Name: זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למדו שיטת הדמיה בזמן אמת של תאי יונקים במיטוזה לאחר transfection siRNA. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר דינמיקת כרומוזומים וכימות תזמון מיטוטי לחקר מחזור התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקנית לסרטן (PF-07-103-01-CSM), המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM61275 ו P30 CA042014), לוקמיה וחברה לימפומה, סרטן צייד ואת הקרן.

siRNA transfection והכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 4-היטב LabTek coverglass II החדרים ידי הוספת 0.5mL של פיברונקטין (10μg/mL) היטב כל אשר ישמשו. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) מתחמי עבור transfection הפוכה על פי הוראות של היצרן. השתמש בכמויות מומלץ אחד טוב של המנה 24 באר לכל תא לשמש (100μL סה&quot;כ). מוצר פרוטוקול מקביל / עבור transfection siRNA ניתן להחליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיברונקטין מבארות של coverglass החדרים. הוסף 100μL של siRNA / מתחמי RNAiMAX Lipofectamine היטב כל אשר ישמשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20,000 היסטון H2B-mCherry-להביע תאים (ב 500μL) לכל היטב המכיל תערובת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים כדי לדגור במשך ~ 24 שעות לפני החלפת תערובת transfection עם 1mL של המדיום הסלולרי הרגיל תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים דגירה נוספת 24 שעות לפני רכישת התמונה (48 שעות שלאחר transfection). </li></ol> מיקרוסקופ ההתקנה רכישת תמונה <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שלושה חלקים עיקריים ההתקנה רכישת תמונה: 1) תא חממה שמתאים על הבמה מיקרוסקופ ושומרת על סביבה לחה קבועה של 37 ° C, ו - 5% CO 2: 2) מיקרוסקופ המצויד הפוכה שלב אוטומטית, אוטומטיות פלואורסצנטי brightfield תריסים, וגלגלים מסנן אוטומטי: 3) חבילת תוכנה המשלבת שולטת על הבמה, תריסים, וגלגלים הסינון. ב ההתקנה הדמיה שלנו, אנו משתמשים תא אישית מתוך אוקו החממה Lab כי ניתן להשתמש עם השנייה LabTek החדרים coverglass. השלב, תריסים, וגלגלים לסנן נשלטים על ידי תוכנת Metamorph רמז:. המעבדה אוקו הבמה העליונה מערכת החממה כולל מתאמים עבור מגוון רחב של צלחת מאכל שונים, או בגדלים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את השנייה LabTek החדרים coverglass בחממה על ידי פתיחת המכסה של החממה מראש התחמם equilibrated, הצבת coverglass החדרים בתוך המתאם, והחזקה במקום עם פלסטלינה. השאירו את המכסה על coverglass החדרים כך בינוני תרבית תאים לא יתייבש. סגור את המכסה ואת המיקום החממה כולה על הבמה מיקרוסקופ, על מנת להבטיח כי החממה מוחזק במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Metamorph, להגדיר את הניסוי שלך על ידי בחירת &quot;Apps / רכישת רב ממדית&quot; בשורת התפריטים של התוכנה. פעולה זו תציג חלון בו ניתן לבחור את תדירות ואורך timelapse, את זמן החשיפה לכל צבע (אם עושים מספר הגדרות), מספר ומיקום עמדות הבמה, ומספר Z-הסעיפים (אם ) הרצוי. . בחר היכן לשמור את קבצי הנתונים רמז: אם אתם משתמשים בתוכנה שאינה Metamorph, פונקציות עשוי להיות מעט שונה, אך הרעיון הכללי הוא זהה. Micromanager, קוד פתוח ImageJ מבוססי תוכנה הרכישה תואמת setups חומרה ביותר, היא חלופה מעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . למטרות פרוטוקול זה, נוכל לרכוש תמונות בשני אורכי גל (brightfield ו mCherry) כל 15 דקות במשך 8 שעות 15 עמדות בשלב רמז: אם החלטה זמן טוב יותר הוא הרצוי, אז אתה יכול לקצר את מרווח הזמן בין רכישות, אולם , עמדות הבמה פחות ניתן להשתמש, ותאי mitotic ובכך פחות יהיה זמין עבור הניתוח. חשוב כאשר שוקלים מרווחי הזמן לקחת בחשבון את הזמן הנדרש עבור ההגה מסנן כדי לעבור בין מערכות הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה האופטימלי עבור כל אורך הגל הראשון על ידי התמקדות בתחום של תאים באמצעות תאורה brightfield. בתוך התוכנה, להתאים את פונקציית פוקוס אוטומטי רק עבור ערוץ brightfield (זה יאפשר את התוכנה פוקוס אוטומטי במיקום כל שלב לפני רכישת כל אחד) רמז:. אנו משתמשים מטרה 40X יבש שלב בניגוד לתת פתרון מצוין ללא צורך שמן . מטרות נוספות ניתן להשתמש בהתאם לרזולוציה אופטית הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר הגל mCherry ולהצמיד תמונה באמצעות חשיפה 50 msec. התאם את זמן החשיפה למינימום הנדרש כדי לראות תמונה טובה. זה חיוני כדי להגביל את כמות החשיפה לאור, כדי להבטיח כדאיות התא מתמשכת. ככלל, זו יכולה להיות מושגת הטובה ביותר באמצעות מסנן צפיפות ניטרלי (כדי להפחית את שטף האור עירור) וחשיפה ארוכה יותר זמן המצלמה ולא על ידי הגדלת עוצמת הארה. חזור על הליך זה עבור כל אורכי גל נוסף לשמש רמז:. כדי לקבוע לטווח ארוך כדאיות התא בעת החשיפה נתון עבור הניסוי שלך, תוכל לצפות בתצוגה מקדימה את המספר הכולל של תמונות בתא יכולים לשרוד מעל timelapse הרצוי על ידי התאמת המרווח זמנית timepoint מ דקות שניות (כלומר, 10 דקות. הופכת 10 שניות). אם התאים שלך לשרוד 100-200 חשיפות (אוהמספר המתאים), ואז החשיפה שלך היא בסדר. אם לא, להפחית את האור עירור שלך, זמן חשיפה, או את המספר הכולל של תמונות כדי לדמות בניסוי המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בחר וסמן המספר המתאים של עמדות שלב, כך שתוכל להשיג דגימה מספקת של האוכלוסייה התא. Metamorph יתעד את עמדות יחזור לשם רכישת כל רמז:. אני בדרך כלל מנסה למצוא עמדות שבהן יש שפע של תאים לתמונה, אבל לא רבים, כך הם צפופים מדי. כמו כן, חשוב לבחור עמדות מספיק, כך יהיה לך סיכוי טוב לצפות במספר גדול של תאים מתקדמת באמצעות מיטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל timelapse, זמן חשיפה הגל, ואת המיקום מידע הבמה נרשמו, בחר את &quot;תצוגה מקדימה&quot; כפתור על המסך כדי לקבוע אם התוכנה היא שליטה על ציוד מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאתה מרוצה, בחר את &quot;רוכשת את&quot; כפתור על המסך כדי להתחיל הרכישה. ואז לשבת בחיבוק ידיים ולאפשר את המחשב מיקרוסקופ לעשות את העבודה רמז:. ציית אוטומציה באמצעות סיבוב אחד לפחות מלא רכישה כדי להבטיח שהכל פועל כשורה. </li></ol> תמונה עיבוד וניתוח <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה הסתיימה, השלב הבא הוא להעביר את נתוני התמונה לתוך טופס כי הוא יותר קל לטפל. למטרות פרוטוקול זה, אני אדגים הראשונה איך ליצור סרטים באמצעות Metamorph, אז איך ליצור תמונה montages באמצעות תוכנית ImageJ. פורמט או יהיה שימושי למטרות כימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון הוא לבדוק את הנתונים. כדי לעשות זאת, בחר &quot;Apps / סקירה נתונים רב מימדי&quot; בשורת התפריטים. בחר את המיקום של הקבצים שלך, ואז לבחור &quot;תצוגה&quot;. זה יאפשר לך לבדוק את ערימת התמונות מעמדת כל שלב בנפרד. בחר את המיקום הרצוי הבמה, ואז &quot;טען תמונות&quot;. תוכל לקדם את הנתונים דרך מסגרת לפי מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלו עמדות השלב בו התאים עוברים מיטוזה (כפי שנקבע על ידי ה-DNA והן מורפולוגיה תאית), אתה יכול לעשות סרטים montages באמצעות Metamorph, או עם תוכניות אחרות כגון ImageJ (זמין בחינם דרך NIH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך סרט Metamorph, בחר &quot;תהליך / שמור סרט&quot; בשורת התפריטים. תוכל לבחור את מסגרות לשימוש, מהירות, סוג הקובץ של הסרט. לאחר מכן, בחר &quot;שמור סרט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מונטאז, אני שומר את ערימת התמונה כקובץ STK., אשר ניתן להשתמש בתוכניות אחרות כגון ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ ב ImageJ ולקדם את מסגרות עד שתמצא תא עובר מיטוזה. . חתוך את האזור סביב התא ובחר &quot;תמונה / שכפול&quot; רמז: ודא לשכפל כל המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מונטאז, בחר &quot;תמונה / ערימות / לעשות מונטאז&quot; בשורת התפריטים. כאן אתה יכול לציין אילו מסגרות שברצונך לכלול, בגודל ובצורה של מונטאז&#39;, ואם אתה רוצה הגבולות בין המסגרות. בחר האלה והכה &quot;בסדר&quot;. .. שמור את מונטאז&#39; כקובץ tif ולעשות כל עיבוד נוסף או ImageJ או Adobe Photoshop רמז: שנה קבצים מונטאז&#39; מתבנית 16-bit המשמש Metamorph בפורמט 8 סיביות עבור עיבוד תמונה קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את זמן בשלבים שונים של מיטוזה, לקבוע t = 0 (הסימן הראשון עיבוי דנ&quot;א או עיגול התא), לספור את מספר מסגרות עד הכרומוזומים מיושרים בקו המשווה (זמן prophase / prometaphase), מסגרות עד הכרומוזומים מתחילים להפריד (זמן metaphase), מסגרות עד התאים מתחילים להשתטח (anaphase / telophase / cytokinesis). הזמן מחושב בכל שלב mitotic תלוי במרווח הזמן בין כל מסגרת. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> איור 1 מדגים את התוצאות של ניסוי טיפוסי transfection siRNA לשלוט באמצעות קו תא הלה הביע היסטון H2B-mCherry. שיטה זו של נעשה שימוש יעיל לכמת העיתוי mitotic, חושפים תפקיד בלתי צפוי עבור Nup153 nucleoporin בעיתוי של מיטוזה מאוחר 1. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

עם ההתקדמות בטכנולוגיית הדמיה חלבון פלואורסצנטי, הדמיה לחיות הפכה פעולה שגרתית של ניתוח הסלולר 2. מגוון של GFP (וגירסאות צבע אחר 3), מתויג חלבונים זמינים באופן נרחב או קל יחסית לבנות והוא יכול לשמש כדי לעקוב אחר מספר סימני ההיכר חלוקת התא, כולל ה-DNA / כרומוזום הדינמיקה 4, 5, 6 centrosome שכפול, cyclin B הדינמיקה 7, המעטפה פירוק והרכבה מחדש גרעיני 8, 9, ציר mitotic היווצרות 10, בשלבים שונים של cytokinesis 11. חלבונים Tagged ניתן להשתמש לבד או בשילוב כאשר ספקטרום עירור / פליטה של ​​תגי פלורסנט תואמים, המאפשר תיאום בין אירועים ספציפיים להיות מוערך. אם ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר ו / או הזמני הוא / הם הרצויה, מיקרוסקופיה confocal אם סריקה סריקת לייזר, דיסק ספינינג, או תהודה ניתן להשתמש, ואת רשימת אפשרויות במיקרוסקופ משוכלל עם רזולוציה הולך וגובר ממשיך לגדול. הדמיה חיה של מיטוזה בתאי יונקים יש גם מותאם לשימוש תפוקה גבוהה RNAi מסכי מולקולה קטנה 12-14. וכך, בעוד הניסויים הראשוניים של אחד באמצעות טכניקה זו עשויה להיות פשוטה יחסית, האפשרויות לבנייה על אסטרטגיה זו נרחב.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי עם תאי Lab Tek II (4 תאים)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>גדלי תאים נוספים זמינים</td></tr><tr><td>פיברונקטין (Fibronectin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>מדגרה לתאים המותקנת על הבמה</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל תא מתאים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך אוטומטי</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ מתאים</td></tr><tr><td>חבילת תוכנה</td><td>Metamorph</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל תוכנה מתאימה</td></tr></tbody></table>

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

שינויים בארגון הסלולר דינמיקה כרומוזום המתרחשים במהלך מיטוזה מתואמים באופן הדוק על מנת להבטיח ירושה מדויקת של תוכן גנומי הסלולר. אירועים Hallmark של מיטוזה, כגון תנועת כרומוזום, ניתן לעקוב בקלות על בסיס תאים בודדים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של שורות תאים יונקים להביע ספציפי GFP-tagged חלבונים. בשילוב עם דלדול RNAi מבוסס, זה יכול להיות שיטה חזקה איכון את הבמה (ים) של מיטוזה בו פגמים להתרחש לאחר רמות של חלבון מסוים כבר הוריד. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה בסיסית להערכת ההשפעה של depleting חלבון mitotic פוטנציאל הרגולציה על העיתוי של מיטוזה. תאים הם transfected עם siRNA, הניח בתא הבמה העליון הדגירה, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות. אנו מתארים כיצד להשתמש בתוכנה כדי להגדיר ניסוי זמן לשגות, איך לעבד את התמונה sequences לעשות או עדיין תמונה montages או סרטים, וכיצד לכמת ולנתח את העיתוי של שלבים mitotic באמצעות תא שורת להביע mCherry- מתויג H2B היסטון. לבסוף, אנו דנים שיקולים חשובים לעיצוב ניסוי זמן לשגות. אסטרטגיה זו הוא משלים גישות אחרות מציע את היתרונות של 1) רגישות לשינויים קינטיקה שעשויים להיות לא נצפתה כאשר מסתכלים תאים כאוכלוסייה ו 2) ניתוח של מיטוזה ללא צורך לסנכרן את מחזור התא באמצעות טיפולים תרופתיים. מידע חזותי מניסויים הדמיה כזו לא רק מאפשרת המשנה שלבי מיטוזה להיות מוערך, אבל גם יכול לספק תובנה צפוי כי לא יהיה ברור מניתוח מחזור התא על ידי FACS.

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

שינויים בארגון התאי ובדינמיקת הכרומוזומים המתרחשים במהלך המיטוזה מתואמים באופן הדוק כדי להבטיח העברה מדויקת של הגנום ו...

שינויים בארגון התאי ובדינמיקה של הכרומוזומים המתרחשים במהלך המיטוזה מתואמים באופן הדוק כדי להבטיח העברה מדויקת של התוכן הגנומי והתאי. במאמר וידאו זה, מוצגת שיטה למעקב אחר אירועים מרכזיים של המיטוזה. תנועת הכרומוזומים מנוטרת ברמת התא הבודד תוך שימוש בקווי תאים המבטאים חלבונים מסומנים פלואורסצנטית.טרנספקציה של siRNA המכוון נגד חלבונים מיטוטיים גורמת לשינויים במחזור התא שניתן להדגים באמצעות דימוי בזמן אמת (time-lapse imaging) ולכמת באמצעות ניתוח תמונות. שלום, אני דוגלס מאקי מהמעבדה של קייטי אומן במכון לסרטן המטסמן באוניברסיטת יוטה. היום נראה לכם הליך לדימוי תאים חיים בעודם מתקדמים בשלב המיטוזה בעקבות טרנספקציה של siRNA.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לבחון השפעות אפשריות של שיבוש חלבונים בעלי עניין על עיתוי ההתקדמות המיטוטית. אם כן, בואו נתחיל. הכינו זכוכית כיסוי בעלת שני תאים מסוג four wall lab tech על ידי הוספה של 0.5 milliliters של fibronectin לכל תא.דגרו למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכינו קומפלקסים של irna ו-lip RNAI max עבור טרנספקציה הפוכה. בהתאם להוראות היצרן עבור כל תא, השתמשו בכמות המומלצת עבור באר אחת בצלחת בעלת 24 בארות.לאחר 15 דקות, הסירו את הפיברונקטין מהבארות של זכוכית הכיסוי המחולקת לתאים. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של קומפלקס irna לכל בארה, והעבירו 20,000 תאים ב-500 µL לכל בארה. הכניסו את התאים לאינקובטור למשך 24 שעות.ביום למחרת, החליפו את תערובת הטרנספקציה במיליליטר אחד של מצע גידול תאים רגיל, ולאחר מכן דגרו את התאים למשך 24 שעות נוספות לפני רכישת התמונה. מערך רכישת התמונה מורכב מדגרה לתאים המותאמת אישית ומונחת על בסיסו של מיקרוסקופ הפוך, המנוהל על ידי תוכנה לרכישת תמונות. כדי להיערך לרכישת התמונה, ודאו שהדגרה חוממה מראש והגיעה לשיווי משקל תרמי.בשלב הבא, פתחו את מכסה האינקובטור והניחו את התאים, כאשר מכסה התא סגור, בתוך המתאם. השתמשו בכמות קטנה של פלסטלינה כדי לקבע אותו במקומו. סגרו את המכסה והניחו את האינקובטור כולו על במה המיקרוסקופ, תוך וידוא שהאינקובטור מקובע היטב.בשלב הבא, באמצעות metamorph, הגדירו את הניסוי על ידי בחירה ב-apps multidimensional acquisition בסרגל התפריטים של התוכנה. פעולה זו תפתח חלון שבו ניתן לבחור את פרמטרי הדמיון. הגדירו היכן לשמור את קבצי הנתונים.לאחר מכן, בחרו באורכי גל של brightfield ו-m cherry באמצעות עדשת phase contrast יבשה בעלת מפתח 4 TX, התמקדו בשדה תאים באמצעות התוכנה, והגדירו את פונקציית המיקוד האוטומטי (auto-focus) עבור ערוץ ה-Brightfield בלבד. פעולה זו תאפשר לתוכנה לבצע מיקוד אוטומטי בכל מיקום של הבמה לפני כל רכישת תמונה. עבור אורך הגל הראשון, צלמו תמונה באמצעות זמן חשיפה של 50 millisecond, והתאימו את זמן החשיפה למינימום הנדרש לקבלת תמונה טובה.חיוני להגביל את כמות החשיפה לאור כדי להבטיח חיוניות תאים ממושכת. ככלל, ניתן להשיג זאת בצורה הטובה ביותר באמצעות שימוש במסנן צפיפות ניטרלי וזמן חשיפה ארוך יותר של המצלמה, במקום להגביר את עוצמת התאורה.חזור על פרוצדורה זו עבור אורכי גל נוספים. לאחר מכן, קבע את זמן החשיפה עבור כל ערוץ. לאחר מכן, הגדר מרווח זמן (time lapse) של 15 דקות למשך שמונה שעות ב-15 מיקומי במה.אם נדרשת רזולוציית זמן טובה יותר, קצרו את מרווח הזמן בין הרכישות. זכרו כי ככל שיהיו יותר מיקומי במה (stage positions), כך ייארך זמן הרכישה. בכל מרווח זמן, בחרו וסמנו מספר מתאים של מיקומי במה כדי לדגום את אוכלוסיית התאים באופן מספק.Metamor תתעד את המיקומים ותחזור למיקום שנקבע עבור כל רכישה. לאחר חשיפת אורך הגל בפרקי זמן, הוגדרו המידע על הזמן ומיקום הבמה. לחץ על כפתור התצוגה המקדימה (preview) על המסך כדי לוודא שהתוכנה שולטת בציוד באופן תקין.לאחר וידוא שהמערכת פועלת, בחר בכפתור acquire על המסך כדי להתחיל ברכישת הנתונים. עקב אחר האוטומציה לאורך סבב רכישה מלא אחד לפחות כדי לוודא שהכל עובד כראוי. לאחר מכן, ניתן להמתין בעוד המחשב והמיקרוסקופ מבצעים את העבודה.כדי לסקור את הנתונים, בחרו ב-apps, לאחר מכן ב-review multidimensional data בשורת התפריטים, בחרו בתצוגת מיקום הקובץ, ולאחר מכן בחרו במיקום של השלב (stage position). לחצו על load images כדי לסקור את ערימת התמונות מאותו מיקום. לאחר שהתמונות נטענו, השתמשו בעכבר כדי להתקדם בנתונים פריים אחר פריים.כאן נוצרים סרטונים של תאים במצב מיטוזה באמצעות Metamorph. כדי להכין סרטון ב-Metamorph, יש לבחור ב-stack ולאחר מכן ב-make movie. בשורת התפריטים, בחרו באילו פריימים להשתמש, במהירות ובסוג הקובץ של הסרטון.לאחר מכן, בחרו ב-save כדי ליצור מונטאז'. ראשית, שמרו את הנתונים כקובץ dot STK ב-metamorph. לאחר מכן, פתחו את image J, פתחו בתוכו את קובץ ה-dot s stk וגזרו אזור עניין (region of interest) על ידי סימון האזור ובחירה ב-image crop בשורת התפריטים.לאחר מכן בחרו את ערימות התמונות. בביצוע המונטאז' (montage), הגדירו אילו פריימים ייכללו, את הגודל והצורה של המונטאז', ואם תרצו להוסיף גבולות בין הפריימים.לאחר מכן לחצו על אישור. שמרו את המונטאז' כקובץ dot tiff. לבסוף, חשבו את הזמן בכל שלב של המיטוזה, כאשר הפריים שבו ניכר הסימן הראשון לעיבוי ה-DNA או לעיגול התא יוגדר כ-T שווה לאפס עבור הפרופאזה.הפרומטפזה מסתיימת כאשר הכרומוזומים מסודרים במישור המשווה, לאחר מכן תתרחש המטפזה עד שה-DNA יתחיל להיפרד באנפזה וטלופזה. ולבסוף, תבוא הציטוקינזה והתאים יתחילו להשטח. דימות במרווחי זמן של תאי hilar המבטאים histone.מוצג H two BCFP. תאים אלו עברו טרנספקציה עם irna של בקרה ומתקדמים באופן רגיל במחזור התא. להשוואה, תאים שעברו טרנספקציה עם siRNAs המכוונים נגד נקבוביות הגרעין NUP 1 53 מראים שינויים חמורים בהתקדמות ה-MIT.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להגדיר, להריץ ולנתח ניסוי של דימות במרווחי זמן (time-lapse imaging) כדי לקבוע את תזמון ההתקדמות המיטוטית של תאים לאחר טרנספקציה של siRNA. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות עדינים ככל האפשר כלפי התאים על ידי שמירה על הטמפרטורה והריכוזים של CO2 המתאימים, ועל ידי הגבלת כמות האור אליה נחשפים התאים. וזה הכל.תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוייכם.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

מקור: Daniele, F., et. al בדיקות GFP רגישות ל-TIRFM ו-pH להערכת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y: הדמיית תאים וניתוח נתונים. J. Vis. exp. (2015). סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי נוירובלסטומה אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש שלפוחיות סינפטיות מתויגות פלואורופור. התאים מתמקדים תחילה במצב אפיפלואורסצנטי. לאחר מכן נעשות התאמות כדי להשיג השתקפות פנימית מוחלטת, וליצור גלים חולפים המעוררים באופן סלקטיבי פלואורופורים ליד הממברנה. לפני...

הדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין.  היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

פרוטוקול זה מציג מערכת גנים כתב חדשה ואת ההתקנה הניסיונית כדי לזהות שעתוק ב- DNA כפול גדיל נשבר עם רגישות מולקולה אחת.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למדו שיטת הדמיה בזמן אמת של תאי יונקים במיטוזה לאחר transfection siRNA. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר דינמיקת כרומוזומים וכימות תזמון מיטוטי לחקר מחזור התא.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

גלה סרטונים נוספים