פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

חלקים פלסטיק לשמור מורפולוגיה רקמות נכון בסעיפים דקה של רקמה שניתן immunostained עם נוגדנים משני פלורסנט, מה שהופך שיטה זו יעילה יותר מאשר חלקים פרפין, מוטבע או קפואים עבור סוגים רבים של רקמות. השיטה עבור מכתים, הטבעה פלסטיק, חתך מודגם וידאו.

שלום, שמי סוצ'י אוטה. אני מדענית פוסט-דוקטורנטית במעבדה של ד"ר קן צ'ו במחלקה לביולוגיה התפתחותית ותאית באוניברסיטת קליפורניה. Irv I היום, אני אראה לך את הכנת החלק הפשוט של עובר קסנופוס.

הליך זה כולל חתך של צביעת עובר צפרדע בשלב הגז המאוחר עם נוגדן כנגד המולקולה המעניינת, הסתננות לתוך הפלסטיק ויצירת קטע פלסטיק זהה של חמישה מיקרון. ניתן להשתמש בהליך זה כדי לחקור את האימונוהיסטוכימיה האימונופלואורסצנטית או הכלאה באתרה עם תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד. אוקיי, אלה הכלים השימושיים הקטנים שבהם אני משתמש לחיתוך פלסטיק של עובר של 10 פלוס עובר.

זוהי פינצטה מתכתית עם קצה דלתא וזה, מספר אחת, ניתן להשתמש בה כדי לכוון את העובר בפלסטיק. ומספר שתיים, ניתן להשתמש בזה יחד עם מברשת צבע זו כדי להעביר את העובר מהמיקרוטום למשטח ההרכבה. זהו מבודד גומי מסיליקון, אותו אני מניח על פני המגלשה ואשר גורם למשיכת מים שבה אני יכול להרכיב את פרוסות העוברים החתוכים מפלסטיק.

עכשיו אני מראה איך לחתוך את העובר, עובר קבוע לבדיקה כמו הכלאה של nstitute או זיהוי אימונופלואורסצנטי. וכדי לחתוך את חצי העובר, אני משתמש ברשת המדברית הדקה מאוד הזו, שאפשר לקנות במכולת. אני חושב שכן, יש עוברים קבועים שמקבעים את התא 3.7% גבוה פורמלי בן לילה.

וזהו, איך אתה מתקן את זה תלוי במטרה. זה תוקן בן לילה. לצורך הכלאת חתך, אתה יכול ללכת על קיבוע בן לילה, אבל לזיהוי אימונופלואורסצנטי, שאתה מזהה את החלבון בתוך העובר, לא המלצתי על קיבוע ארוך מדי.

ואני מעדיף לבצע את קיבוע הגובה של 3.7% למשך שעתיים בלבד כדי למזער את ההשפעה על הלוקליזציה התת-תאית של החלבון וגם להימנע מקיבוע יתר כדי לאפשר חדירה יפה של הנוגדן במהלך שלב הזיהוי. אוקיי, עכשיו אני מנתח את העובר הזה דרך קיר הפיצוץ וחותך צד שמאל וצד ימין. אז עכשיו אני רואה שיש לזה עובר שלב 11 שבו ה-PO נמצא כל הדרך מהצד הגבי לצד הגחון, אבל עובר דו-צדדי

ובואו נסתכל על החלק הימני הזה. אתם רואים את הפיצוץ גם בצד הגבי וגם בצד הגחוני, אבל הצד הגבי ברור מכיוון שהחדירה הזו מגיעה בבירור לעומק העמוק ביותר של העובר בהשוואה לצד הגחוני. אז זו חתיכה טובה, חתיכה חצויה טובה לחקר הצד הגבי והגחון.

בתוך העובר, העובר המנותח הזה, אני הולך להשתמש בזיהוי אימונופלואורסצנטי של חלבון המתבטא בתוך העובר. ועבור אימונופלואורסצנציה או אימונוהיסטוכימיה, אתה משתמש בנוגדנים ספציפיים לנוגדנים לזיהוי. אבל הבעיה היא שהנוגדנים לא חודרים היטב לחלק הפנימי של העובר.

אז אם אתה משתמש בהר שלם, עובר הר שלם, אתה לא יכול לדעת. אינך יכול לחקור את דפוס הביטוי של החלבונים שלך בעובר. אבל באמצעות העובר הזה שנחצה מראש, אתה יכול לחקור מהו דפוס הביטוי בתא עמוק בתוך העובר.

אה, עובר מוכתם כבר תוקן ב-3.7% פורמלדהיד מיובש באתנול ומסתנן לתוך הפלסטיק, מה שנקרא טכנו 7, 100. והערכה הזו מכילה שלושה חלקים, שהם החלק העיקרי הזה נוזלי והאבקה הזו, שנקראת מקשה. והנוזל הזה נקרא מקשה שתיים.

ראשית אני מערבב את החלק העיקרי הזה ואת המקשה עם 100 לריאו אחד, מה שהולך לתת לך את תערובת ההסתננות הזו. וזה מה שיש, זה נוזל, שאליו אני מסתנן לעובר הזה. וזה עדיין נוזלי כך שהוא לא הולך להתקשות עדיין.

וזה אותם דגימת עוברים שנשארים בתערובת ההסתננות הזו למשך הלילה כדי לוודא שדגימת העובר מסוכמת לחלוטין בפלסטיק הזה. עכשיו אני לוקח את זה של עובר הדגימה עם פיפטת העברה ומעביר לצינור דופן דק של 0.5 MPCL, בו אני משתמש כתבנית הטבעה. ואז מהעובר הזה אני מסיר עודפי נוזלים.

ועכשיו העובר הזה, העובר הזה כבר מוכן להטמעה בפלסטיק המתקשה. כדי להכין את הפלסטיק המתקשה, אתה מערבב את תערובת ההסתננות הזו עם צינור ההקשחה הזה ב-15 לאחד. כך למשל, אם אני לוקח 750 מיקרוליטר מתערובת ההסתננות הזו כדי לתמוך בצינור, אז אני אמור להוסיף גם 50 מיקרוליטר של המקשה הזה כדי להתחיל את הפילמור של הפלסטיק לאחר הוספתו, אופס, לסגור את הפקק ואז לערבב בעדינות ככה.

ואתה לא צריך לעשות מערבולת כי חמצן הוא מעכב תגובת פילמור. הוסף כ -250 מיקרוליטר מתערובת זו לעובר. ושלב הפילמור הזה לוקח כמעט ארבע שעות שאתה צריך, אתה לא צריך למהר בכלל.

לאחר הוספת הפלסטיק הפולימרי הזה תחילה, אתה יכול לצינור אותו למעלה ולמטה כדי להכין, לגרום לעובר לצוף בפלסטיק. ועכשיו אני לוקח את פינצטת המתכת הזו כדי לדחוף את העובר כדי לכוון אותו כך שמשטח החיתוך של העובר יגיע לתחתית תבנית ההטבעה הזו. לאחר מכן סגור את המכסה מכיוון שחמצן הוא מעכב תגובת ריפוי והשאיר אותו למשך ארבע שעות כדי לאפשר תגובת איזון.

לאחר מכן, זהו עדר HUD שכבר נמצא בדגימה. אתה שם סוג של דבק לדגימה הזו כדי לוודא שהחלק הקשיח מפלסטיק זה לא ייצא מהתבנית הזו. זהו, זהו פלסטיק נוסף שעובד כדבק למטרה זו הנקרא טכנו 30 40.

ואני מערבב את האבקה והנוזל הזה עם 2, 2, 1 הנה 0.6 גרם של האבקה הזו. אז אני הולך להוסיף 300 מיקרוליטר מהנוזל הזה, ואז לערבב אותו במהירות והפלסטיק הזה הופך להיות קשה די מהר. אז זה חלק, אתה צריך להיות קצת קשה ואז לשפוך את זה לדוגמא שכבר נשמעה.

זה מספיק טוב. סגור את המכסה. אני נראה ככה.

וזה ייקח בערך 30 עד 60 דקות עד שיהיה קשה. וזה מה שמוכן לפעולה. ראשית, חתכתי את קצה התבנית בעזרת סכין קרטון, קילפתי את חלק הקצה הזה מהתבנית הזו.

אז עכשיו העובר המוטבע הזה נחשף. וגם חתכתי את המכסה הזה כי אני לא צריך את זה. עכשיו אני לוקח את המחט הזו של רוי, אני מתכוון לא להב רוי של מחט, שהוא קשה יותר מלהב הכתם הרגיל המשמש לחיתוך פארין.

אני טובל את זה לזמן קצר בשין כדי שיהיה נקי. הגדר את זה ל-, הגדר את זה למחזיק הלהב ונגב את עודפי הזאין. ולפעמים אני מנקה גם את האזור הזה עם זאין כי הניקיון של האזור הזה הוא בהחלט חשוב.

עכשיו הוא מוכן לחלוקה. לפני תחילת החיתוך, הקמתי את תא ההרכבה. אז זו זכוכית שקופיות.

ובנוסף לזה אני מכניס את גומי הסיליקון הזה ודוחף את החקלאי לדחוף את כל הדרך כדי שלא תהיה שום דליפה. והניחו את זה על המגלשה חמה יותר ושפכו את מי הרפואה הנקיים האלה כדי להכין את הבריכה שלנו. ושים כמה מים כדי שתקבל עד שתקבל את פני המים על פני השטח.

וזה חשוב מכיוון שמשטח מי השיטפון הזה נותן חלוקה שווה של מתח הפנים של המים, מה שחשוב כדי שהקטע יתארך באופן שווה. עכשיו אני חותכת, אבל לפני שאני עושה את זה אני לובשת את המסכה הזו כי כל פיסת חתך כל כך קלה, כל כך קלה ושלי, השד שלי יכול להתעופף מהבמה. אז אני לובש את המסכה הזו.

ועכשיו תתחילו לקטע. אחרי שאתה מקבל מספר כלשהו של חתיכות על הבמה, אתה לוקח את זה עם מברשת צבע ולאט לאט עובר על גבי תא ההר הזה ודופק את מברשת הצבע הזו כדי לגרום לחתיכה הזו להיכנס למים על ידי כוח הכבידה. וברגע שהם נוחתים על המים, הם מתרחבים ליצירת חתיכה עגולה על פני המים.

איך האור הזה אחרי לילה יבש. עכשיו זה נראה ככה וככה. כעת הדגימה מוכנה ליצירת קשר עם DPI עבור DNA גרעיני.

ואז אתה יכול ללמוד תחת המיקרוסקופ. היום הראיתי לכם את הכנת חתך הפלסטיק באמצעות עובר צפרדע בשלב גז מאוחר. הליך זה שימושי למדי לחקר תת-תא או לוקליזציה של חלבון, שלא ניתן לחקור באמצעות טכניקת הטמעת פארן וגם זה באופן כללי אפילו עבור הכלאה שיורית.

קטע פלסטיק זה גם נותן לך אפילו עבור הכלאה שיורית, הליך זה יכול לתת לך תמונה ברמה גבוהה בהרבה מאשר דגימת חתך קפוא או קפוא.