Name: תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למד תיוג פלואורסצנטי של חלבונים בזיהוי חי בתאי COS-7 באמצעות מערכת SNAP-tag. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי דינמיקת חלבונים בזמן אמת ללא צורך בשיבוט חוזר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

קאי Johnsson איוון קוראה אנדריאס ברכט קתרין Müentener כריס נורן לואו יום ראשון שו מינג תיאודור דייויס סלווטורה Russello Aihua ג&#39;אנג האינקה גוש אליסה Maunus ניקולס Labarthe ג&#39;יימס מקפרלנד ג&#39;ון באזוול ברנדה דזמונד ג&#39;יימס Ellard דון מסרק

ציפוי CHO-K1 תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50-100μl של CHO-K1 תאים שעברו trypsinized על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להשלים 6ml של ה-F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי תא pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן 300 aliquot μl של השעיה תא trypsinized היטב כל סטרילית 8-קאמרית Lab-Tek II החדרים Coverglass עם # 1.5 בורוסיליקט coverglass לתאי (Nalgene Int Nunc;. Product # 155409; מגרש: 100808-8-0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לילה. </li></ol> Transfection חלוף של CHO-K1 תאים עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התרבות התאים בתאי זרע ביום הקודם לחפש צפיפות התאים ובריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית המספר המתאים של צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף זרימה למינרית, להגדיר תערובות transfection מורכבים על פי תרשים הדוגמה הבא, או באמצעות 0.3 מיקרוגרם pSNAP ADBR2-DNA בקרה פלסמיד או 0.3 מיקרוגרם של ה-DNA pSNAP-H2B בקרה פלסמיד, 1 μl של D2 TransPass ו 1 μl של TransPass V לכל תגובה. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הפלסמיד </td><td> מספר תגובות </td><td> μl של המדיום סרום ללא </td><td> μl של D2 TransPass </td><td> μl של TransPass V </td><td> μl של ה-DNA פלסמיד </td><td> μl של D2/reaction TransPass </td><td> μl של TransPass V / תגובה </td><td> ng של DNA / תגובה </td><td> ה-DNA קונצרט כלשהו. (Ng / μl) </td><td> μl של ה-DNA פלסמיד תגובה / </td></tr><tr><td> Snap-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> ללעוג </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לערבב החופשי בסרום F-12k עם ה-DNA פלסמיד מתאים, ואז מוסיפים את מגיב D2 TransPass transfection, ואז מוסיפים את מגיב V TransPass transfection. מערבבים את המרכיבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים לאחר תוספת של כל מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, רוחצים תאים פעם אחת עם 600 μl של DMEM להשלים ולהוסיף 450 μl של DMEM מלאה מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של התערובת transfection מורכב מדגם זה, לאט בצורה טיפה חכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Snap-Cell TMR כוכב תיוג של CHO-K1 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את התקשורת transfection מורכב מכל מדגם ידי יניקה ואקום. שטפו פעמיים עם תאים μl 600 של שלמה F-12k ולהחליף התקשורת היטב כל אחד עם 600 μl של שלמה F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקס מדיה לצבוע תיוג על ידי הוספת 995 μl של שלמה F-12k ו 51 μl 0.6 SNAP-Cell mM TMR-Star המצע. הריכוז הסופי של snap-Cell Star-TMR צריך להיות 3mm. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב לאחר תוספת של המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות התקשורת צמיחה ממדגמים ולהוסיף 200 μl של התקשורת תיוג לצבוע היטב כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דוגמאות דוגרים, להכין Hoechst 33342 פתרון מכתים הגרעין של דגימות ידי ערבוב 1 μl של 33,342 Hoechst, trihydrochloride, הידראט (10 מ"ג / מ"ל ​​מים פתרון, פתרון 16.2 מ"מ; בדיקות Invitrogen מולקולרית) בתוך 10 מ"ל של שלמה F-12k . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ממדגמים כל ולהוסיף 600 μl של הפתרון Hoechst לדלל לטעום כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים עם 600 μl של שלמה F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 30 דקות נוספות כדי לאפשר fluorophore מאוגדים לנטרל מתוך התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, לשנות את התקשורת על SNAP-Cell דגימות בפעם האחרונה והמשך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת תאים באמצעות Apotome Zeiss Axiovert 200 מיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. להלןכמה תוצאות נציג דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניאון סטנדרטית של COS-7 תאים חיים כי מביעים SNAP-תג fusions. זו התמונה הראשונה הופעות חיות COS-7 תאים להביע pSNAP-H2B (הגרעיני היסטון) שכותרתו עם Cell-SNAP TMR-Star. PSNAP-H2B לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ ') וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי ורוד מדגים את כיסוי של חלבון פלואורסצנטי אדום שבו היסטון קיים בנוסף הקרינה הכחול המציין את הגרעין. הביטוי של החלבון H2B מזוהה בבירור ובקלות. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איורים 2 ו -3. אלה לצד שתי תמונות להראות לחיות COS-7 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRβ2. תאים תויגו עם Cell-SNAP TMR-Star (אדום) counterstained עם Hoechst 33342 (כחול). PSNAP-ADRβ2 לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ ') וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי אדום מעיד על קיומו של שטח פני התא חלבון קולטן ADRB2 תוך כחול פלואורסצנטי מזהה את הגרעין.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

המחברים הם מועסקים על ידי ניו אינגלנד Biolabs שמייצר את ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

ישנם מספר משתנים המשפיעים על התוצאות שנצפו כגון אינטנסיביות, לייזר מיקוד, יכולות הציוד, עדשות השתמשו וכו &#39;photostability של fluorophore קובע כמה מהר את הקרינה חייב להיות בשבי לפני דהייה. שיטה זו של תיוג חלבון צדדי מתאים ליישומים רבים. Snap-תג קליפ תג טכנולוגיות תיוג הספציפי של חלבונים היתוך עם בדיקות סינתטי לאפשר היבטים שונים של תפקוד החלבון, כולל מגוון רחב של תהליכים דינמיים בתאים חיים וב lysates התא. Snap-, קליפ, MCP ו-ACP-תג טכנולוגיות לספק צדדיות פשטות יוצאת דופן הדמיה של חלבונים בתאים חיים קבוע ללימוד חלבונים במבחנה. יצירת לבנות גן יחיד התשואות חלבון היתוך מתויג מסוגל להרכיב הצמדה קוולנטי למגוון של קבוצות פונקציונליות, כולל fluorophores, ביוטין, או חרוזים. החלבון של עניין יש משובטים והביע רק פעם אחת ולאחר מכן את היתוך ניתן להשתמש עם מגוון מצעים ניאון עבור יישומים במורד רבים כגון תיוג חלבון בו זמנית בתוך תאים חיים, לוקליזציה של חלבונים טרנסלוקציה, הדופק לרדוף ניסויים, הפנמה מחקרים קולטן , תא סלקטיבית משטח תיוג, חלבון לנתץ מבחני, גילוי חלבון SDS-PAGE, cytometry זרימה, תפוקה גבוהה מבחני מחייב צלחות microtiter, ניסויים אינטראקציה biosensor, ו סריג מבוססי מבחני מחייב.

<table><tbody><tr><td>תאי CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>F-12K נטול סרום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עם תאי בורוסיליקט #1.5 מדגם Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lot: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (תמיסה של 10 mg/ml במים, תמיסה של 16.2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>פלסמיד ביקורת pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>פלסמיד ביקורת pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

תיוג פלורסנט של cos-7-snap הבעת תג חלבונים fusion עבור דימות תא חי

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. מערכות אלו מציעות מבחר רחב של מצעים פלורסנט אופטימיזציה עבור מגוון רחב של מכשור הדמיה. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב. ישנם שני צעדים באמצעות מערכת זו: שיבוט וביטוי של החלבון של עניין כמו היתוך SNAP-תג, וסימון של התמזגות עם המצע SNAP-התג של בחירה. הצמד תג הוא חלבון קטן מבוסס על אדם O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), חלבון תיקון דנ&quot;א. Snap-תג ותוויות צבעים מצומדות כדי גואנין או קבוצות עוזב chloropyrimidine באמצעות מקשר בנזיל. בתגובה תיוג, הקבוצה בנזיל להחליף המצע מחוברת קוולנטית לתייג-SNAP. קליפ תג הוא גירסה שונה של תג-SNAP, מהונדסים להגיב benzylcytosine ולא נגזרים benzylguanine. הפועל בשיתוף עם תג-SNAP, CLIP-תג מאפשרת תיוג אורתוגונליים ומשלימים בו זמנית של שני חלבונים בתאים זהים.

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

מערכות סימון החלבונים SNAP-tag ו-CLIP-tag מאפשרות חיבור קוולנטי ספציפי של מולקולות, כולל צבעים פלואורסצנטיים, לחלבון עניין...

תגי SNAP ו-clip. מערכות לסימון חלבונים מאפשרות חיבור קוולנטי ספציפי של כמעט כל מולקולה לחלבון מטרה. ניתן לשבט את הגן המבוקש לתוך הווקטור משני צדי התג; ביטוי של הגן המשובט יוביל לחלבון מאוחד עם תג SNAP.מצע ה-snap tag מורכב משני חלקים: ה-benzo guin, המזוהה על ידי ה-snap tag, והקבוצה הפונקציונלית. הקבוצה הפונקציונלית עשויה להיות ביוטין, חרוזיק (bead) או קבוצה פלואורסצנטית, הזמינה במגוון צבעים. במהלך תגובת הסימון, קבוצת ה-benzo המוחלפת נקשרת באופן קוולנטי ל-SNAP tag תוך שחרור גואנין; אם Fluora four מצומד לחלבון המבוקש, הסימון פולט פלואורסצנציה המאפשרת הדמיה של החלבון בתאים חיים או מקובעים.שלום, אני כריס פרובוסט מ-New England Bile Labs. היום נראה לכם פרוצדורה לדימיון פלואורסצנטי של תאי COS 7 חיים המבטאים חלבונים מאוחדים עם snap tag. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור היכן ממוקמים חלבונים בתאים.בואו נתחיל. כדי להכין תאי COS-7 לטרנספקציה, בצעו להם טריפסינציה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים והוסיפו 50 עד 100 µL של תאים ל-6 mL של מצע DMEM מלא. ערבבו את תגלוש התאים באמצעות פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, חלקו מנות של 300 µL של תגלוש התאים שעברו טריפסינציה לכל באער של Lab-Tech שמונה-תאי עם כיסוי זכוכית סטרילי. דגרו את הדגימות ב-37 °C, 5% CO2 למשך הלילה. למחרת,בדקו את תאי תרבית התאים כדי לוודא את צפיפות התאים ובריאותם. סמנו את המספר המתאים של מבחנות מיקרו-צנטריפוגה עבור תערובות קומפלקס הטרנספקציה. בתוך מנדף זרימה למינרית.הכינו את תערובות קומפלקסי הטרנספקציה עבור כל תגובה. השתמשו ב-0.3 micrograms של DNA של snap fusion plasma המדולל במצע ללא סרום ובמיקרוליטר אחד. כל אחד מחומרי הטרנספקציה TPAs D two ו-TPAs v, וכן פלסמידי בקרה, זמינים לבדיקת יעילותם של חומרי הטרנספקציה.אנו ממליצים בנוסף לכלול דגימת mock transfection ו/או דגימה שאינה כרותה כביקורות שליליות עבור כל תערובת מורכבת. ראשית, ערבבו את ה-DMEM ללא סרום עם ה-plasma DNA המתאים. לאחר מכן, הוסיפו את ריאגנט הטרנספקציה TPAs D, ואחריו את ריאגנט הטרנספקציה TPAs v.ערבבו את הרכיבים היטב על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה מספר פעמים לאחר הוספת כל ריאגנט, והדגירו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות; במהלך ההדגרה שטפו את התאים פעם אחת עם 600 microliters של DMEM מלא והוסיפו 450 microliters של DMEM מלא לכל דגימה. עם סיום ההדגרה, הוסיפו 50 microliters של תערובת קומפלקס הטרנספקציה לכל דגימה באיטיות ובטיפות. הדגירו את הדגימות למשך לילה ב-37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide.ביום למחרת. ניתן לסמן את תאי ה-cost seven שעברו טרנספקציה באמצעות סובסטרט snap cell TMR star. כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף 50 µL של DMSO לסובסטרט snap cell TMR star ולערבב באמצעות פיפטור מעלה ומטה או על ידי וורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, יש להסיר בזהירות את מצע קומפלקס הטרנספקציה מכל דגימה באמצעות שאיבת ואקום ולשטוף את התאים פעמיים עם 600 µL של DMEM מלא.לאחר מכן, החליפו את המצע בכל באר ב-600 microliters של DMEM מלא. החזירו את הדגימות לאינקובטור. הכינו מצע סימון D על ידי הוספת 995 microliters של DMEM מלא וחמש microliters של 0.6 millimolar.שאוב את תמיסת המצע Snap cell TMR star למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה כדי לערבב לאחר הוספת המצע. הריכוז הסופי של Snap cell TMR STAR צריך להיות 3 µM. הסר בזהירות את מצע הגידול מהדגימות והוסף 200 µL של תמיסת סימון DIA לכל באר. דגור את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C, ב-5% CO2 למשך 30 דקות. בשלב זה, קבוצת הבנזיל שעל מצע ה-TMR תיקשר קוולנטית ל-snap tag ותשחרר את ה-quain בזמן דגורת הדגימות.הכינו תמיסת HX לצביעה גרעינית של הדגימות. ערבבו מיקרוליטר אחד של HSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRI ב-10 מיליליטר של DMEM מלא. עם סיום האינקובציה, הסירו את מצע הסימון מכל הדגימות והוסיפו 600 מיקרוליטר של תמיסת ה-hook המדוללת לכל דגימה.דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C, בריכוז של 5% carbon dioxide למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הסירו את תמיסת ה-hooked המדוללת מכל דגימה ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 600 µL של DMEM מלא. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 600 µL של DMEM מלא לכל דגימה.דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות נוספות כדי לאפשר לפלואור (Fluor) שלא נקשר להתפזר אל מחוץ לתאים, דבר הדרוש לסימון תוך-תאי. לאחר 30 דקות, החליפו את המצע בדגימות תאי ה-snap פעם אחרונה עם 600 µL של DMEM מלא. התאים מוכנים כעת לדימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי zeis AOME vert 200 M.להלן מספר תוצאות מייצגות של דימוי פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית של תאי COS-7 חיים המבטאים חלבוני פיוז'ן עם תג. תמונה ראשונה זו מראה תאי COS-7 חיים המבטאים PNAP-H2B המסומנים ב-SNAP-cell TMR*. קונסטרוקט ה-PNAP-H2B נוצר באמצעות וקטור PNAP-TAG-M.התאים סומנו באמצעות snap cell TMR star למשך 30 דקות, ובוצע צביעה נגדית של הגרעינים באמצעות Hoechst 33342. הפלואורסצנציה הוורודה מדגימה את החפיפה של פלואורסצנציה אדומה במקומות שבהם קיים חלבון היסטון. בנוסף לפלואורסצנציה הכחולה המצביעה על הגרעין, ניתן לזהות באופן ברור וקל את הביטוי של חלבון H2B.שתי התמונות הבאות מציגות תאי cost seven חיים שעברו טרנספקציה זמנית עם pnap. תאי A DR beta two סומנו באמצעות snap cell, tmr, star, וצביעה נגדית עם HUX 3 33 42. קונסטרוקט pnap A DR beta two נוצר באמצעות וקטור PNAP TAG M.התאים סומנו באמצעות snap cell TMR star למשך 30 דקות וצבעו בצביעה נגדית עם hooks 3 33 42 עבור הגרעינים. הפלואורסצנציה האדומה מעידה על נוכחותו של חלבון הקולטן למשטח התא A DR beta two, בעוד שהפלואורסצנציה הכחולה מזהה את הגרעין. הצגנו כעת כיצד לבצע דימוי פלואורסצנטי של תאי cough seven חיים המבטאים חלבוני עיבוי snap tag.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את קומפלקס הטרנספקציה באיטיות ובטיפות, ולאחסן את תסבסב ה-snap tag בטמפרטורה של 20°C- בחושך כאשר הוא אינו בשימוש. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine ​​בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

למד תיוג פלואורסצנטי של חלבונים בזיהוי חי בתאי COS-7 באמצעות מערכת SNAP-tag. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי דינמיקת חלבונים בזמן אמת ללא צורך בשיבוט חוזר.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

גלה סרטונים נוספים