זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בחרו וקטור לביטוי של האפקטור הבקטריאלי המבוקש. בשימוש בשמרים ובזן שמרים, הווקטור מותמר לאחר מכן לתאי שמרים. לאחר מכן, מודע ביטוי של האפקטור.

תאים שעברו אינדוקציה עוברים ליזיס לצורך אנליזת western blot להמשך, כדי לאמת את ביטויו של האפקטור. לאחר אישור ביטוי האפקטור, התאים גדלים ודילולים סדרתיים של פי עשרה מוטבחים על מצעים מדכאים ומעודדים. לבסוף, לאחר יומיים עד שלושה, מנותח גדילת השמרים.

שלום, אני דו סולומון מהמעבדה של ד"ר גואידו צ'זה במחלקה למדעי הצמחים באוניברסיטת תל אביב. היום נראה לכם פרוטוקול לזיהוי פנוטיפים של עיכוב גדילה המושרים על ידי ביטוי של אפקטורים בקטריאליים מסוג 3 בשמרים. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקוד של אפקטורים מסוג 3 מחיידקים פתוגניים גרם-שליליים, והוא מהווה כלי המסייע לנו בזיהוי מטרות ה-TIC של האפקטור.

בואו נתחיל. יש לשקול ולבצע אופטימיזציה למספר גורמים חשובים בעת תכנון מערכת שמרים המתאימה לביטוי האפקטורים מסוג 3 הרלוונטיים. הגורם הראשון הוא הפרומוטור המניע את ביטוי האפקטורים.

מכיוון שאפקטורים חיידקיים מסוג 3 עשויים להיות רעילים לתאי שמרים, יש להשתמש במקדם הקידום (promoter) הניתן להשראה כדי לשלוט בביטוי שלהם. בניסוי זה נשתמש במקדם הקידום GAL1. הגורם השני הוא מספר העותקים של הגן המקודד לאפקטור.

רמות ביטוי גבוהות מושגות כאשר הגן האפקטור נישא על ידי פלסמיד two micron. ביטוי בינוני מתקבל על ידי שימוש בפלסמיד המכיל צנטרומר, וביטוי נמוך מושג כאשר הגן האפקטור משולב בגנום השמרים באמצעות רקומבינציה הומולוגית. גורם שלישי שיש לקחת בחשבון הוא תג האפיטופ המשמש לאימות ביטוי החלבון במקרים שבהם אין נוגדנים זמינים נגד האפקטור הרלוונטי.

תגיות נפוצות בשימוש הן M hemagglutinin HA או flag, שעבורן קיימים נוגדנים מסחריים אמינים. אנו מציעים להשתמש בעותק אחד בלבד של התגית כדי למזער השפעות מזיקות בלתי רצויות על המבנה והפעילות של חלבון האפקטור. אחרון חביב, זן השמר שבו ייעשה שימוש לצורך ביטוי חייב להיות תלוי (tropic) למסמן הברירה של וקטור הביטוי.

כדי לגדל תאי שמרים לצורך טרנספורמציה, בחר מושבה של שמרים ממישורה טרייה והזרק אותה לתוך 3 ml של YPD בשפופרת פוליפרופילן של 15 ml, וערבב ב-vortex. מקם בקצרה את שפופרת התרבית בתוך גלגל סיבוב (roller) והדגר למשך לילה ב-30 °C בסיבוב קבוע. למחרת בבוקר, הוצא את התרבית מהגלגל וסבב בצנטריפוגה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגציה, הסירו לחלוטין את העילוי ותלו את התאים ב-1 mL של תמיסת Resus suspension buffer, תוך ערבוב במכשיר vortex במהירות מקסימלית למשך כ-10 שניות. עבור כל פלסמיד המיועד לטרנספורמציה ועבור טרנספורמציית ביקורת נוספת, העבירו 100 µL מתלי התאים למבחנה למיקרוצנטריפוגה. הוסיפו 5 µL של DNA מזרע סלמון גדיל יחיד ו-250 עד 500 ng של DNA פלסמי לכל מבחנה, למעט מבחנת הביקורת.

בשלב הבא, הוסיפו בזהירות 650 µL של תמיסת טרנספורמציה לכל מבחנה וערבבו באמצעות וורטקס. דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות על גלגלת. עם סיום הדגירה, הוסיפו 70 µL של DMSO לכל מבחנה וערבבו על ידי הפיכת המבחנות 10 עד 15 פעמים כדי למנוע את שבירת התאים.

אין לנער את המבחנות במיקסר (vortex). העבירו את המבחנות לאמבט מים שחומם מראש ל-42 °C והדגירו למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הוציאו את המבחנות מאמבט המים והניחו אותן מיד על קרח למשך שתי דקות.

לאחר שהמבחנות התקררו, קצרו את התאים באמצעות סבב (centrifugation), ולאחר מכן השתמשו בפיפט כדי להסיר בזהירות את העלייה (supernatant) הצמיגית. השביו כל משקע (pellet) ב-150 µL של מים זיקוק כפולים סטריליים ופזרו את תרחיף התאים על צלחת עם המצע הסלקטיבי המתאים. השאירו את הצלחות פתוחות למשך שתי דקות ואפשרו להן להתייבש במCב מזרקה למינרית (laminar flow hood).

לאחר מכן, מקמי את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים להצמחת תאי שמרים. להכנת תמצית חלבון, זרעי 3 mL של מצע הדחקה מתאים עם מושבת שמרים מצלחת טרייה וערבבי באמצעות vortex. למחרת, מקמי לזמן קצר את מבחורת התרבית במכשיר סיבוב (roller) בטמפרטורה של 30 °C.

הוציאו את התרבית מהמסובב (roller) וסובבו במרכזפוגה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את העלייה (supernatant) ותלו את משקע התאים. ב-3 milliliters של DDW סטרילי, ערבבו באמצעות וורטקס וסובבו שוב במרכזפוגה, השליכו את העלייה ותלו את התאים ב-3 milliliters של DDW סטרילי. כעת העבירו 200 microliters של תרחיף התאים למבחנה חדשה בנפח 15 milliliter המכילה 3 milliliters של מצע אינדוקציה מתאים, וערבבו באמצעות וורטקס.

הניחו את המבחנה במכשיר סיבוב (roller) והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. בבוקר למחרת, העבירו מיליליטר אחד של התרבית, או כמות גדולה יותר עבור תרביות בצפיפות נמוכה, למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; מהנקודה זו והלאה, עבדו תחת מCהוואיית פקת (fume hood) כדי למנוע שאיפה של אדי Beamer capto ethanol רעילים.

הסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפט וסספנד מחדש את משקע התאים ב-100 microliters של תמיסת ליזיס קרה מאוד. ערבב בעוצמה באמצעות וורטקס והדגר על קרח למשך 30 דקות. במהלך ההדגרה של 30 הדקות, קבע את נפח חומצה כלורית נורמלית שש הדרושה כדי להביא 100 microliters של באפר ליזיס ל-pH שבין תשע לעשר.

כדי לעשות זאת, הוסיפו נפחים שונים של חומצה כלורית ל-100 µL של תמיסת ליזיס (lysis buffer) ב-10 מבחנות שונות, ובדקו את ה-pH של התמיסה באמצעות סרט ביקורת pH בסיום הדגירה בנפח המתאים של חומצה כלורית לליזט וערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת דגימה (sample buffer) בריכוז פי 3 לליזט וערבבו בוורטקס, פנקרו חור במכסה של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בעזרת מחט והרתיחו את תמיסת הליזט על בלוק חימום למשך חמש דקות. לאחר ההרתחה, הניחו לתמיסה להתרכב במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, ערבבו את תמיסת הליסאט במכשיר vortex וסובבו אותה בצנטריפוגה למשך 10 שניות. הליסאט מוכן כעת לניתוח אימונו-דם (immuno blood analysis) כדי להכין את התאים לבדיקת נקודות (spotting assay). גדלו תרביות של 3 מיליליטר מכל זן, כפי שהודגם בעבר, ביום למחרת.

הכינו שתי צלחות המכילות מצע סינתטי מלא (synthetic complete medium) ללא ליוצין. יש להוסיף למצע של צלחת אחת 2%glucose ולמצע של הצלחת השנייה 2%actose ו-1%raffinose. ייבשו את הצלחות במנדף זרימה למינרית סטרילי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

קצרו את התאים ושספלו מחדש כל משקע תאים בשלושה מיליליטר של DDW סטרילי. חזרו על שלב הסרימרגזציה ושספלו את התאים שוב בשלושה מיליליטר של DDW סטרילי. קבעו את הצפיפות האופטית או ה-OD של כל תרבית, ולאחר מכן הכינו סספסיות תאים של מיליליטר אחד עם OD 600 של אחת בתוך מבחנות מיקרופג' סטריליות.

בשלב הבא, הכינו שלוש דילולים סדרתייםים פי עשרה מכל אחת מתרחיפי התאים, באמצעות שלוש מיקרו-מבחנות סטריליות הממולאות ב-900 µL של DDW סטרילי. הניחו את הפלטות היבשות על רשת, ועבור כל תרבית, טפטפו 10 µL מהדילול הרביעי בשורה. לאחר הטפטוף, השאירו את הפלטות פתוחות במבתר למשך מספר דקות.

כאשר הנקודות יבשות, כסו את הצלחות והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים. כעת נציג תוצאות של בדיקת נקודות שמרים (yeast spotting assay) לזיהוי עיכוב בצמיחה. פנוטיפים שהושרו על ידי ביטוי של אפקטורים מסוג 3 (type three effectors) כאן, האפקטורים מסוג 3, AVRpto, HopAA1 ו-AVRre1 של החיידק.

נחמירי של Pseudomonas syringae המדאיים את העגבנייה בוטאו מתוך פלסמיד המכיל צנטרומר במאבקי שמרים על מצע מדכא; מאבקי שמרים הנושאים פלסמיד לביטוי של A-V-R-P-T-O ו-HOP AA1 הראו צמיחה דומה למאבק הבקרה המכיל וקטור ריק. בעוד שמאבקים הנושאים את AVRE1 הראו צמיחה מופחתת מעט, ככל הנראה עקב דליפה של מקדם ה-GAL1 והרעילות התאית הגבוהה של AVRE1, תחת תנאי השראה, ביטוי של AVRE1 או של HOP AA1 גרם לפנוטיפ של עיכוב צמיחה דרסטי, שבא לידי ביטוי בהיעדר מושבות בכל הדילול. לעומת זאת, ביטוי של A-V-R-P-T-O לא הפעיל כל השפעה מעכבת צמיחה.

הראינו לכם כיצד לזהות פנוטיפים של עיכוב גדילה הנגרמים מהבעה של אפקטורים בקטריאליים מסוג 3 בשמרים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבחור בקפידה את וקטור ההבעה וכן את הזן, שכן לשניהם יכולה להיות השפעה דרמטית על התוצאות. בנוסף, זכרו להשתמש במושבות שטרנספורמציה שלהן בוצעה לאחרונה בכל שלבי ההליך.

זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.