כרוני סלמונלה עכבר אינפקטד דגם

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ביסוס של מודל עכברים עם זיהום כרוני של salmonella. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תמיסת salmonella. השלב השני של הפרוצדורה הוא מתן streptomycin לעכברים באמצעות gavage, ולאחריו מתן salmonella או מתן streptomycin בלבד.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא בידוד של salmonella מצואה של עכברים, וגילוי זיהום ב-salmonella במעי העכבר באמצעות מצעי BL chroma. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא מעקב ותיעוד של מסת הגוף של העכברים, וסימון שינויים בחיוניות בעקבות הזיהום ב-salmonella. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שניתן להשריש זיהום ב-salmonella במעי של עכברים שקיבלו salmonella באמצעות gavage.

שלום, אני מישל פ' מהמעבדה של ד"ר ג'ונסון במחלקה לרפואה באוניברסיטת רוצ'סטר. אני גם ממעבדת סאן, ואני Y ממעבדת סאן. היום נדגים לכם פרוצדורה להקמת מודל של מסה מזוהמת ב-Alytic Lennar.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את העברת אותות באינטראקציה בין המארח לחיידקים ואת התהליכים המובילים להיווצרות גידולים סרטניים. בואו נתחיל. לפני התחילת הניסוי, הכינו מספיק צלחות של מצע Luria-Bertani או LB broth עבור כל זן של salmonella לשימוש לאורך כל הניסוי.

ניתן לשמור את הפלטות בקירור למשך מספר חודשים. לאחר מכן, הכין תרבית של salmonella. הוצא מבחנה של מאגר salmonella קפוא במינוס 80 מעלות צלזיוס והנח לה להפשיר על משטח העבודה לצורך זריעה של salmonella.

חטאו לולאת הזרקה בלהבה וטבלו אותה במאגר החיידקים המופשר. הניחו את הלולאה בתנועות זיג-זג על השליש העליון של פלטת ה-LB. חטאו שוב את הלולאה בלהבה וסובבו את הפלטה.

הניעו את הלולאה בתנועות זיגזג כדי לחצות את הפסיים הקודמים ולהפיץ את החיידקים על השליש השני של המצע. חזרו על הפעולה פעם נוספת. עקרו שוב את הלולאה בלהבה.

אין לאפשר ללולאה לחדור אל תוך האגר. אפשרו למושבות לגדול על ידי אחסון הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. אם הפעולה בוצעה נכון, צלחת הסלמונלה אמורה להניב מושבות בודדות לפחות באחד הסקטורים.

ביום למחרת. בחרו קלון מלוחית ה-LB באמצעות קיסם סטרילי או לופ בקטריאלי והעבירו אותו לשבעה מיליליטר של LB בתוך מבחנה בנפח 12 מיליליטר. נערערו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך כשבע שעות.

השתמש ב-0.05 milliliters מתרבית זו כדי להחדיר ל-50 milliliters של LB בתוך מבחנת Falcon. דגרי את התרבית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא ניעור למשך כ-18 שעות.

סובב את תרבית החיידקים של 50 מיליליטר שגדלה בן לילה בטמפרטורת החדר ב-5,000 RPM למשך 10 דקות והשלך את העילוי. לאחר מכן, הוסף למבחנה 1.5 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של הנק (Hank's buffered salt solution) או HBSS כדי לסבסב את החיידקים, או יחס של 100 חלקים LB ל-3 חלקים HBSS. לאחר מכן, השלם את הנפח הכולל ל-15 מיליליטר באמצעות HBSS, או יחס של 1 ל-10 של LB ל-HBSS.

כל עכבר דורש 100 µL של תרבית סלמונלה מדוללת, או בין 1×10⁶ ל-1×10⁸ יחידות יוצרות מושבות (colony forming units) לפני תחילת הגavage. יש להסיר מים ומזון מהעכברים ארבע שעות לפני הניסוי. לאחר מכן, הכין תמיסת סטרהפטומייצין מיד לפני הגavage על ידי דילול של 7.5 mg אבקת סטרהפטומייצין ב-100 µL של HBSS. עבור כל עכבר המוזרק, ודא כי הכנת נפח נוסף כדי לפצות על אובדן חומר לפני הגavage של העכבר.

ראשית, הכינו מחט הזנה עם 100 µL של תמיסת סטפטומיצין. הוציאו את העכבר הראשון מהכלוב כדי לבצע את הזנה בגרבז' (gavage) והחזיקו את העכבר כשהוא פונה לעבר משטח המעבדה. אחזו בחוזקה בעור מעל כתפו של העכבר באמצעות האגודל והאמה, ומתוחו את הראש והצוואר בעזרת האצבע המורה כדי ליישר את הוושט.

הכווינו את קצה הכדור של מחט ההזנה לאורך תקרת הפה לעבר הצד הימני של החלק האחורי של הלוע. לאחר מכן, העבירו אותה בעדינות למטה אל תוך הוושח והזריקו 100 µL של תמיסת streptomycin. לא אמורה להרגיש התנגדות.

חזור על תהליך זה עבור כל העכברים בניסוי ובקבוצת הביקורת הנמצאים בניסוי. כ-20 שעות לאחר ה-strp de m והזנה בגרגרים (gavage), וארבע שעות לפני ההזנה ב-salmonella, הסר את המים והמזון מהעכברים שיקבלו את ה-salmonella בבליעה. בצע הזנה לכל עכבר באותו אופן כפי שנעשה קודם לכן, באמצעות 100 µL של תמיסת salmonella ב-HBSS.

לאחר הגavage, העבירו כל עכבר לכלוב חדש כדי להתחיל באיסוף הצואה. החל משמונה שעות בקירוב לאחר ה-gavage, הסירו את הצואה מהכלוב מיד לאחר הפרשתה. אספו 100 milligrams של צואת עכבר כדגימה ניסיונית.

אספו דגימות מדי יום או מדי שבוע, בהתאם למשך המחקר, לצורך אנליזה של סלמונלה בצואה. העבירו את דגימת הצואה לפרוטוקול של 1.5 milliliter של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה עם 1 milliliter של PBS, ערבבו במערבל Vortex בעוצמה וסובבו בצנטריפוגה במשך 10 דקות במהירות של 800 RPM. העבירו את העילוי למבחנה נקייה של 1.5 milliliter וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 6,000 RPM למשך חמש דקות.

שפכו את הנוזל העליון והוסיפו 200 µl של PBS למשקעים, וערבבו באמצעות וורטקס (vortex) כדי להחזירם לתמיסה. לאחר מכן, גלו את ה-salmonella באמצעות צלחת BB l roag. השתמשו ב-10 עד 100 µl של תמיסת צואה לכל צלחת, והפיצו אותה על הצלחת כפי שמוצג בחלק שני.

מיקויי הסלמנלה (salmonella) מופיעים בצבע בורגנדי בשל הבדלים מטבוליים בנוכחות כרומוגנים נבחרים. ספרו את מושבות הסלמנלה על הפיתח כדי להשוות את רמת הזיהום בין עכברים בודדים. בהליך ניסויי זה השתמשנו בעכברי C 57 black six נקבות, נקיים מפתוגנים ספציפיים, בני שש עד שבעה שבועות.

עכברים הוחדרו בסאלמונלה ובסטרפטומייצין בתוספת HBSS. קבוצת ביקורת של עכברים קיבלה גבג' (gavage) של סטרפטומייצין בלבד. זני הסאלמונלה שבהם נעשה שימוש כוללים את זן הפרא של salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, זן מוטנטי לא פתוגני של סאלמונלה, ושלושה זני FPC ממעבדתו של ד"ר ג'יימס מדררה, הנושאים את הגן AAV R age הקשור לאלימות בתוך פלסמיד בעתק נמוך, PSKW 29. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לזהות קולוניזציה של salmonella tyrian במעי העכבר.

זיהום סלמונלה כרוני נמדד באמצעות ניתוח צואה, ודגימות של משקל גוף ורקמה מעوية נאספו לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית. בדרך כלל, ירידה במשקל הגוף ומוות מתרחשים בתוך ארבעה שבועות לאחר ההדבקה. שיעורי ההישרדות ארבעה שבועות לאחר ההדבקה מוצגים כאן.

ברגע שעכברים שורדים ארבעה שבועות לאחר ההדבקה, הם עולים במשקל הגוף ושיעורי התמותה פוחתים ב-23 השבועות הנותרים. באופן כללי, למעלה מ-65% מהעכברים שהודבקו בזנקי salmonella מסוג FSY fsy, A VRA null או fsy. A VRA heterozygote יכולים לשרוד מעל שישה חודשים עם זיהום salmonella מתמשך במעי.

לאחר הזיהום החריף, השורדים עדיין נשאו את השלמונלה, אשר ניתן היה לזהות שישה חודשים לאחר הזיהום באמצעות השיטה המתוארת בפרוטוקול זה. ניתוח אימונופלורסצנציה של דגימות רקמה ממעי עכבר מראה פלישה של שלמונלה למניית המעי 27 שבועות לאחר הזיהום. בתמונה זו, הגרעינים נצבעים בכחול והשלמונלה המזהמת מופיעה בירוק.

כפי שניתן לראות בקבוצת הביקורת, אין צביעה בירוק בהיר, דבר המעיד על היעדר התנחלות של salmonella. לעומת זאת, בעכברים שהודבקו ב-salmonella בשבוע 27 לאחר ההדבקה, נצפית צביעה בירוק בהיר ברירית המעי. דבר זה מעיד על התמדה של זיהום salmonella בעכברים שעברו טיפול מקדים בסטריפטומייסין.

הרגע הדגמנו כיצד להשרות זיהום כרוני של some במודל עכברים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין תרבית טרייה עבור garage, להשתמש במיומנויות garage נכונות ולגלות את קיומו של ANA כדי לוודא שמודל הניסוי שלכם עובד. וזהו.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.