Name: שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: חקור שימוש במיקרוסקופיית שני פוטונים להפעלת סוכנים רגישים לאור בדג הזברה ברזולוציית תא בודד. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר גורל התאים המסומנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה הן בשל ג&#39;ניה ברודסקי עבור דמות גרפיקה, ויאצ&#39;סלב Kalchenko, דאגלס לוץ, וליאוניד רויטמן ייעוץ סיוע טכני עם משחררות רפרוף שני הפוטונים, מעיין טהור לבין סולימאן Elsadin לקבלת סיוע טכני; Uwe Strahle עבור באדיבות מתן קו כתב neurogenin1 ו עמוס גוטניק הערות על כתב היד הזה. המחקר במעבדה לבקוביץ נתמך על ידי הקרן הגרמנית ישראלית (מספר המענק 183/2007); הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 928/08) ואת הארייט &amp; מרסל דקר קרן. GL הוא מופקד הקתדרה פיתוח קריירה Tauro במחקר ביו.

<ol><li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li>
<li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li>
<li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+precursors+of+glutamate%3A+synthesis%2C+photochemical+properties%2C+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li>
<li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li>
<li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li>
<li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li>
<li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li>
</ol>

Photo-activatable תרכובות הם מולקולות שתפקידו רעולי פנים עד שהם מוארים עם אורך גל מסוים (UV בדרך כלל), גרימת תגובה פוטו הממירה את מולקולות למצב פעיל מבחינה ביולוגית או כימית. בדיקות אלה מספקים כלים חזקים מאוד בתחום המחקר בביולוגיה של התא, מאז ההפעלה ניתן לשלוט בדיוק temporally מרחבית על ידי הגבלת החשיפה שלהם לאור. היתרון המשמעותי של מיקרוסקופיה רב פוטון הוא חדירה עמוקה יחסית אופטיים phototoxicity ספציפי מופחת. במ...

<table><tbody><tr><td>פלואורסצאין כלוא ב-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) מצומד לדקסטראן (דקסטראן 10,000 MW, אניוני)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>גששים מולקולריים</td></tr><tr><td>אגרוז עבור תעלת הזרקה ופלטות מצופות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בעירה דקה עם פילמנט</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>טיפ למילוי מיקרו (Microloader tip)</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>פיקופמפ פנאומטית</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>פנילתיוריאה (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז בנקודת התכה נמוכה להרכבת עוברים</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>פרגמנטים של Fab אנטי-פלואורסצאין- alkaline phosphatase (AP)</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

שני הפוטונים מבוסס photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation של תרכובות מטרה בכל יצור חי הוכיחה גישה ערך לחקור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון ההתפתחות העוברית, איתות הסלולר ופיזיולוגיה מבוגר. מבחינה זו, השימוש במיקרוסקופ רב פוטון מאפשרת photoactivation כמותי של סוכן ניתנה תגובה אור רקמות עמוק ברזולוציה של תא בודד. כמו עוברי דג הזברה הם שקוף אופטית, הפיתוח שלהם יכול להיות פיקוח in vivo. תכונות אלה הופכות את דג הזברה אורגניזם מודל מושלם לבקרת פעילות של מגוון רחב של חומרים כימיים חלבונים על ידי אור ממוקד. כאן אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים לגרום הפעלת והעמסת בכלוב כימית, אשר בתורו מאפשר לנו לעקוב אחר גורלו של תא חי עוברי דג הזברה. אנו משתמשים העוברים להביע ציון דרך גנטי חיים (GFP) לאתר למקד את כל התאים של עניין. הליך זה יכול לשמש באותה מידה להפעלת מדויק המושרה אור של חלבונים, הורמונים, מולקולות קטנות ותרכובות אחרות בכלוב.

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

פוטו-אקטיבציה של תרכובות מטרה באורגניזם חי הוכחה כגישה בעלת ערך לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, כגון התפתחות עוברית...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפעיל באופן פוטו-כימי סוכן תגובה תלוי-אור נתון, כגון צבע פלואורסצנטי ב"כלוב" כימי (chemically caged), בעובר דג זבוב (zebrafish) חי ברזולוציה של תא בודד. דבר זה מושג על ידי הזרקה של סוכן תגובה תלוי-אור לעוברים בשלב של תא אחד המבטאים סימן גנטי חי, כדי לאתר ולכוון באופן מדויק לתאים רצויים. כשלב שני, העוברים גדלים ומוצמדים לאגרוז (aeros) בעל נקודת התכה נמוכה, המקבע את העובר החי.בשלב הבא, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי למקם נקודת ציון טרנסגנית של פלואורסצנציה נראית. לאחר מכן, מפעילים את הסוכן המגיב לאור במישור מוקד רצוי, ועוקבים אחר מידת הפוטו-אקטיבציה. ניתן אז לעקוב אחר גורלן של התאים המסומנים שנוצרו בשלבים עובריים מאוחרים יותר.ניתן להשתמש בפרוצדורה זו להפעלה של מגוון תרכובות ברזולוציה של תא בודד בדגימות חיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או מנורת פלאש, הוא שהיא מאפשרת הפעלה פוטו-כימית של רקמות עמוקות יחסית ברמה אקסית של מספר מיקרונים תוך רעילות פוטו-כימית נמוכה יחסית. עם זאת, השיטה המוצגת כאן משמשת למעקב אחר קווי תפרים והיא יכולה להחול על הפעלה פוטו-כימית של רכיבים מגוונים, דבר המאפשר בקרה ממוקדת על תהליכים התפתחותיים ופיזיולוגיים. בערב שלפני ההזרקה, הכינו מיכלי הזיווג והפרידו בין זכרים לנקבות של

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

חקור שימוש במיקרוסקופיית שני פוטונים להפעלת סוכנים רגישים לאור בדג הזברה ברזולוציית תא בודד. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר גורל התאים המסומנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

גלה סרטונים נוספים