שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות
24 בדצמבר 2010
מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפעיל באופן פוטו-כימי סוכן תגובה תלוי-אור נתון, כגון צבע פלואורסצנטי ב"כלוב" כימי (chemically caged), בעובר דג זבוב (zebrafish) חי ברזולוציה של תא בודד. דבר זה מושג על ידי הזרקה של סוכן תגובה תלוי-אור לעוברים בשלב של תא אחד המבטאים סימן גנטי חי, כדי לאתר ולכוון באופן מדויק לתאים רצויים. כשלב שני, העוברים גדלים ומוצמדים לאגרוז (aeros) בעל נקודת התכה נמוכה, המקבע את העובר החי.
בשלב הבא, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי למקם נקודת ציון טרנסגנית של פלואורסצנציה נראית. לאחר מכן, מפעילים את הסוכן המגיב לאור במישור מוקד רצוי, ועוקבים אחר מידת הפוטו-אקטיבציה. ניתן אז לעקוב אחר גורלן של התאים המסומנים שנוצרו בשלבים עובריים מאוחרים יותר.
ניתן להשתמש בפרוצדורה זו להפעלה של מגוון תרכובות ברזולוציה של תא בודד בדגימות חיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או מנורת פלאש, הוא שהיא מאפשרת הפעלה פוטו-כימית של רקמות עמוקות יחסית ברמה אקסית של מספר מיקרונים תוך רעילות פוטו-כימית נמוכה יחסית. עם זאת, השיטה המוצגת כאן משמשת למעקב אחר קווי תפרים והיא יכולה להחול על הפעלה פוטו-כימית של רכיבים מגוונים, דבר המאפשר בקרה ממוקדת על תהליכים התפתחותיים ופיזיולוגיים. בערב שלפני ההזרקה, הכינו מיכלי הזיווג והפרידו בין זכרים לנקבות של דגי זברה מקו טרנסגני המבטא סימן פלואורסצנטי גלוי.
בניסוי זה, השורה הטרנסגנית מבטאת GFP תחת שליטתו של פרומוטור N one נוירוגני. הפשרה של מנה של 5% dextran המשורשר ל-caged fluorescein ב-0.2 molar potassium chloride על קרח. an dilute את ה-caged fluorescein ב-0.2 molar potassium chloride לריכוז סופי של 1%. שמרו את ה-fluorescein על קרח והגנו עליו מאור. אפשרו להכלאות של דגי הזברה להתרבית, אספו את הביצים המופרות מיד עם השכבתן ושטפו אותן כפי שמתואר בטקסט. השתמשו בפיפטה פלסטית כדי להעביר עוברים בשלב תא אחד לצלחת הזרקה של 1% agar, שעליה הונח תווך E3 טרי, תחת מיקרוסקופ סטריאו.
השתמשו בפיפטה כדי לסדר את העוברים בתוך תכני המזרקים. שברו את קצהו של מחט הזרקה קפילרית שנמשחה לסיבוב ארוך. השתמשו בקצה של מיקרו-לוודר (micro loader) כדי למלא את המחט מאחור בכמות של כ-1 µL של caged fluorescein בריכוז 1%.
מקמו את המחט הטעונה בתוך מיקרו-מניפולטור המחובר למזרק מיקרו-פנאומטי. מזריקו לכל עובר שני עד שלושה ננו-ליטרים של caged fluorescein ישירות לציטופלזמה של התא. מזריקו לפחות 50 עוברים לכל ניסוי.
העבירו את העוברים המוזרקים לצלוחית פטרי המכילה מצע E3 טרי; דגרו בחושך בטמפרטורה של 28.5 °C עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. כדי למנוע פיגמנטציה, הוסיפו לעוברים 0.1% Phenyl threa לאחר 24 שעות, כהכנה להרכבת העוברים. צפו 15 עד 20 צלוחיות פטרי בקוטר 60 מילימטר בשכבה דקה של 1% Agar המומס במצע E2 טרי; כאשר ה-Agar התמצק, מלאו את הצלוחית במצע E2 תחת מיקרוסקופ סטריאו.
השתמשו בפינצטה חדה כדי להעביר את העוברי המוזרקים לצלחות מצופות. הימנעו מחשיפת העוברים לאוויר. שמרו מנה של 2%low melting point agarose במים.
בבלוק חימום בטמפרטורה של 72 °C. השתמשו בפיפטה בעלת קצה מלוט כדי להעביר עובר מצופה אחד בערך 150 µL של מדיום לפטרי dish בקוטר 60 מ"מ. הניחו נפח דומה של 2% Agros לצד העובר וערבבו במהירות את שתי הטיפות יחד כדי לקבל טיפת 1% Agros הומוגנית.
כוון את העובר כך שצדו הגבי (dorsal) פונה לעדשת העצמה. אפשר לאגרות (agarose) להתמצק ושקע את העובר המוטמע בתוך תווך E2. הנח את העובר שהורכב זה עתה על מחזיק פלטה תחת מיקרוסקופ פוטונים כפול המצויד בלייזר עם שולחן מסתובב רחב פס.
לפני התחלת תהליך הפעלה פוטו-כימית, רכשו סדרת תמונות מהקצה הוונטרלי ביותר ועד לקצה הדורסלי של הרקמה המבטאת באורך גל של 860 ננומטר. הגדירו את התמונות במרווחים של ששה מיקרון במישור Z. בחרו את מישור Z המיועד להפעלה פוטו-כימית והביאו אותו לפוקוס באמצעות GFP כסימן למקום.
אתרו את אזור העניין. צלמו תמונה בודדת באורך גל של 860 nanometers והשאירו אותה פתוחה בחלון נפרד לצורך יישור מדויק. חשוב שהלייזר ב-720 nanometers יהיה במצב של נעילת מוד (mode locked) לפני פתיחת תפריט ה-edit bleach.
השתמשו בתמונה שצולמה באורך גל של 860 nanometers כדי להגדיר את אזור העניין (ROI) להפעלה פוטונית. בחלון עריכת ההלבנה (edit bleach), כווננו את הספק הלייזר היחסי, מספר האיטרציות ומהירות הסריקה. לצורך הפעלה פוטונית, לחצו על bleach לאחר שהלייזר עצר, חזרו לאורך גל של 860 nanometers ורכשו תמונת מישור בודד כדי להעריך את העוצמה של החומר שהופעל פוטונית.
אסוף ערימת תמונות (image stack) כדי להעריך את ה-zsan או את העובי של הדומיין המופעל. בדרך זו, ניתן לקבוע באופן אמפירי את עוצמת הלייזר ואת משך החשיפה. להפעלה פוטו-כימית אופטימלית של כל שיבט (clone) או צילום צולב (cross photo), הפעל את כל העוברים שנותרו עבור הניסוי.
תחת תנאים אלה, גדלו את העוברי הפוטו-אקטיביים המורכבים בחושך בטמפרטורה של 28.5 °C במצע E2 המכיל 0.1% Phenyl thio urea, עד שיגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בסכין מנתח בעלת קצה מחודד כדי ליצור חריץ בצורת V ב-aros סמוך לעובר המורכב, כאשר תחתית החריץ פונה לכיוון ראשו של העובר. הניחו סט פינצטות סגורות בנקודה של החריץ.
פתחו בעדינות את הפינצטה כדי להפריד את ה-aros לאורך העובר ולשחרר אותו אל תוך התמיסה. לאחר שחרור כל עובר, השתמשו בפיפטת פסטור שעברה ליטוש באש כדי לאסוף אותו אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. בתוך מ hút כימיים, קבעו את העוברים ב-4% formaldehyde למשך שלוש שעות.
בטמפרטורת החדר, בצעו את תהליכי ההתייבשות, ההידרציה מחדש, הצביעה באמצעות alkaline phosphatase, נוגדן conjugated anti-fluorescein וכל השטיפות הנלוות כפי שמתואר בטקסט המצורף. הוסיפו 500 µL של תמיסת fast red מסוננת לעוברים. הדגרימו בחושך בטמפרטורת החדר, והחליפו את תמיסת צביעת ה-fast red בכל שעה, עד להשגת יחס האות לרקע הרצוי.
עצרו את תגובת הצביעה באמצעות שלושה שטיפות ב-PBST של חמש דקות כל אחת. בתוך מgraphHead פuming (fume hood), קבעו את הצבע ב-4% formaldehyde למשך 20 דקות. שטפו פעמיים ב-PBST למשך חמש דקות כל פעם.
שטפו עוברים שקופים דרך סדרה של מדרגי גליצרול בריכוזים של 25%, 50% ו-75% ב-PBS עד שכל עובר שוקע לתחתית המבחנה. אחסנו את העוברים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד התצפית במיקרוסקופ. כדי להכין את העוברים לתצפית, השתמשו במזרק של מיליליטר אחד כדי למרוח ארבע נקודות של 20 microliter של גריז סיליקון שקוף על זכוכית מיקרוסקופ, בפינות של צורה ריבועית בגודל 15 millimeter.
הניחו עובר בכ-200 µL של 75% glycerol בין טיפות השומן. הניחו לבידה מעל העובר. לחצו בעדינות את הלבידה ישירות למטה עד שהתמיס של ה-glycerol ימלא את החלל.
ניתן לשמור את הרווחים שבין טיפות הגריז שבהן הותקעו העובריים למשך מספר ימים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס לפני ההדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונה זו מציגה עובר דג זברה חי המבטא GFP תחת בקרה של פרומוטור neurogenin 1, שהוזרק בו צבע מעקב פלואורסצאין כלוב בשלב התא הבודד באמצעות השיטה המתוארת לעיל, בשלב של 3 עד 5 סומריטים.
אזור מובחן בתוך ה-brainin primordial הופעל פוטו-כימית באמצעות לייזר דו-פוטוני, ולאחר מכן ניתן היה לזהות את צבע המעקב פלואורסצאין (fluorescein) שהשתחרר. בעקבות הליך ההפעלה הפוטו-כימית, העובר דגור בטמפרטורה של 28.5 °C, ותאי מוח המכילים את הפלואורסצאין ששוחרר סומנו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית נגד פלואורסצאין בצבע אדום, 24 שעות לאחר ההפריה. שימו לב למספר המצומצם של התאים שסומנו. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הליך ההפעלה הפוטו-כימית תוך מספר שעות בודדות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשלוט בפרמטרים האופטימליים, כדי לאפשר הפעלה פוטו-כימית מדויקת ברזולוציה של תא בודד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה רב-פוטונית לסימון תאים חיים בעוברי דגי zebrafish, המאפשרת הפעלה פוטונית מדויקת של סוכנים המגיבים לאור. הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לעקוב אחר גורלם של תאים מסומנים בשלבים עובריים מאוחרים יותר.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מיקרוסקופיית רב-פוטונים מאפשרת חדירה אופטית עמוקה.
- הוא מפחית פוטוטוקסיות בהשוואה לשיטות דימוי מסורתיות.
- סימון תאים חיים הוא חיוני לחקר תהליכי התפתחות.
- עוברי דגי זברה הם מודל נפוץ למחקר בביולוגיה התפתחותית.
מטרת המחקר
- להפעלת סוכנים המגיבים לאור בעוברים חיים של דגי זברה.
- להשגת רזולוציה של תא בודד בטרגוט של תאים ספציפיים.
- לניטור גורלם של תאים מסומנים במהלך ההתפתחות העוברית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה של חומרים המגיבים לאור לעוברים בשלב התא הבודד.
- שימוש בסימן גנטי חי למיקוד מדויק.
- הטמעת עוברים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך קיבוע.
- מיקום פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
תוצאות עיקריות
- הפעלה פוטו-כימית מוצלחת של סוכנים במישורי המוקד הרצויים.
- מעקב אחר תאים שהופעלו בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות.
- הדגמה של יכולת ההסתגלות של השיטה למולקולות שונות המגיבות לאור.
- ביסוס פרוטוקול למחקרים עתידיים בדימות חי.
מסקנות
- מיקרוסקופיה רב-פוטונית יעילה לסימון תאים חיים.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכים ניסיוניים שונים.
- טכניקה זו משפרת את ההבנה של דינמיקה תאית במהלך התפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
שיטה זו מאפשרת בקרה ספאטיו-טמפורלית מדויקת של תרכובות ביו-אקטיביות בעוברי חולייתנים חיים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובצמצום סיכונים מנגנוניים בשלבי הגילוי המוקדמים. באמצעות פוטואקטיבציה של מולקולות כלואות (caged molecules) ברזולוציה של תא בודד, היא מספקת מדדים כמותיים לבחינת מסלולים ביולוגיים ולסריקה פנוטיפית. גישה זו מפחיתה את אי-הוודאות הביולוגית בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור הפרעה מולקולרית לתוצאות התפתחותיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הפעלה מדויקת של מולקולות סיגנלינג בהקשרים תאיים מוגדרים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור הפרעה מושרית-אור לשינויים פנוטיפיים ניתנים לצפייה in vivo.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במנגנון המטרה על ידי הדגמת קשרים סיבתיים בין הפעלה מולקולרית לגורל תאי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות ביסוס של פרדיגמות הפעלה נשלטות באור.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית, המאפשרות סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירות בין ניסויים.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת ספריות מגוונות של תרכובות כלואות (caged) מול מטרות תאיות מוגדרות בעוברים של דגי zebrafish.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שימוש בדגי זברה כמערכת רלוונטית למחלה כדי לגשר בין ממצאים in vitro לפיזיולוגיה in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר הערכה של השלכות הקישור למטרה ברקמות מתפתחות לפני המעבר למודלים של יונקים.
- ביטחון תחזיתי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי ויזואליזציה של השפעות במורד המסלול של מודולציה של נתיבים באורגניזמים שלמים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי תרכובות מובילות (lead identification), ומאפשרת בחינה מכניסטית לפני קמפיינים של סריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי הפעלת צמתים ספציפיים ברשתות סיגנלינג בדיוק סוב-צלולארי.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות פרוטוקולי פוטואקטיבציה סטנדרטיים המניבים תוצאות פלואורסצנטיות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של מידת ההפעלה וההפצה המרחבית, ובכך מקלה על השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מנגנונים ראשוניים להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מסלולי התפתחות שמורים בדגי zebrafish.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה פוטוכימית לשימוש חוזר, הישמה על תרכובות caged מגוונות במסגרת פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנון המטרה על ידי הפחתת העמימות בקשרים הסיבתיים בין ההתערבות המולקולרית לפנוטיפ.
- ערך תפעולי: מספק הפעלה סטנדרטית עם פוטו-טוקסיות נמוכה, התואמת לדימוי חי אורכי במודלים של חריית-חושה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת ראיות ישירות למודולציה של המטרה בהקשר פיזיולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, המבוסס על השלכות פנוטיפיות in vivo של הפעלת המסלול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פוטונים כפולים (two-photon microscopy), בבריולוגיה של דגי זברה ובטיפול בתרכובות כלובות (caged compounds).
- תלוי בגישה ללייזרים פולסטיים הניתנים לכיוונון ולמערכות גילוי פלואורסצנציה לצורך פוטו-אקטיבציה וקריאה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע העוברים, השבטתם ודימויים בין משתמשים ואתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור תרכובות כלובות שונות, כולל ממיסות, יעילות טעינה וקינטיקה של שחרור (uncaging kinetics).
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של חיוניות העוברים לאחר האקטיבציה והצורך בדגירה בחושך כדי למנוע תגובות פוטו-כימיות לא רצויות.
