Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה
8 במרץ 2010
Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.
אקספלאנטים (Explants) של חוט השדרה הגבי מבודלים מעוברים של חולדה ומגודלים בג'ל קולגן תלת-ממדי אל מול תאים המבטאים מולקולת איתות מועמדת. היכולת של מולקולת האיתות להכווין מחדש אקסונים הגדלים בתוך אקספלאנט חוט השדרה הגבי מוערכת באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
שלום, אני וירג'יניה הייזן מהמעבדה של סמנת'ה באטלר במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת דרום קליפורניה. אני קית' פאן, גם אני מהמעבדה של באטלר. ואני קן יא מיי מהמעבדה של באטלר.
היום נדגים לכם פרוצדורה לתרבית של שתלים של חוט השדרה הגבי ואגרגטים של תאי cost שעברו טרנספקציה במטריצת קולגן. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לבחון את יכולתם של מולקולות מועמדות להכווין נוירונים של חוט השדרה. בניסוי זה נבחן את היכולת של Bone Morphogenetic Protein, או BMP 7, לשמש כחומר דוחה כימית (chemo repellent).
נתחיל בתהליך. הכינו אגרגטים של תאי co המשמשים לאתגור מסלול הצמיחה של אקסונים של תאי comm מתוך תאי co. תאים אלו עברו טרנספקציה עם פלסמיד ביטוי עבור המולקולה הרלוונטית במקרה זה, bone morphogenetic protein או BMP 7.
שאבו את המצע מהצלחת ושטפו את התאים ב-1 mL של 1X PBS. הסירו את ה-PBS וטפלו בתאים ב-0.5 mL של מצע לפירוק תאים נטול אנזימים למשך 15 דקות. עצרו את התגובה על ידי הוספת 1 mL של מצע עם סרום עגל עוברי (fetal bovine serum).
באמצעות טיפ של פיפט של 1000 µL, גרדו את התאים עד שלא יישארו תאים על פני כלי התרבית. העבירו את התאים למבחנה קונית של 15 mL וצנטריפוגו את התאים למשך שתי דקות. ב-2000 RPM, הסירו את העלייה (supernatant) ובצעו פיפוט למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש.
ב-100 מיקרוליטר של מצע, טפטפו מספר טיפות של 20 מיקרוליטר של תמיסת התאים על הצד הפנימי של מכסה של צלחת תרבית בקוטר 35 מילימטר. סגרו את המכסה על הצלחת והניחו באינקובטור למשך מספר שעות כדי לאפשר לתאים להתרכז. להכנת שתלי חוט שדרה גבי (dorsal spinal cord), שמרו אותם כרכיבים שהופקו טריים.
עוברים של חולדות בשלב E 11 על קרח. בתוך תווך L 15, בעזרת מחט טונגסטן מחודדת, הסר מקטע של ארבעה עד שישה סגמנטים של מייט (mite) מאזור הגו, מיד מתחת לנבט הגפה הקדמית של כל עובר. בעזרת פיפטה מפלסטיק, אסוף את הרקמה לאחת מארבע בארות.
הנח את הצלחת על קרח. כאשר כל המקטעים חולקו, השתמש בפיפטה להעברת החלקים לבאר שנייה בצלחת המכילה מצע L 15 בתוספת משחת דיסק. דגור את הרקמה בטמפרטורת החדר למשך לא יותר מחמש דקות.
כדי למנוע מוות של תאים, אין לעיקר את הרקמה יתר על המידה. הוסף 1 mL של מצע L 15 טרי עם 5% סרום עיזים שעבר אינאקטיבציה בחום לבאר השלישית של הצלחת. העבר את חלקי הרקמה לבאר זו.
בסיום האינקובציה במרחב הדיס, יש להניח לרקמה לנוח על קרח למשך שעה. כדי להקל על הניתוח העוקב במבחנה של מיקרו-צנטריפוגה, יש להוסיף 40 µL של 10 x minimal essential medium ל-360 µL של קולגן. יש לערבב קצרה בעזרת וורטקס ולסובב בצנטריפוגה קטנה (pico fuge) להורדת המשקע.
התמיסה תהיה צהובה ויש לשמור אותה על קרח ככל האפשר כדי למנוע מהקולגן להתגבש; עבור כל מנה של קולגן, בצעו טיטרציה עם sodium bicarbonate בריכוז 0.8 molar עד שהתמיסת הקולגן תהפוך למעט כתום. ערבבו את התמיסה לאחר כל הוספה. כאשר תמיסת הקולגן תהיה בצבע זה, היא תישאר נוזלית אם תישמר על קרח, אך תהיה מוכנה להתגבש כאשר תובא לטמפרטורת החדר. אם התמיסה הופכת לוורודה לאחר הערבוב, התחילו מחדש עם מבחנה טרייה של קולגן. טפטפו 20 µL של קולגן לכל באער בצלחת נקייה בעלת ארבעה באערים.
באמצעות קצה הפ pipette, פזרו את הקולגן ליצירת רפידה קטנה. הניחו לקולגן להת굳ב בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו במחט טונגסטן שחודדה זה עתה ובפינצטה עדינה כדי להסיר באמצעות מחט הטונגסטן את המזודרם המקיף את חוט השדרה מעובר אחד, והסִירו את החלק הוונטרלי של חוט השדרה, שניתן להבחינו בנוכחות של ה-floor plate.
בפינה הוונטרלית ביותר, ה-floor plate עבה מעט יותר מה-roof plate בפינה הדורסלית. בדוגמה זו, חוט השדרה מונח כשהצד הוונטרלי פונה כלפי מטה. חתכו את הרקמה בזהירות במקביל ל-floor plate והסירו את החמישית הוונטרלית של חוט השדרה.
השתמש במחט כדי לחצות את ה-dorsal spinal cord explan באופן אנכי. ודא שהקצוות נחתכים בצורה נקייה ככל האפשר וגזים שוב במידת הצורך. השתמש בפיפט פה המצויד בצינור קפילרי מזכוכית בקוטר 0.5 millimeter כדי להעביר כל x explan למצע קולגן נפרד.
בעזרת מחט טונגסטן, חתכו את הצבר של תאי ה-co שעברו טרנספקציה לריבועים ברוחב דומה בקירוב לקצה הלטרלי של חוט השדרה הגבי.Explan. השתמשו בפיפטה פה כדי להעביר את אחד הריבועים אל פד הקולגן עם ה-x explan. השתמשו בפיפטת הפה כדי לשאוב נוזלים עודפים.
אין לשאוב יותר מדי, שכן כמות קטנה של נוזל תסייע בהנחה העוקבת של הקולגן; טפטפו 4 µL של קולגן מוכן על הפד. השתמשו במחט טונגסטן כדי להזיז את הקולגן מעל השתלים מבלי לגעת ברקמה באופן ישיר. על ידי הזזת המחט בתוך הקולגן, כוונותו כל x explan כך שצביר תאי ה-co יהיה סמוך לשולו הלטראלי שלו.
השאירו את הקולגן להת굳ד במשך 15 עד 20 דקות. חזרו על תהליך היישום עם ארבעה מיקרוליטרים נוספים של קולגן כדי להבטיח שה-x explan עטוף לחלוטין בקולגן לפני המעבר לעובר הבא במכסה של תרבית רקמות ב-0.5 מיליליטר של מצע ותרביתו במשך 30 עד 40 שעות באינקובטור. במנדף כימיים, קבעו את האקספלנטים באמצעות 0.5 מיליליטר של תמיסת 4%Para formaldehyde ב-PBS למשך 45 דקות. תוך שמירת הרקמה על קרח, שטפו פעמיים עם 0.5 מיליליטר של תמיסת החסימה והחדירה PBTN.
דגרו את האקספלנטים בתמיסת חסימה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, רצוי למשך לילה. השתמשו בפינצטה כדי להוציא את האקספלנטים מלוחית הבארות והניחו כל אחד מהם בבאר אחת בצלחת של 48 בארות.
הוסיפו 200 µL של נוגדן ראשוני לכל באער. כדי להדגים axonal projections של תאי כוראליים, השתמשו בנוגדן mouse anti ttag, וכדי לקבוע האם הטרנספקציה של תאי הצלב הצליחה, הוסיפו נוגדן נגד המולקולה הנבדקת. דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.
שטפו כל דגימה בתמיסת חסימה PBTN חמש פעמים, למשך שעה בכל שטיפה, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו את ה-PBTN והוסיפו 200 microliters של נוגדן משני לכל באר. כסו את הלוח בנייר אלומיניום למניעת הבהרה והדגירו למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
שטוף את הדגימות חמש פעמים ב-PBTN כפי שבוצע קודם לכן. העבר כל explan לפסיידה עם שלושה שקעים. הסר נוזל עודף, הוסף מדיום invecta shield לקיבוע וכסה בכיסוי זכוכית.
יש לאחסן את הנסכיות בתיקייה או בקופסה מוגנת מאור בטמפרטורה של 4°C או 20°C- עד לרגע התצפית במיקרוסקופ. כעת נציג מספר תמונות מייצגות של רקמות מושתלות (explants) של x לאחר שגודלו בתרבית, קובעו, נצבעו ודוּממו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פאנל A מראה כי רקמה מושתלת של roof plate (מסומנת בקו לבן) יכולה להסיט את אקסוני ה-choral החיוביים ל-tag one הרחק ממנה, מה שמוכיח כי ה-roof plate הוא המקור לחומר דוחה כימיה של אקסונים. פאנל B מראה כי תאי co המפרישים את מולקולת האיתות M tact, חלבון BMP 7 (bone morphogenetic protein), יכולים לדחות אקסוני carceral באופן דומה ל-roof plate.
לתאי בקרה המפרישים רק את פלסמיד הביטוי אין השפעה על כיוון הצמיחה של האקסונים. כעת הצגנו כיצד לבצע דיסקציה, להכווין ולגדל רסס (explant) של חוט השדרה ולגרום לצמיחת אגרגטים של תאים, כדי לאפשר לך לקבוע אם למולקולה מסמנת מועמדת יש פעילות להכוונת מחדש של אקסונים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על הקולגן בקרח ככל האפשר, ולעטוף את הרסס במלואו בקולגן כך שלא יבוא במגע ישיר עם מצע הגדילה.
ולבסוף, תבצעו תרבית רק למשך הזמן הדרוש לאקסונים כדי להתרחב עד לקצה הוונטרלי של ה-x explan. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקה זו מעריכה את תפקידו של Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7) בהכוון מחדש של אקסונים קומיסוראליים. תרבישי רקמה (explants) של חוט השדרה הגבי העוברי גודלים לצד אגרגטים של תאי COS המפרישים BMP7, מה שמאפשר ויזואליזציה של ההכוון מחדש של האקסונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אותיות תאיות
רקע
- אקסונים קומיסוראליים (Commissural axons) ממלאים תפקיד מכריע בקישוריות העצבית.
- מולקולות איתות יכולות להשפיע על צמיחת האקסונים ועל כיווניותם.
- חלבונים מורפוגנטיים של העצם (BMPs) ידועים כמשפיעים על התפתחות נוירונלית.
- הבנת מנגנוני ההכוונה של האקסונים חיונית לאסטרטגיות לשיקום עצבי.
מטרת המחקר
- להעריך את היכולת של BMP7 להכווין מחדש את האקסונים הקומיסוריאליים.
- לבחון את ההשפעות של מולקולות סיגנלינג על צמיחת אקסונים.
- להשתמש באימונוהיסטוכימיה להדמיה של כיוון האקסונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- דיסקציה של נטיפות (explants) מהחלק הגבי של חוט השדרה מעוברים של חולדה.
- תרבית של נטיפות בג'ל קולגן תלת-ממדי.
- תרבית משותפת עם תאי COS המבטאים BMP7.
- הדמיית אקסונים באמצעות טכניקות של אימונוהיסטוכימיה.
תוצאות עיקריות
- BMP7 משנה באופן משמעותי את הכיוון של אקסונים קומיסוראליים בתרבית.
- אימונוהיסטוכימיה מאשרת את כיווניות הצמיחה האקסונית.
- הממצאים מרמזים על תפקידו הפוטנציאלי של BMP7 בהתפתחות העצבית.
- המחקר מספק תובנות לגבי מנגנוני הדרכת אקסונים.
מסקנות
- BMP7 יעיל בהשפעה על הכיוון האקסונלי.
- התוצאות תורמות להבנה של נתיבי העברת אותות עצביים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים טיפוליים של BMP7.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מספקת מודל כמותי, in vitro, להערכת מולקולות איתות דיפוזביליות על סמך יכולתן להכווין מחדש אקסונים קומיסוראליים של חוט השדרה העוברית, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות במסלולים של התפתחות נוירולוגית. על ידי מדידת הכוון מחדש של האקסונים בתגובה למקורות איתות אקטופיים, השיטה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מולקולות הנחיה מועמדות לפני מחקרים in vivo. גישה זו תומכת בהחלטות גילוי מוקדמות באמצעות ביסוס המספיקות והנחיצות של אותות בבקרה על מסלול האקסון, ובכך מסייעת בתעדוף תיקי פיתוח לזיהוי מטרות לטיפול נוירולוגי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי בדיקה האם מולקולת איתות מספיקה כדי לשנות את מסלול האקסון.
- ערך מדעי: מעריך את נחוצותו של אות להנחיה תקינה של אקסונים קומיסורליים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים במטרות הטיפוליות.
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מולקולות הנחיית אקסונים כגון BMP7, Netrin1 ו-Shh במערכת של השתלה של חוט השדרה הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך תפעולי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות (השתמרות של חוט השדרה הגבי בג'ל קולגן) לסריקה סטנדרטית של תרכובות או מולקולות.
- ערך תפעולי: הפקת קריאות כמותיות של התמצאות מחדש של אקסונים המאפשרות הדירות ושביליות של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לבדיקה של מספר מולקולות איתות מועמדות בסביבה מיקרוסקופית עקבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: משתמש בתרביות רקמה (explants) של חוט שדרה עוברי של חולדה המשחזרות את תזמון מסלול האקסונים in vivo, ובכך משפר את הרלוונטיות הפרה-קלינית.
- ערך תרגומי: מקשר בין פעילות מולקולרית לפנוטיפ אקסונלי, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים במודלים של מחלות התפתחותיות נוירולוגיות.
- ערך תרגומי: מסייע בקבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכון, על ידי אישור אם מולקולה מכוונת צמיחת אקסונים לפני ביצוע תיקוף in vivo הדורש משאבים רבים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספקת נתונים פונקציונליים על הנחיית אקסונים המשמשים לקבלת החלטות של go/no-go להמשך הפיתוח של מטרות נוירולוגיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מולקולות סיגנלינג בדחייה או במשיכה של אקסונים, ומבהיר את תפקודי המסלולים בהכוונת אקסונים קומיסוראליים.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות של אוריינטציית אקסונים המבוססות על אימונוהיסטוכימיה, המאפשרות השוואה בין תנאי ניסוי שונים.
- אנליטיקה: מספק נתונים מרחביים של מסלולי אקסונים המסייעים לצוותים להעריך את העוצמה והספציפיות המולקולרית במבחני ארגון מחדש.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים של הכוונת אקסונים in vitro לבין נוירוביולוגיה התפתחותית, ובכך תומך בהמשכיות למודלים פרה-קליניים של קישוריות עצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של גורמים דיפוזביליים בהכוונת אקסונים, ובכך מפחית פיתוח כפול של מבחנים בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי אישור פעילות של הת yönת axonal (reorientation) על ידי אותות דיפוזיביים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות הכנה מוגדרת של השתלה (explant), הטמעה בקולגן, ותרבית משותפת עם תאים המבטאים מולקולות איתות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי סינון מוקדם של מולקולות הדרכה לא יעילות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות של מטרות נוירולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות להדרכת אקסונים המותאם לסיכון, בהתבסס על ראיות פונקציונליות להכוון מחדש.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביצוע דיסקציה של רקמה עוברית, הכנת ג'ל קולגן וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- תלוי בתשתית סטרילית לתרביות רקמה, במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובכלי ניתוח תמונה למעקב אחר אקסונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הדיסקציה, התרבית והדימיג' כדי להבטיח אוריינטציה עקבית של האקספלאנט ואנקפסולציה אחידה בקולגן.
- דורש שיקולי התאמה בעת בדיקת מולקולות סיגנלינג במערכות אקספלאנט של מודלים למחלות או בבעלי חיים שאינם מכרסמים.
- מגבלה מעשית: משך הבדיקה מוגבל לחלון הזמן של צמיחת האקסונים (30–40 שעות), מה שמגביל את הערכת ההשפעות של סיגנלינג כרוני או מושהה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:28
Introduction
1:14
Preparation of Aggregates of Transfected COS Cells Using Hanging Drops
4:31
Dissection of Dorsal Spinal Cord Explants and Positioning with COS Cell Aggregates in Collagen Matrix
2:20
Preparation of Dorsal Spinal Cord Explants
3:31
Priming Collagen
6:51
Visualization of Commissural Axons By Immunohistochemistry
8:03
Representative Images of Explants
8:41
Conclusion
