Name: אופטימליים הפיברין גל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: חקור את שיטת מבחן חרוזי הפיברין לחקר אנגיוגנזה באמצעות תאי אנדותל מצופים ותמונות time-lapse. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על תהליכי היווצרות כלי דם ודינמיקתם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הכנות CELLS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את HUVEC ו fibroblasts ב% M199/10 FBS / עט סטרפטוקוקוס (1:100) 1-2 ימים לפני ואגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עד EGM-2 (Clonetics) יום לפני ואגלי עבור HUVEC ויום לפני הטבעה עבור fibroblasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז של ~ 400 HUVEC לכל חרוז יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20,000 fibroblasts היטב לכל צורך. </li></ol> ציפוי החרוזים עם HUVEC - -1 יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize HUVEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להסתפק חרוזים (אינם צנטריפוגות!). לשאוב supernatant ולשטוף את החרוזים בקצרה 1 מ&quot;ל של מדיום EGM-2 חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2500 חרוזים Mix w / 1x10 6 HUVEC ב 1.5 מ&quot;ל של מדיום EGM-2 חם צינור FACS. המקום אותו במאונך בחממה. (זה יהיה מספיק ~ 10 בארות. הסולם במידת הצורך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 4 שעות ב 37 ° C, מטלטלת את הצינור כל 20 דקות. (ציפוי טוב הוא קריטי עבור נביטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להעביר את החרוזים מצופים על בקבוק T25 ב 5 מ&quot;ל של EGM-2 ו לעזוב O / נ </li></ol> הטבעה חרוזי מצופה הפיברין GEL - יום: 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​2.0 פיברינוגן (ראה סעיף מתכון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.15 יחידות / מ&quot;ל ​​של aprotinin לפתרון פיברינוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חרוזים מצופים אל צינור חרוטי 15ml ולתת חרוזים להתיישב. חרוזים Resuspend ב 1mL של EGM-2 ו להעביר צינור צנטריפוגות 1.5mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 3X עם 1mL של EGM-2 על ידי pipeting לאט מלמעלה למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת חרוזים על coverslip ו resuspend בפתרון פיברינוגן בריכוז של ~ 500 חרוזים / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.625 יחידות / מ&quot;ל ​​של תרומבין היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של פיברינוגן השעיה / חרוז היטב בכל צלחת 24 באר. שנה את קצה פיפטה עבור כל טוב! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תרומבין ואת פיברינוגן על ידי עולה ויורדת בעדינות עם קצה פיפטה ~ 4 עד 5 פעמים. תיזהר לא לעשות בועות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את צלחת 5 דקות בשכונה, ואז למקם אותו על 37 ° C-חממה 10-15 דקות כדי ליצור קריש דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה הקריש, trypsinize fibroblasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של EGM-2 לכל גם טיפה חכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים fibroblasts על גבי הפיברין ג&#39;ל בריכוז של 20,000 תאים לכל טוב. </li></ol> הערות: בדרך כלל, כאשר קריש הפיברין נוצר, תראה בועות קטנטנות בתוך הג&#39;ל. אל תדאג, הם ייעלמו בתוך 3-4 ימים. שנה את התקשורת בכל יום אחר, כלומר, יום 2, 4, 6, וכו &#39;.. ביום 3 או 4 אתה צריך להתחיל לראות נביטה.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

קיימת הסכמה גוברת תלת ממדי (3D) ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה להציע מודל אשר הרבה יותר לסביבה מאשר בפועל in vivo יכולה להיות מושגת באמצעות תרבויות 2D. ניכר כי מערכות 3D מעולה צריך להיות לשחזור, ולהיות מסוגלים לחקות כמה שלבים עיקריים של אנגיוגנזה. בעוד מספר מבחני 3D הקודם פותחו, רבים מהם גם להשתמש שקשה להשיג תאים כלי הדם, או לשחזר רק חלק מהשלבים. בסרטון הזה, אנו מתארים ולבצע אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC, אשר להשגה בקלות ואת EC הנפוץ ביותר במחקר וסקולרית. Assay, במשך מספר...

<table><tbody><tr><td>חרוזי Cytodex-3</td><td>ריאגנט</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g לבקבוק. 1.0.5 g של חרוזים יבשים עוברים הידרציה ונפיחות ב-50 mL PBS (pH = 7.4) למשך 3 h לפחות ב-RT. השתמש במבחנה של 50 mL והנח אותה על רוקר (rocker). 2. הנח לחרוזים לשקוע (~ 15 min). השלך את supernatant ושטוף את החרוזים למשך מספר דקות ב-PBS טרי (50 mL). 3. השלך את ה-PBS והחלף ב-PBS טרי: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 beads/mL או 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 beads/ mL. 4. העבר את תרחיף החרוזים לבקבוק זכוכית סיליקוני (Windshield Wiper או Sigmacote). 5. סטרilize את החרוזים באמצעות אוטוקלאב למשך 15 min ב-115&amp;#x00B0;C. 6. אחסן ב-4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg לבקבוק. המס aprotinin ליופילז בריכוז 4 U/mL במים מזוקקים (DI water). סינון סטרילי. הכן אליקוטות של 1 mL כל אחת. אחסן ב- -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen Type I</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. המס 2 mg/mL fibrinogen ב-DPBS. שים לב לאחוז החלבון הניתן לקרישה (clottable protein %) והתאם בהתאם. חמם באמבט מים של 37 &amp;#x00B0;C כדי להמיס את ה-fibrinogen. ערבב על ידי הפיכת המבחנה. אין להשתמש ב-vortex. סינון סטרילי דרך 0.22 um.</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000 units. המס במים סטריליים בריכוז 50 U/mL. הכן אליקוטות של 0.5 mL כל אחת. אחסן ב- -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד assay לחקר אנגיוגנזה

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו, בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה ​​תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, מסתעפת, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי בתוך מבחני לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. בהתבסס על עבודה קודמת על ידי Nehls ו Drenckhahn, יש לנו אופטימיזציה ב assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, חשוב, כלי התצוגה לומן אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. EC הם מצופים על microcarriers cytodex ומוטבעים לתוך ג&#39;ל הפיברין. Fibroblasts הם שכבות על גבי ג&#39;ל שבו הם מספקים גורמים מסיסים הכרחי לקדם EC הנבטה מפני השטח של החרוזים. אחרי כמה ימים, כלי רבים נוכחים כי ניתן בקלות לצפות תחת ניגוד פאזה זמן לשגות מיקרוסקופ. וידאו זה מדגים את השלבים העיקריים בהקמת אלה תרבויות.

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

אנגיוגנזה (יצירת כלי דם) היא תהליך רב-שלבי מורכב, שבו נוצרים כלי דם חדשים מרשת כלי הדם הקיימת כמענה לגירויים אנגיוגניים. אלה...

שלום, שמי Mar Katsu. אני מהמעבדה של Hughes במחלקה לביולוגיה מולקולרית וביוכימיה ב-uc Irvine. אני אבצע את בדיקת חרוזי הפיברין (fibrin bead assay).התהליך כולו נמשך יומיים. היום הראשון כולל ציפוי חרו지를 בתאי עורק טבורי אנושי (human umbilical vein endothelial cells). היום השני כולל הטמעת החרוזים המצופים הללו בתוך ג'לי פיברין, ולאחר מכן הוספת שכבת פיברובלסטים מעל ג'לים אלו.אנו משתמשים במערך זה כדי לחקור את השלבים הרבים של אנגיוגנזה בתנאי in vitro. ביום הראשון, בחלק הראשון, אנו משתמשים ב-CY X three Beads. ולאחר מכן, ביום השני, אנו משתמשים בשלושת הרכיבים הללו: fibrinogen, thrombin ו-aprotinin cytx.חרוזיים שלושה הם מבית Amazon Biosciences והם מצופים בקולגן במיוחד כדי שתאי האנדותל יידבקו לחרוזים. הרכיב הבא הוא פיברינוגן, אותו אנו מקבלים מ-sigma. זהו הרכיב היוצר את הג'ל או את הקריש בפועל בבדיקת החרוזים.טרומבין הוא פקטור קרישה. חלבון זה הופך פיברינוגן לפיברין, וזו הסיבה לכך שאנו מוסיפים אותו לבדיקה. אפרוטינין הוא מעכב פרוטאז מסרום.אנו משתמשים בכך כדי למנוע מפרוטאזות לפרק את ג'ל הפיברין. מה שאתם רואים כאן הם vac. אלו התאים שבהם אנו משתמשים עבור בדיקת ה-beat.תאים ספציפיים אלו נמצאים במעבר (passage) 3. בדרך כלל אנו משתמשים בהם בין מעבר 2 למעבר 3. ניתן לראות שהם קיבלו מורפולוגיה מובחנת של ריצוף (c

optimized-fibrin-gel-bead-assay-for-the-study-of-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת חרוזים מיקרו-נשאים המשלבת פריציטים לחקר הנבטת אנדותל בשלבים המוקדמים של אנגיוגנזה. הבדיקה מספקת מודל ניסויי במבחנה להבנת מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה ואת ההשפעה של טיפולים אנטי-אנגיוגנטיים.

בדיקת הנבטת חרוזים להערכת אנגיוגנזה בשלב מוקדם: מודל מבוסס חרוזים במבחנה לחקר הנבטת אנדותל בנוכחות פריציטים

מיקרוסקופיה וטכניקות לעיבוד תמונה שימשו להתבוננות וניתוח של דחיסת ג'ל בתיווך פיברובלסט וארגון מחדש של סיבי פיברין בביוריאקטור מבוקר לסביבה על פני תקופה של 48 שעות.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

סיכום של המיקרו-סביבה הספציפית לאיבר, המגרה אנגיוגנזה מקומית, הוא הכרחי להתחדשות מוצלחת של רקמות פגועות. דוח זה מדגים שיטה חדשה להשתלת ג'ל פיברין על פני הריאה של עכבר חי על מנת לחקור כיצד המיקרו-סביבה הספציפית לריאה מווסתת אנגיוגנזה והתחדשות המכתשית בעכבר בוגר.

השרשה של הפיברין ג&#39;ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית (SVF) בשילוב עם הידרוג'ל פיברין מציע נשאות קלה ויעילה לתאי סטרומה ברי קיימא שמקורם בשומן עבור אינדיקציות שונות, כולל הנדסת רקמות או מטרות ריפוי פצעים. כאן, אנו מציגים את ההכנה של מבנה מכני SVF (mSVF)-פיברין הידרוג'ל למחקר תרגומי ויישום קליני.

השילוב של מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית והידרוג'ל פיברין: פרוטוקול עיבוד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.

הפרדה מהירה והצגה של חומרים פיברינוגנוליטיים פעילים ב- Sipunculus nudus באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד

חקור את שיטת מבחן חרוזי הפיברין לחקר אנגיוגנזה באמצעות תאי אנדותל מצופים ותמונות time-lapse. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על תהליכי היווצרות כלי דם ודינמיקתם.

אופטימליים הפיברין ג'ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים