טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

תהליך הטיהור מתחיל עם משקעי תאים המבטאים את החלבון הרקומיננטי Mame. Delta 41. לאחר הפרעת ממברנת התאים, מבוצעת הפרדה בין הפракציה המסיסה לפракציה הבלתי מסיסה. כדי למצות את החלבון הרקומיננטי המסיס, כרומטוגרפיית זיקה מפרידה את החלבון הרקומיננטי המסומן מחלבונים תאיים אחרים.

כרומטוגרפיית חילוף יונים מפרידה את mamma Delta 41 מחלבונים תאיים אחרים שנותרו לאחר כרומטוגרפיית זיקה והפרדה לפי גודל. כרומטוגרפיה נוספת מפרידה עוד יותר את mamma Delta 41 וחושפת את המצב האוליגומרי שלה. לבסוף, ננתחות רמת הטוהר וההומוגניות של החלבון הרקומביננטי.

שלום, אני רזה, ראש מעבדת XVA במחלקה למדעי החיים באוניברסיטת Benon of the Negative. אני נטלי, גם אני ממעבדת Z. היום נדגים לכם פרוטוקול לטיהור חלבון רקומביננטי.

אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור חלבונים הקשורים למגנטיות. אז בואו נתחיל. בתחילת פרוטוקול זה, חלבון ה-MAME Delta 41 מבוטא כחלבון היתוך 10 hiss.

בתוך תאי e coli מסוג BL 21, גדלו את התאים במצע אינדוקציה אוטומטית המכיל Epi Brazilin בטמפרטורה של 310 K למשך שלוש שעות. לאחר מכן, העבירו את טמפרטורת הגידול ל-300 K והניחו לתאים לדגירה במשך 48 שעות. לאחר הדגירה, קצרו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, שפכו את הנוזל העליון ושקלו את משקע התאים שהתקבל.

שמונה ליטרים של תרבית אמורים להניב כ-60 גרם של משקע תאים רטוב. לפני טהרת החלבון, הכין תמיסות מלאי של 200 מיליליטר של ile בריכוז ארבעה מולר, נתרן כלוריד בריכוז חמישה מולר, ו-tris H-C-L-P-H שמונה בריכוז מולר אחד.

השתמש במים מזוקקים פעמיים או DDW כדי לערבב את התמיסות ב-vortex עד להגעה למראה צלול, וסנן אותן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. סנן את תמיסות המקור שהוכנו טריים ואת באפרים A עד F כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. כדי להתחיל בטיהור החלבון, השהה מחדש את התאים בבאפר A ביחס של 1 ל-2 בין מסת התאים לנפח הבאפר.

עבור כל 10 גרם של חיידקים, הוסף 10 µL של dna, one כדי לעכל מקטעי DNA בדגימה. לאחר מכן הוסף 1 mL של E dt, תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail). עבור כל 20 גרם של חיידקים, הדגר את התמיסה במשך 20 דקות על קרח.

לאחר הדגירה, יש לבלוע את התאים באמצעות שני מחזורים של French press בלחץ של 25,000 PSI. בשל עליית הטמפרטורה, יש לקרר את הבוכנה על קרח למשך 10 דקות לפני השימוש. העבר את התאים הבלועים למבחנות אולטרסנטריפוגה של 25 milliliter.

מלאו את המבחנות עד לקו הצוואר בבופר A ואזנו אותן במדויק. לאחר מכן, הפרידו את שיירי התאים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. במקביל, הרכיבו עמודת כבידה של nickel NTA על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של שרף nickel NTA לעמודת זכוכית של 2.5 סנטימטר.

הכינו את השרף לטיהור חלבונים בהתאם להוראות היצרן וה-S. לאחר צנטריפוגת הדגימות, שפכו את הפראקציה המסיסה ממבחנות האולטרה-צנטריפוגה אל עמודת הניקל NTA. אספו את החלבונים שאינם קשורים בפראקציית השטיפה (flow through).

המשיכו לשטוף את העמודה עם 100 milliliters של בופר B ואספו את התסנן (flow through). שמרו את פракציוני התסנן בטמפרטורה של 277 K. בצעו אלוציה של החלבון לתוך 15 מבחנות אינור (einor) ממוספרות בנפח של 1.5 milliliter כל אחת. סגרו את שסתום העמודה והעמיסו 1 milliliter של בופר C על העמודה.

לאחר זמן דגירה של שלוש דקות, פתחו את השסתום ואספו את התוצר הזורם. חזרו על שלב זה שלוש פעמים. המשיכו באלוציה של החלבון במרווחים של 1 mL בופר ללא דגירה של שלוש דקות.

באמצעות ספקטרופוטומטר UV, אתרו את שיא החלבון בפרקציות על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-280 ננומטרים. לבסוף, בצעו אנליזת SDS PAGE של הפרקציות שנאספו. החלבון שאינו קשור יעבור דרך השטיפה, ה-flow through ודגימת משקע מעלtrasentrifugation מהג'ל.

קבעו אילו פראקציות שנשטפו מכילות רמות חלבון גבוהות ומזגו את הפראקציות שנבחרו. כדי להסיר את תג ה-10 hiss, הוסיפו 10 µL של thrombin בקר לכל mg של חלבון לדגימה המאוחדת. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לדגימה מול buffer D כדי להסיר את עודפי ה-in midol ולהפחית את ריכוז ה-sodium chloride.

כהכנה לכרומטוגרפיה של חילוף יונים, גזרו את האורך הרצוי של צינור דיאליזה עם סף חיתוך של משקל מולקולרי של שבעה kilodalton. שטפו את הצינור ב-DDW וצרו שקיק על ידי קשירת קשר בקצה אחד. העבירו את תמיסת החלבון שעברה עיכול על ידי thrombin אל השקיק, והשאירו מרווח בחלקו העליון. סגרו את צינור הדיאליזה באמצעות תפסים.

טבלו את צינור הדיאליזה בתוך ארבעה ליטרים של באפר D מקורר. ערבבו את התמיסה באיטיות למשך לילה בטמפרטורה של 277 K. לאחר דיאליזה של לילה, הוציאו את הצינור מהכלי. בצעו חתך קטן והעבירו את החלבון לשפופרת Falcon של 50 מיליליטר. כרומטוגרפיית חילוף יונים משמשת לניקוי נוסף של חלבון memay Delta 41. חברו עמודת mono Q4 0.6 100 PE ארוזה מראש למערכת FPLC ACTA purifier.

שטפו את העמודה בחמישה נפחי עמודה (CVs) של DDW מסונן והשילו את העמודה בחמישה נפחי עמודה של בופר D. שטפו את לולאת ההזרקה בשני נפחי לולאה של DDW ולאחר מכן בשני נפחי לולאה של בופר D. טענו את החלבון לתוך לולאת ההזרקה. הזריקו את דגימת החלבון בקצב זרימה של 1 mL לדקה והתחילו באיסוף פרקציות, אשר ישמשו לזיהוי חלבונים לא קשורים באמצעות SDS page.

המשיכו להטעין ולהזריק את החלבון עד להטעה מלאה של הדגימה בעמודה. שטפו את העמודה בשלושה נפחי עמודה (cvs) של בופר D. כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים, בצעו אלוציה של החלבון במשך 60 דקות בקצב של 1 ml לדקה באמצעות גרדיאנט ליניארי של sodium chloride, המתחיל ב-40 mM ומסתיים ב-2 M. אספו את שיאי החלבון כפי שהם מופיעים בكرומטוגרמה ב-280 nm לאחר הגעה ל-100% בופר E.

נקה את עמודת ה-prepec בהתאם להמלצות היצרן. בצע אנליזת SDS page של פרקציוני ה-FPLC שנאספו, כולל החלבון שלא נקשר (unbound protein) והזרימה דרך שיאו של החלבון (protein peak flow through), באמצעות סממנים צבועים מראש (prestained markers). הערך את פסי החלבון כדי לזהות את הפרקציות המכילות חלבון במשקל המולקולרי החזוי של Mame.

דלתא 41 מרגשים את הפרקציות שנבחרו כהכנה לכרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography). ריכוז הנתרן כלוריד של הדגימות המרוגשות מופחת באמצעות דיאליזה, כפי שתואר בעבר, כנגד באפר f. לאחר דיאליזה לילה שלם.

השתמשו בצנטריפוגת שולחנית כדי לרכז את דגימת החלבון באמצעות מרכז צנטריפוגלי עם סף חיתוך של 10,000 למשקל מולקולרי. רכזו את החלבון לריכוז של 8 mg/mL במהירות של 4,000 RPM. אששו את הריכוז הרצוי על ידי מדידת ה-OD באורך גל של 280 nm בכובית קוורץ.

הרכב את עמודת ה-size exclusion הממולא מראש מדגם high load 26 60 superdeck 200 על מערכת FPLC ACTO purifier. שטוף את העמודה עם שלושה cvs של מים מסוננים והשג את העמודה לשיווי משקל עם שלושה cvs של בופר F. שטוף את לולאת ההזרקה עם שני נפחי לולאה של DDW ולאחר מכן עם אותו נפח של בופר F. לאחר שה-FPLC נשטף והגיע לשיווי משקל, טען את דגימת החלבון לתוך לולאת ההזרקה. הזרק את דגימת החלבון והתחל באיסוף פרקציות של שיא החלבון כפי שהן מופיעות בכרומטוגרמה ב-280 nanometer.

הזרים את התמיסת חיץ עד להגעה לנפח החלל של העמודה. נקה את העמודה הממולאת מראש בהתאם להמלצות היצרן. בצע ניתוח SDS page של הפראקציות שנאספו והערך את הג'ל.

החלבון אמור להופיע במשקל המולקולרי החזוי הנכון בהתאם לסולם המדדים של החלבון, ורק פס אחד אמור להיות נראה. יש למזג את פראקציות החלבון הטהור ולרכז את דגימת החלבון לריכוז הגבוה מ-20 milligrams per milliliter באמצעות מרכז צנטריפוגלי עם cutoff של 10,000 משקל מולקולרי וצנטריפוגה שולחנית. יש לאמת את הריכוז הרצוי על ידי מדידת ה-OD ב-280 nanometers.

יש לאשר את טוהר וזהות הדגימה של MAME delta 41 באמצעות MALDI-TOF. לבסוף, חלק את חלבון ה-MAME delta 41 המרוכז והמטוהר למבחנות Eppendorf מסומנות מראש, בנפח של 25 עד 50 µL לכל אחת. ניתן להקפיא את הדגימה בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ולאחסנה בטמפרטורה של 193 K. פרוטוקול זה אמור להוביל לדגימת חלבון MAME Delta 41 מרוכזת, הומוגנית בגודלה ובעלת רמת טוהר גבוהה. ניתוח SDS-PAGE של פרופיל האלוציה מה-Nickel NTA מעלה רמות גבוהות של חלבון memay delta 41 10 hiss בfrakציות האלוציה במשקל מולקולרי של כ-22 kDa.

ניתוח ה-SDS page יחשוף גם אם קיים חלבון memay delta 41 בזרימה החופשית של החלבון שלא נקשר בשטיפה, בזרימה החופשית ובדגימת המשקע מהאולטרסנטריפוגציה. אם מופיעות דגימות עם פסים רחבים סביב 22 kilodaltons, יש לבצע פתרון בעיות. כרומטוגרפיית חילוף יונים מבוצעת כדי להפריד את חלבון MAME Delta 41 מחלבונים אחרים בדגימה באמצעות חילוף יונים.

תחת ריכוזי נתרן כלורי עולים, כרומטוגרם חילוף היונים מגלה הפרדה טובה בין שתי אוכלוסיות של חלבונים. ניתוח ריכוז של הדגימות באמצעות SDS page חושף את המשקל המולקולרי של כל אוכלוסייה. השיא הראשון הוא MAME delta 41, בעוד שהשיא השני הוא חלבון MAME delta 41 10 hiss שלא עבר ביקוע על ידי bovine thrombin.

אם כרומטוגרפיית חילוף יונים אינה מביאה לפיסוק מלא של שיאי החלבון, יש לבצע בדיקת תקלות להכנת הבאפר ולשיפוע של גרדיאנט הנתרן כלוריד. השלב האחרון של טיהור ה-MAME delta 41 הוא כרומטוגרפיית סלקציית גודל. הכרומטוגרמה מגלה שיא בודד שיוצא ב-20 kilodaltons.

ניתוח MALDI של חלבון MAME Delta 41 בוצע כדי לאמת את גודל המונומר המתאים של חלבון MAME delta 41 המומה. ניתוח זה חושף שני מינים, אחד המייצג את החלבון בעל מטען יחיד ב-20,347 Daltons והשני המייצג את החלבון בעל מטען כפול ב-10,176 Daltons. המשקל המולקולרי החזוי עבור חלבון recombinant mam MA delta 41 לאחר הסרת ה-hist tag הוא 20,597 Daltons.

ההבדל הקטן של 250 Dalton עשוי לנבוע מהדגרדציה נפוצה של המתיונין הראשון בגליצין השני. התוצאות חושפות חלבון MAME delta 41 מטהר מאוד. ניתן להשתמש בו לניסויים נוספים.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר חלבון recombinant syllable. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתאים את הבאפרים לחלבונים הייחודיים שלכם ולבצע את הניסויים הללו במהירות האפשרית. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.