערובת מעכבי פרוטאז חופשיים. עבור כל 20 גרם של חיידקים, יש לדגור את התמיסה במשך 20 דקות על קרח.לאחר הדגירה, יש לבצע ליזיס לתאים באמצעות שני מחזורי French press בלחץ של 25,000 PSI. עקב עליית הטמפרטורה, יש לקרר את הבוכנה על קרח למשך 10 דקות לפני השימוש. העבירו את התאים שעברו ליזיס למבחנות אולטרסנטריפוגה בנפח של 25 milliliter.מלאו את המבחנות עד לקו הצוואר בבופר A ואזנו אותן בדיוק. לאחר מכן, הפרידו את פסולת התאים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. במקביל, הרכיבו עמודת כבידה של Nickel NTA על ידי הוספת 4 mL של שרף Nickel NTA לעמודת זכוכית של 2.5 cm.הכינו את השרף לטיהור חלבונים בהתאם להוראות היצרן וה-S. לאחר צנטריפוגת הדגימות, שפכו את הפракציה המסיסה ממבחנות העלטרה-צנטריפוגה אל עמודת הניקל NTA. אספו את החלבונים שאינם נקשרים בפракציית ה-flow through.המשיכו לשטוף את העמודה עם 100 milliliters של buffer B ואספו את התוצר השוטף (flow through). שמרו את פראקציוני ה-flow through בטמפרטורה של 277 K. בצעו אלוציה של החלבון לתוך 15 מבחנות einor ממוספרות בנפח של 1.5 milliliter כל אחת. סגרו את שסתום העמודה וטענו 1 milliliter של buffer C על העמודה.לאחר זמן אינקובציה של שלושה דקות, פתחו את השסתום ואספו את השטוף. חזרו על שלב זה שלוש פעמים. המשיכו באלוציה של החלבון במרווחים של 1 mL של בופר, ללא זמן האינקובציה של שלוש הדקות.באמצעות ספקטרופוטומטר UV, אתרו את שיא החלבון במקטעים על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-280 ננומטר. לבסוף, בצעו ניתוח SDS-PAGE של המקטעים שנאספו. החלבון שאינו קשור נמצא בשטיפה, בסינון הראשוני (flow through) ובדגימת משקע מאולטרה-צנטריפוגה מהג'ל.קבעו אילו מהשברים שנשטפו (eluded fractions) מכילים רמות חלבון גבוהות ומרחבו את השברים שנבחרו. כדי להסיר את ה-10 hiss tag, הוסיפו 10 µL של thrombin בקר לכל mg של חלבון לדגימה המאוחדת. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לדגימה מול באפר D כדי להסיר את עודפי ה-in midol ולהפחית את ריכוז ה-sodium chloride.כהכנה לכרומטוגרפיית חילוף יונים, חתוך את האורך הרצוי של צינור דיאליזה עם סף הפרדה של שבעה kilodalton. שטוף את הצינור ב-DDW וצור שקית על ידי קשירת קשר בקצה אחד. העבר את תמיסת החלבון שעברה עיכול על ידי thrombin לתוך השקית, והשאר מרווח בחלק העליון. סגור את צינור הדיאליזה באמצעות תפס (clamp).טבול את צינור הדיאליזה בארבעה ליטרים של בופר D מקורר. ערבב את התמיסה באיטיות למשך הלילה בטמפרטורה של 277 K. לאחר דיאליזה למשך הלילה, הוצא את הצינור מהכלי. בצע חתך קטן והעבר את החלבון לשפופרת Falcon בנפח 50 מיליליטר. כרומטוגרפיית חילוף יונים משמשת לטיהור נוסף של חלבון memay Delta 41. חבר עמודת mono Q4 0.6 100 PE ארוזה מראש למערכת FPLC ACTA purifier.שטפו את העמודה בחמישה נפחי עמודה (CVs) של DDW מסונן ושווו את העמודה בחמישה נפחי עמודה של בופר D. שטפו את לולאת ההזרקה בשני נפחי לולאה של DDW ולאחר מכן בשני נפחי לולאה של בופר D. טענו את החלבון לתוך לולאת ההזרקה. הזריקו את דגימת החלבון בקצב זרימה של 1 mL לדקה והתחילו באיסוף פראקציות, אשר ישמשו לזיהוי חלבונים שאינם קשורים באמצעות SDS page.המשיכו להעמיס ולהזריק את החלבון עד להעמסה מלאה של הדגימה על העמודה. שטפו את העמודה באמצעות שלושה נפחי עמודה (cvs) של בופר D. כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים, בצעו אלוציה של החלבון במשך 60 דקות בקצב של 1 mL לדקה, תוך שימוש במדרג ליניארי של sodium chloride המתחיל ב-40 mM ומסתיים ב-2 M. אספו את שיאי החלבון כפי שהם מופיעים בكرומטוגרמה ב-280 nm לאחר הגעה ל-100% בופר E.נקה את עמודת ה-prepec בהתאם להמלצות היצרן. בצע ניתוח SDS page של פראקציות ה-FPLC שנאספו, כולל החלבון הבלתי קשור (unbound) והזרימה מהשיא של החלבון (protein peak flow through), באמצעות מרקרים צבועים מראש. העריך את פסי החלבון כדי לזהות את הפראקציות המכילות חלבון במשקל המולקולרי החזוי של Mame.דלתא 41, ערבבו את הפראקציות הנבחרות כהכנה לכרומטוגרפיית החרגת גודל. ריכוז הנתרן כלוריד של הדגימות המאוחדות מופחת על ידי דיאליזה כפי שתוּאר בעבר כנגד באפר f. לאחר דיאליזה למשך לילה.השתמש בצנטריפוגת שולחנית כדי לרכז את דגימת החלבון באמצעות מרכז צנטריפוגי בעל סף משקל מולקולרי של 10,000. רכז את החלבון לריכוז של שמונה מיליגרם למיליליטר במהירות של 4,000 RPM. אמת את הריכוז הרצוי על ידי מדידת ה-OD באורך גל של 280 ננומטר בקוורץ קובטה.התקן את עמודת הפרדת הגודל הממולאת מראש מסוג high load 26 60 superdeck 200 על מערכת FPLC ACTO purifier. שטוף את העמודה עם שלושה נפחי עמודה (cvs) של מים מסוננים והשג את העמודה עם שלושה נפחי עמודה של באפר F. שטוף את לולאת ההזרקה עם שני נפחי לולאה של DDW ולאחר מכן עם אותו נפח של באפר F. לאחר שביצוע השטיפה וההשגה של מערכת ה-FPLC הסתיימו, טען את דגימת החלבון לתוך לולאת ההזרקה. הזרק את דגימת החלבון והתחל באיסוף פראקציות משיא החלבון כפי שהן מופיעות בכרומטוגרם ב-280 nanometer.הזרים את הבאפר עד להגעה לנפח החלל של העמודה. נקה את העמודה המוכנה מראש בהתאם להמלצת היצרן. בצע אנליזת SDS page של הפראקציות שנאספו והערך את הג'ל.החלבון צריך להופיע במשקל המולקולרי החזוי הנכון בהתאם לסמן החלבון (protein marker), ורק פס אחד צריך להיות נראה. יש למזג את פראקציות החלבון הטהור ולרכז את דגימת החלבון לריכוז הגבוה מ-20 milligrams per milliliter באמצעות מרכז צנטריפוגלי עם סף הפרדה של 10,000 molecular weight cutoff וצנטריפוגת שולחנית. יש לאמת את הריכוז הרצוי על ידי מדידת ה-OD ב-280 nanometers.יש לאשר את טוהר וזהות דגימת ה-MAME delta 41 באמצעות MALDI-TOF. לבסוף, חלק את חלבון ה-MAME delta 41 המרוכז והמנוקה לשפופרות Eppendorf מסומנות מראש, בנפח של 25 עד 50 µL לכל אחת. ניתן להקפיא את הדגימה בהקפאה מהירה (flash freeze) בחנקן נוזלי ולאחסנה בטמפרטורה של 193 K. פרוטוקול זה אמור להניב דגימת חלבון MAME Delta 41 מרוכזת, הומוגנית בגודלה ובדרגת טוהר גבוהה. ניתוח SDS-PAGE של פרופיל האלוציה מ-nickel NTA מעיד על רמות גבוהות של חלבון memay delta 41 10 hiss בפרקציות האלוציה במשקל מולקולרי של כ-22 kDa.ניתוח ה-SDS page יחשוף גם אם קיים חלבון memay delta 41 בזרימה החופשית של החלבון שלא נקשר בשטיפה, בזרימה החופשית ובמדגם של המשקע מהאולטרה-צנטריפוגציה. אם מופיעות דגימות של פסים רחבים סביב 22 kilodaltons במדגמים אלו, יש לבצע פתרון בעיות. כרומטוגרפיית חילוף יונים מבוצעת כדי להפריד את חלבון ה-MAME Delta 41 מחלבונים אחרים במדגם באמצעות חילוף יונים.תחת ריכוזים עולים של נתרן כלוריד, כרומטוגרמת חילוף היונים חושפת הפרדה טובה בין שתי אוכלוסיות של חלבונים. ניתוח ריכוז הדגימות באמצעות SDS page חושף את המשקל המולקולרי של כל אוכלוסייה. הפסגה הראשונה היא MAME delta 41, בעוד הפסגה השנייה היא חלבון MAME delta 41 10 hiss שלא נחתך על ידי bovine thrombin.אם כרומטוגרפיית חלף יונים אינה מביאה לפיקים של חלבונים המופרדים באופן מלא, יש לבדוק את הכנת התמיסות (buffers) ואת השיפוע של מדרגת הנתרן כלוריד. השלב הסופי של ניקוי ה-MAME delta 41 הוא כרומטוגרפיית הדרגה לפי גודל (size exclusion chromatography). הכרומטוגרמה מראה פיק בודד הנשטף ב-20 kilodaltons.ניתוח MALDI של חלבון MAME Delta 41 בוצע כדי לאמת את טוהר חלבון MAME delta 41 המנוקה. ניתוח זה חושף שני מינים, האחד מייצג את החלבון בעל מטען יחיד ב-20,347 Daltons והשני מייצג את החלבון בעל מטען כפול ב-10,176 Daltons. המשקל המולקולרי החזוי עבור חלבון mam MA delta 41 רקומביננטי לאחר הסרת ה-hist tag הוא 20,597 Daltons.ההפרש הקטן של 250 Dalton עשוי לנבוע מהדגרדציה נפוצה של המתיונין הראשון בגליצין השני. התוצאות מעידות על חלבון MAME delta 41 מטוהר מאוד. ניתן להשתמש בו לניסויים נוספים.הרגע הדגמנו כיצד לטהר חלבון recombinant syllable. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתאים את הבאפרים לחלבונים הייחודיים שלכם ולבצע ניסויים אלו במהירות המרבית. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מסביר דרך לטהר תאי B על ידי מיקוד אימונומגנטי והפרדה מהשעיית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. השיטה כוללת סימון סוגי תאים לא רצויים עם נוגדנים או ליגנדים ספציפיים (הקשורים לחלקיקים מגנטיים) המכוונים לחלבונים ספציפיים על פני התא, כדי להתרוקן מתרחיף התא ההטרוגני על ידי הפרדה מגנטית.

ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

בסרטון זה אנו מדגימים הליך לבידוד אקסוזומים מנוזלי מטרה באמצעות מיקרו-כדוריות מגנטיות. ההליך מאפשר לכידה מהירה של אקסוזומים, אשר יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם.

מיצוי אקסוזום מגנטי מבוסס חרוזים: טכניקה לבידוד אקסוזומים ספציפיים מנוזלים ביולוגיים

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

אנחנו מדגימים את שיטה לאיסוף חיידקי magnetotactic (MTB) שניתן להחיל על מים הטבעיים. MTB יכול להיות מבודד ומועשר מדגימות משקעות באמצעות התקנה פשוטה יחסית שמנצלת את המגנטיות הטבעית של החיידקים. המבודד MTB אז ניתן לבחון בפירוט שימוש באור ומיקרוסקופ אלקטרונים.

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

אקסוזומים הם מבנים מיקרו-שלפוחיתיים הנמצאים בתוך נוזלים ביולוגיים שעלולים לשאת סמנים ביולוגיים חשובים להבחנה בין מחלות. כאן, נעשה שימוש בשיטה חדשה כדי לחלץ אקסוזומים באופן ספציפי ולבדוק במהירות את המטען האקסוזומי עבור מטרות RNA/חלבון לאחר שיבוש האקסוזומים באמצעות גלים מרובעים חשמליים מחזוריים לא אחידים.

איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

מוצג פרוטוקול לסינתזה וקטיונים של מגנטופריטין מסומם בקובלט, כמו גם שיטה למגנט במהירות תאי גזע עם מגנטופריטין קטיוני.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיון מבוססת חרוזים מגנטיים המשתמשת בנוגדני ציטומטריית זרימה המסומנים על ידי פיקואריתרין (PE) ומיקרו-חרוזי אנטי-PE, לבידוד תת-אוכלוסיות תאי גזע מזנכימליות ספציפיות עם חיוביות גבוהה לסמן מטרה לאחר מיון ושימור פעילות מטבולית מבוססת CCK-8 בתנאים שנבדקו, ללא צורך במיוני תאים יקרים או חרוזים מותאמים ספציפיים למטרה.

בידוד ואימות תת-אוכלוסיות תאי גזע מזנכימליים חיוביים לפודופלנין באמצעות אסטרטגיית חרוז מגנטי עקיפה

למדו את פרוטוקול טיהור החלבון MamAΔ41 מ-Magnetospirillum magneticum באמצעות כרומטוגרפיית אפיניות ויון. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני ופונקציונלי של חלבוני מגנטוזום.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

גלה סרטונים נוספים