כרוני סלמונלה עכבר אינפקטד דגם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבסס מודל של עכבר עם זיהום כרוני ב-salmonella. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תמיסת salmonella. השלב השני של הפרוצדורה הוא מתן streptomycin לעכברים באמצעות gavage, ולאחריו מתן salmonella או מתן streptomycin בלבד.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא בידוד של salmonella מצואה של עכברים, וזיהוי זיהום ב-salmonella במעי העכבר באמצעות מצעי BL chroma. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא מעקב ותיעוד של מסת הגוף של העכבר וסימון שינויים בחיוניות בעקבות הזיהום ב-salmonella. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שניתן להשריש זיהום של salmonella במעיהם של עכברים שקיבלו salmonella בגרגור (gavage).

שלום, אני מישל פ' מהמעבדה של ד"ר ג'ונסון במחלקה לרפואה באוניברסיטת רוצ'סטר. אני גם ממעבדת סאן, ואני Y ממעבדת סאן. היום נדגים לכם פרוצדורה להקמת מודל של מסה מזוהמת ב-Alytic Lennar.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור את העברת האותות באינטראקציה בין המארח לבקטריה ואת התהליך של קרצינוגנזה. אז בואו נתחיל. לפני התחילת הניסוי, הכינו מספיק צלחות מצע LB או ציר Luria-Bertani עבור כל זן של salmonella לשימוש לאורך כל הניסוי.

ניתן לשמור את הצלחות בקירור למשך מספר חודשים. בשלב הבא, הכין תרבית סלמונלה. הוצא מבחנה של מאגר סלמונלה שהוקפא במינוס 80 מעלות צלזיוס והנח לה להפשיר על משטח העבודה לצורך זריעת הסלמונלה.

חטאו לולאת הזרקה בלהבה של מבער וטבלו אותה במלאי החיידקים שהופשר. הניעו את הלולאה בתנועות זיגזג הלוך וחזור בשליש העליון של צלחת ה-LB. חטאו שוב את הלולאה בלהבה וסובבו את הצלחת.

בצעו תנועות זיגזג בלולאה כך שתחצה את הפסיקות הקודמות ותפזר את החיידקים על השליש השני של הצלחת. חזרו על הפעולה פעם נוספת. שרפו שוב את הלולאה.

אין לאפשר ללופ לחדור אל תוך האגר. יש לאפשר למושבות לגדול על ידי אחסון הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. אם הפעולה בוצעה נכון, פלטת הסלמונלה אמורה להניב מושבות בודדות לפחות באחד מהמגזרים.

ביום למחרת. בחר קולוניה מלוחית ה-LB באמצעות קיסם סטרילי או לולאת חידוד והעבר אותה ל-7 mL של LB בתוך מבחנה של 12 mL. נקנוע את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך כחמש שעות.

השתמש ב-0.05 milliliters של תרבית זו כדי להנחית ב-50 milliliters של LB בתוך מבחנה מסוג Falcon. דגור ב-37 degrees Celsius ללא ניעור למשך כ-18 שעות.

סובב את תרבית החיידקים של 50 milliliter מהגידול למשך לילה בטמפרטורת החדר ב-5,000 RPM למשך 10 דקות והסר את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסף למבחנה 1.5 milliliters של תמיסת מלחים חוצצת של הנק (Hank's buffered salt solution) או HBSS כדי לתוחב את החיידקים, או יחס של 100 חלקים LB ל-3 חלקים HBSS. לאחר מכן, השלם את הנפח הכולל ל-15 milliliters באמצעות HBSS, או ביחס של 1 ל-10 בין LB ל-HBSS.

כל עכבר דורש 100 µL של תרבית סלמונלה מדוללת, או בין 1×10⁶ ל-1×10⁸ יחידות יוצרות מושבה (CFU) לפני תחילת הגבג' (gavage); יש להסיר את המים והמזון מהעכברים ארבע שעות לפני הניסוי. לאחר מכן, הכין תמיסת סטRepartition streptomycin מיד לפני הגבג' על ידי דילול של 7.5 mg של streptomycin באבקה ב-100 µL של HBSS. עבור כל עכבר המוזרק, הקפד להכין נפח עודף כדי לפצות על אובדן לפני הגבג' של העכבר.

ראשית, הכין מחט האכלה עם 100 µl של תמיסת סטריפטומייצין. הוצא את העכבר הראשון מהכלוב לקבלת הגavage והחזק את העכבר כשהוא פונה לכיוון משטח העבודה. אחז בחוזקה בעור מעל כתף העכבר באמצעות האגודל והאצבע האמצעית, ומתוך מתיחה של הראש והצוואר בעזרת האצבע המורה כדי להביא את הוושט למצב ישר.

הכווינו את קצה הכדור של מחט ההזנה לאורך תקרת הפה לעבר הצד הימני של החלק האחורי של הלוע. לאחר מכן, העבירו אותה בעדינות מטה אל תוך הוושט והזריקו 100 µL של תמיסת streptomycin. אין להרגיש התנגדות.

חזור על תהליך זה עבור כל העכברים בקבוצת הניסוי ובקבוצת הביקורת העוברים את הניסוי. כ-20 שעות לאחר ה-strp de m והזנה ב-gavage, וארבע שעות לפני הזנת הסלמונלה ב-gavage, הסר את המים והמזון מהעכברים שיקבלו את תמיסת הסלמונלה ב-gavage דרך הפה. בצע gavage לכל עכבר באופן דומה לשלב הקודם, תוך שימוש ב-100 µL של תמיסת סלמונלה ב-HBSS.

לאחר ההזנה (gavage), העבירו כל עכבר לכלוב חדש כדי להתחיל באיסוף הצואה. החל משמונה שעות בקירוב לאחר ההזנה, הסירו את הצואה מהכלוב מיד לאחר הפרשתה. אספו 100 milligrams של צואת עכבר כדגימה ניסויית.

אסוף דגימות מדי יום או מדי שבוע, בהתאם לאורך המחקר, לצורך אנליזה של salmonella בצואה. העבר את דגימת הצואה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter עם 1 milliliter של PBS, ערבב במכשיר vortex בעוצמה וסבב בצנטריפוגה במשך 10 דקות במהירות של 800 RPM. העבר את הסופרנאטנט למבחנה נקייה של 1.5 milliliter וסבב בצנטריפוגה ב-6, 000 RPM למשך חמש דקות.

שפכו את הנוזל העליון והוסיפו 200 µL של PBS למשקעים, וערבבו במערבל Vortex כדי להחזיר אותם לתמיסה. לאחר מכן, גלו Salmonella באמצעות צלחת BB l roag. השתמשו ב-10 עד 100 µL של תמיסת צואה לכל צלחת, ופזרו אותה על הצלחת כפי שמוצג בסעיף שני.

מיני הסלמונלה מופיעים בצבע בורדו עקב הבדלים מטבוליים בנוכחות כרומוגנים נבחרים. ספרו את מושבות הסלמונלה בצלחת כדי להשוות את רמת הזיהום בין עכברים בודדים. בהליך ניסיוני זה השתמשנו בעכברי C 57 black six נקבות, נקיים מפתוגנים ספציפיים (SPF), בני שש עד שבעה שבועות.

עכברים הוזרקו בסלמונלה ובסטרטומיצין בתוספת HBSS. קבוצת ביקורת של עכברים קיבלה גאוואז' של סטרטומיצין בלבד. זני הסלמונלה ששימשו במחקר כוללים את זן הבר (wild type) של salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, זן מוטנט לא פתוגני של סלמונלה, ושלושה זני FPC מהמעבדה של ד"ר ג'יימס מדרה (Dr. James Madera) הנושאים את הגן AAV R age הקשור לאריריות בתוך פלסמיד PSKW 29 בעתק נמוך. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לזהות קולוניזציה של salmonella tyrian במעי העכבר.

זיהום כרוני בסלמונלה נמדד באמצעות ניתוח צואה, ודגימות של משקל גוף ורקמת מעי נאספו לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית. בדרך כלל, ירידה במשקל הגוף ומוות מתרחשים בתוך ארבעה שבועות לאחר ההדבקה. שיעורי ההישרדות ארבעה שבועות לאחר ההדבקה מוצגים כאן.

לאחר שעכברים שורדים ארבעה שבועות לאחר ההדבקה, הם עולים במשקל הגוף ושיעורי התמותה פוחתים ב-23 השבועות שנותרו. באופן כללי, למעלה מ-65% מהעכברים שהודבקו בזני salmonella, מסוג FSY fsy, A VRA null או fsy. A VRA heterozygote, יכולים לשרוד למעלה משישה חודשים עם זיהום salmonella מתמשך במעי.

לאחר הזיהום החריף, השורדים עדיין נשאו את הסלמונלה, אותה ניתן היה לזהות שישה חודשים לאחר הזיהום באמצעות השיטה המתוארת בפרוטוקול זה. ניתוח אימונופלואורסצנציה של דגימות רקמה ממעי של עכבר מראה את פלישת הסלמונלה לרירית המעי 27 שבועות לאחר הזיהום. בתמונה זו, הגרעינים צבועים בכחול והסלמונלה המזהמת מוצגת בירוק.

כפי שמוצג בקבוצת הביקורת, אין צביעה ירוקה בהירה, דבר המעיד על היעדר קולוניזציה של salmonella. לעומת זאת, בעכברים שהודבקו ב-salmonella ב-27 שבועות לאחר ההדבקה, נצפית צביעה ירוקה בהירה ברירית המעי. הדבר מעיד על התמדה של זיהום ב-salmonella בעכבר שטופל מראש ב-streptomycin.

הרגע הדגמנו כיצד להשרות זיהום כרוני של some במודל עכברים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין תרבית טרייה עבור garage, להשתמש בכישורי garage נכונים ולבדוק את נוכחותם של ANA כדי לוודא שמודל הניסוי שלכם עובד. זהו כל התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.