חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana
29 במאי 2010
הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.
לבחינת תגובות פיטוכרום בסוגים ספציפיים של תאי צמח. השתמשו במלכודת מחזק (enhancer trap) GAL 4G FP ובקווי טרנסגנים U-A-S-B-V-R בהכלאה כדי להפיק צמחים חסרי פיטוכרום. פרוטופלסטיים של עלים מבודדים מצמחים שהם צאצאים של הכלאה בין U-A-S-B-V-R ל-GA 4G FP.
בשלב הבא, הפרוטופלסטים מומינו באמצעות FACS כדי לבודד פרוטופלסטים שליליים ל-GFP ופרוטופלסטים חיוביים ל-GFP לדגימות נפרדות, והפרוטופלסטים המבודדים נותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר. כדי לאשר את איסוף הפרוטופלסטים החיוביים ל-GFP, RNA מופק מהפרוטופלסטים וננותח ספקטרלית. שלום, אני Sanka Pivar מהמעבדה של BARDA Montgomery במעבדה למחקר צמחים של מחלקת האנרגיה באוניברסיטת מישיגן סטייט.
היום נדגים בפניכם פרוצדורה לבידוד פרוטופלסטים מעלים של Atrop ANA עבור מיון תאים מבוסס פלואורסצנציה (FACS) וניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תגובות תלויות פיטוכרום הספציפיות לרקמה ולאיבר. אז בואו נתחיל.
קו ה-Arabidopsis ANA ששימש בהליך זה נוצר בגישת מלכודת מחזקים (enhancer trap) דו-חלקיים. אחד ההורים הוא מספרייה של קווי מלכודת מחזקים בעלי דפוסי ביטוי שונים של gal. ההורה הראשון מבטא גם GFP תחת בקרתו של רצף הפעלה במעלה הזרם (upstream activation sequence) או UAS.
בקיצור, גורם השעתוק GAL4 מפעיל כל גן המונח תחת השליטה של ה-UAS. בהורה 1, GAL4 מפעיל את GFP; הורה 1 הוקץ עם הורה 2, ובאב ה-2, הגן BVR נמצא תחת השליטה של GAL4 באמצעות UAS.
הקו שנוצר מההכלאה הוא U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. בקווי ההורה, הביוסינתזה של הכרומופור של הפיטוכרום מתקדמת מ-LA דרך heme ל-biver, המקוצר כ-bv. אך בצאצאים, תוצר הגן BVR חוסם את הביוגנזה של הכרומופור של הפיטוכרום על ידי חיזור של הפרקורסור BV. קו צאצאים זה, שהפועל כ-enhancer trap עבור BVR, אומת וניתן להשתמש בו כדי לבחון כיצד הפחתה ברמות הפיטוכרום הפעיל משפיעה על רקמות צמחים שונות.
התחל את ההליך על ידי הכנת קרקע ועציצים לגידול צמחים לצורך הפקת פרוטופלסטים מעלים. זרע כ-2000 זרעים שעברו סטריליזציה לדגימה לניסוי בקרקע בעציצים. הוסף מים לתחתית המגש המכיל את העציצים וכסה את המגש כולו בניילון נצמד.
גדלו את הצמחים במשך חמישה שבועות תחת תאורה לבנה בטמפרטורה של 22 degrees Celsius ובלחות של 70%humidity. לאחר חמישה עד שישה ימים ראשונים, לאחר שאישור הנבטה של הזרעים הושג, הסירו את עטיפת הפלסטיק מהמגש. כדי לבודד פרוטופלסטים, הכינו תחילה באפר TEX; עבור ליטר אחד של באפר, שקלו GA's B five salts, MES, calcium chloride, ammonium nitrate ו-sucrose.
המס את הרכיבים באופן מלא בכ-900 מיליליטר של מים מזוקקים דה-יוניזציה (DD H2O), והב करें את ה-pH ל-5.7 באמצעות KOH בריכוז 1M. לאחר מכן, השלם את הנפח הסופי לליטר אחד ובצע סטריליזציה באמצעות סינון.
בשלב הבא, אספו עלים ירוקים ובריאים מהצמחים. אספו כ-250 milliliters של עלים דחוסים באופן רופף בתוך כוס כימית. שטפו את העלים עם 40 milliliters.
שטוף ארבע פעמים ב-DD H2O ולאחר מכן שטוף פעמיים ב-DD H2O סטרילי באמצעות סכין מנתח מספר 20. חתוך את העלים לרצועות דקות וחלק את הרקמה באופן שווה לשני מבחנות פלסטיק סטריליות של 50 מ"ל. תערובת עיכול עלים בריכוז 1x מוכנה על ידי הוספת מנה של 5 milliliters של תמיסת מלאי 10x, שהוכנה על ידי המסה של 2% משקל לנפח mazy R 10 ו-4% משקל לנפח cellulase on azua R 10 בתוך TEX buffer, ל-45 milliliters של TEX buffer טרי.
הוסיפו כ-25 milliliters של תמיסת עיכול עלים בריכוז one x. ערבבו עם רצועות העלה בכל מבחנה כך שכל רקמת העלה תהיה מכוסה. המשיכו לשאיבת ואקום כדי להחדיר את תמיסת העיכול לרקמת העלה.
ערבבו במבחנות פתוחות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות דסיקטור ואקום המחובר למשאבת מים. השאירו את מכסי המבחנות המכילים את רקמת העלה ותערובת פירוק העלה עטופים בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. המשיכו לדגירה של שלוש שעות בטמפרטורת החדר על שייקר (rocker) עם ניעור עדין.
לאחר שלוש שעות, הגבירו את מהירות הנעורה למשך שתי דקות כדי לשחרר את הפרוטופלסטים. סננו את תגלי הפרוטופלסטים הגולמיים דרך שתי שכבות של גזה סטרילית כדי להסיר פסולת, ואספו את התסנין לכלי זכוכית סטרילי. סננו את התסנין דרך רשת ניילון סטרילית של 100 micrometer אל תוך צלחת פטרי סטרילית.
אסוף את הנוזל שעבר סינון והעבר אותו למבחנה סטרילית חדשה בנפח 50 milliliter. השתמש בכ-15 milliliters של תמיפת TEX טרייה כדי לשטוף את פטרי הפטרי סטרילית ואסוף כל פרוטופלסט שנדבק לפני השטח. סבב את הנוזל שסינונת בצנטריפוגה ב-100 times gravity בטמפרטורה של 10 degrees Celsius למשך 15 דקות, באמצעות צנטריפוגה עם סלסילאות נדנדות (swing bucket centrifuge), כאשר ההאצה מוגדרת על שש והבלימה על אפס עם סיום הסבב.
השתמשו בפיפטת זכוכית סטרילית באורך תשעה אינץ' המחוברת למשאבה פריסטלטית כדי להסיר כ-25 עד 30 מיליליטר מהנוזל שמתחת לשכבת הפרוטופלסטים הצפים, המכיל שאריות ומשקעים, מבלי להפריע לשכבת הפרוטופלסטים הצפים, כך שיישארו כ-10 עד 50 מיליליטר. לאחר הסרת המשקעים, הוסיפו באפר TEX טרי לנפח סופי של 40 מיליליטר. תוך כדי רספנסיה עדינה של הפרוטופלסטים, חזרו על פעולת הסרת השאריות והרספנסיה של הפרוטופלסטים הצפים שנותרו.
פעמיים נוספות כדי להסיר כמה שיותר פסולת תאית. זמן הסבוב בצנטריפוגה מוקצץ ל-10 דקות בחזרה הראשונה ולחמש דקות בחזרה האחרונה. לבסוף, השתמש בפ pipette העברה סטרילית של 1 milliliters כדי לשאוב את הפרוטופלסטים הצפים ולהעבירם למבחנה חדשה של 15 milliliters.
עברו ישירות למיון לפני תחילת המיון. בחנו את הפרוטופלסטים באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CLSM) בקצרה, תוך שימוש בלייזר של 488 nanometer לעירור, כדי לאשר את שלמות הפרוטופלסטים ואת נוכחות של פלואורסצנציית GFP במאגר הפרוטופלסטים. יש להסיר פסולת מינימלית כדי למנוע סתימה של פיית המיון; מיינו את ה-PROTOPLASTS המבודדים בבופר TEX באמצעות FACS.
באמצעות פיית נחיר של 200 micrometer בראש מיון מאקרו, בקצבי אירועים שבין 6,000 ל-15,000 ובלחץ מערכת של כ-9 PSI בהתאם לפרוטוקול מותאם, השתמש ב-PROTOPLASTS מסוג wild type שאינם GFP כדי לקבוע את ספי autofluorescence לאיסוף של protoplasts חיוביים ל-GFP, תוך מיון התאים באמצעות לייזר argon הפועל בהספק של 100 milliwatts על קו argon של 488 nanometer. לזיהוי פלואורסצנציית GFP, השתמש במסנן band pass של 530/30 לאחר איסוף ה-protoplasts החיוביים ל-GFP. לבסוף, בחן את ה-protoplasts הממוינים תחת המיקרוסקופ, כפי שבוצע לפני תחילת המיון, לצורך פרופיל ביטוי.
הפיקו RNA כולל מהפרוטופלסטים הממוינים. לאחר מכן ניתן להכין cDNA לצורך היברידיזציה. ה-cDNA מועבר לאחר מכן להיברידיזציה במערכי גנום מלאים מסוג TH one OPSYS Ametri.
להלן מספר תוצאות מייצגות של מיון פרוטופלסטים עבור ביקרת סוג הבר (wild type). פרוטופלסטים אינם מראים אותות כלשהם בשער ה-GFP החיובי. עם זאת, אותות GFP חיוביים זוהו עבור דגימות פרוטופלסטים שהופקו מקווי GAL 4G FP לפני המיון; פרוטופלסטים שהופקו מצמחי סוג בר אינם מראים פלואורסצנציית GFP בניתוחי CLSM.
בעוד שתאי פרוטופלסטיקה שאינם מביעים פלואורסצנציית GFP וכאלו המביעים אותה מזוהים בדגימות פרוטופלסטים מקווי GAL 4G FP לאחר הטיפול, ניתוח CLSM מעיד על בידוד של פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP מקו gal 4G FP מייצג. ניתן להפיק RNA מפרוטופלסטים מבודדים, ומיליליטר אחד מספק כמות RNA מספיקה לזיהוי באמצעות פלואורו-ספקטרומטריה. כעת הדגמנו כיצד לבודד פרוטופלסטים מעלים מ-atopy ANA לצורך מיון תאים מבוסס פלואורסצנציה (FACS) וניתוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בעדינות בטיפול בפרוטופלסטים ולהגביל את חשיפתם לאור. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הבסיס המולקולרי של תגובות פיטוכרום ספציפיות למרחב בצמחים, באמצעות שימוש בקווי טרנסגנים עם חסרים בפיטוכרום. המחקר עושה שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (Fluorescence-Activated Cell Sorting) כדי לבודד תאים ספציפיים ובבדיקות מיקרו-מערך (microarray) כדי לזהות גנים רלוונטיים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- גנטיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- פיטוכרומים הם חלבונים רגישים לאור המווסתים את התפתחות הצמח.
- הבנת תגובות ספציפיות למרחב יכולה להעשיר את הידע על הסתגלות צמחים.
- צמחים טרנסגניים מספקים מודל לבדיקת תפקוד גנים ברקמות ספציפיות.
- מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (Fluorescence-Activated Cell Sorting) מאפשר בידוד מדויק של תאים.
מטרת המחקר
- לבחינת תגובות פיטוכרום בסוגי תאי צמחים ספציפיים.
- לזיהוי גנים המעורבים בתגובות פיטוכרום ספציפיות מרחבית.
- לניצול טכניקות מיון מתקדמות לצורך ניתוח תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת קווים טרנסגניים חסרי פיטוכרום.
- בידוד פרוטופלסטים מרקמות צמחים.
- מיון פרוטופלסטים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- ניתוח של פרוטופלסטים מבודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של פרוטופלסטים חיוביים ושליליים ל-GFP.
- הפקת RNA מפרוטופלסטים לצורך ניתוח המשך.
- זיהוי גנים ספציפיים הקשורים לתגובות פיטוכרום.
- אישור יעילותן של טכניקות המיון שנעשה בהן שימוש.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי הבסיס הגנטי של תגובות פיטוכרום.
- צמחים טרנסגניים מהווים מודלים יעילים לחקר תפקודי גנים ספציפיים לרקמה.
- מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (Fluorescence-Activated Cell Sorting) הוא כלי בעל ערך לניתוח תאי צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת סיגנלינג של פטורצפטורים הספציפיים לרקמה ולאיבר מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתהליך התיקוף של מטרות עבור פלטפורמות ביו-פרמצבטיות מבוססות צמחים. גישה זו תומכת בביטחון חזוי בזיהוי רשתות בקרה גנטיות בעלות רזולוציה מרחבית, המשפיעות על פנוטיפים אדפטיביים. השיטה מספקת גשר תרגומי מפנוטיפיקה מולקולרית להבהרה של מסלולים בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד פוטורצפטורים ספציפיים לרקמה כדי להבהיר גנים סיבתיים במסלולי פוטומורפוגנזה.
- ערך תפעולי: עושה שימוש בביטוי של BVR המונע על ידי enhancer-trap כדי להשיג השבתה של פיטוכרום ספציפית לאיבר עבור מידול מדויק של אובדן תפקוד (loss-of-function).
- ערך ניבוי: מקשר בין דלדול מקומי של כרומופור לתגובות שעתוק במורד המסלול, ובכך תומך בתיעדוף מטרות מבוסס היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: בידוד של פרוטופלסטים חיוביים ל-GFP בסיוע FACS מאפשר מיפוי ביטוי ספציפי לסוג התא לצורך גילוי סמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי הכנת פרוטופלסטים, מיון והפקת RNA לקבלת תוצאות תמלול הדירות.
- יכולת הרחבה: יצירת דגימות כמותיות המוכנות למערכים של מיקרו-מערכים (microarray) מאוכלוסיות תאים מוגדרות, לתמיכה במיניאטוריזציה של בדיקות ובריבוי (multiplexing).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין הפרעה לפיתוכרום הספציפית לסוג תא לבין תוצרים פנוטיפיים ברמת האיבר ב-Arabidopsis.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מזהה מטרות פוטנציאליות במורד המתווכות תגובות אור ספציפיות מרחבית, ובכך מפחיתה עמימות בפירוש של רשתות הסיגנלינג.
- ביטחון חיזוי: תומכת באימות צולב של נתונים גנטיים ומולקולריים כדי לחזק את הרלוונטיות של המטרה למחלה במערכות מודל.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור גנומיקה תפקודית ברזולוציית תא, לפני מאמצים לזיהוי מובילים (leads) במערכות המופקות מצמחים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של ויסות גנים מרחבי באמצעות שיבוש ממוקד של פיטוכרום בסוגי תאים מוגדרים.
- סריקה: מייצרת אוכלוסיות פרוטופלסטים סטנדרטיות, ממוינות פלואורסצנטית, המתאימות לפרופיל תעתוק בעל תוכן גבוה.
- אנליזה: מספקת קריאות של ביטוי גנים מבוססות מיקרו-מערך (microarray), המאפשרות ניתוח השוואתי של תנאים ודירוג מטרות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הפרעות מולקולריות בתאים ספציפיים לבין פנוטיפים ברמת הרקמה, ובכך תומכת בתיקוף של מסלולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר של מלכודת-מגבירים (enhancer-trap)/FACS לחקירה של מסלולי איתות ספציפיים לסוגי תאים על פני הקשרים התפתחותיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באותות של פוטורצפטורים על ידי פתרון אתר הפעולה ותגובות ספציפיות לסוג התא.
- ערך תפעולי: מאפשר בידוד הדיר באופן הדיר של אוכלוסיות תאים מוגדרות מולקולרית לצורך אנליזות בקנה מידה של אומיקס.
- ערך אסטרטגי: משפר את רמת הביטחון במטרה על ידי קישור הפרעה גנטית לתפליות תעתוקיות בעלות רזולוציה מרחבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של גנים מועמדים במסלולים מווסתים באור לצורך תיקוף המשך.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית של צמחים, יצירת קווים טרנסגניים וטיפול בפרוטופלסטים.
- תלוי במכשור FACS עם גודל נחיר והגדרות לייזר מתאימות למיון תאי צמחים.
- מחייב הכנה סטנדרטית של באפר TEX ותהליכי עבודה תחת בקרה של תאורה כדי לשמור על חיוניות הפרוטופלסטים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת מערכת ה-enhancer-trap לדיווחים (reporters) אחרים המונעים על ידי פרומוטורים או לגנים אפקטוריים.
- מוגבל על ידי תנובת הפרוטופלסטים ואיכות ה-RNA מדגימות ממוינות, דבר המשפיע על הרגישות של הפרופיילינג בשלבים הבאים.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:47
Introduction
1:22
Producing the GAL4 Enhancer-trap Line
2:37
Plant Growth and Leaf Protoplasts Isolation
7:18
Protoplast Sorting by Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
8:47
Leaf Protoplasts Isolation and Sorting by FACS Representative Results
9:38
Conclusion
