Name: Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס גין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד את שיטת BiFC לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי בצל באמצעות אקדח גנים Helios. הטכניקה משתמשת בפלואורסצנציה YFP לבחינת אינטראקציות בין גורמי שעתוק Arabidopsis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. סטיב הר Xiaoning ז&#39;אנג עבור 35S:: GFP pGlowbug לבנות את האחווה Hokensen דוקטורט כדי CH מחקר במעבדה צ&#39;s L&#39;נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של ​​מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.

I. הכנה פלסמיד ה-DNA פלסמיד המשמש הפגזה חייב להיות של טוהר גבוהה בריכוז של 500ng/μl או יותר. עבור BiFC הכולל שתי בונה פלסמיד, 25 מיקרוגרם של כל פלסמיד הוא זקוק. במילים אחרות, 1:01 יחס טוחנת של שני פלסמידים צריך להיות מעורב כדי להצמיח DNA 50 מיקרוגרם סך פלסמיד להכנת מחסניות. שימו לב כי הוספת ה-DNA יותר מ 50 מיקרוגרם עלול לגרום הצטברות של חלקיקי זהב יש להימנע. זמין מסחרית פלסמיד דנ"א ערכות חילוץ מומלץ לבודד DNAs פלסמיד. וקטורי פלסמיד צריך להיות קטן יחסית בגודל כגון pUC19. אנו משובטים שאו ו LUH cDNA לתוך pUC19-SPYNE ו-pUC19 SPYCE, בהתאמה 3. וקטורים בינאריים לשינוי Agrobacterium בתיווך הם גדולים מדי ובלתי הולם עבור ההפצצה. השנייה. דיו הכנה הכנת דיו כרוך ציפוי זהב חלקיקים עם DNA פלסמיד והעמיסו אותם לתוך צינורות הפלסטיק נחתך לאחר מכן לתוך חצי חתיכות ארוכות אינץ', אשר ניתן להטעין את האקדח בעלי הגן מחסנית. הכנה מחסנית מתואר בפרטים גדול במאמר נפרד יופיטר 4 ועל כן לא המתוארת כאן. עבור הפגזה של תאים בצל, מומלץ לערבב 50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עם 12.5 מ"ג של חלקיקי זהב בכל הכנות, אשר מניב כ - עד 50 מחסניות ב 1 מיקרוגרם DNA/0.25 מ"ג זהב / מחסנית. מחסנית עבור כל ירייה אחת. חלקיקי זהב יכול להיות 0.6 מיקרומטר או 1.0 מיקרומטר קוטר (# חתול 1652262 או חתול # 1652263; Biorad). כמו כן, אנו ממליצים להשתמש 0.5 מ"ג / מ"ל ​​PVP פתרון להכנת מחסנית. עבור BiFC, לשלב בין שתי DNAs פלסמיד של כל אחד מבני הזוג אינטראקציה המשוערת בהכנת מחסנית אותו. לאחר הכנה מחסנית, חשוב לבחון את מחסניות באמצעות ירי מכלי עשה לאחרונה בלחץ הליום בין 150-200 psi Parafilm לתוך ריבוע כי הוא כרוך סביב בצלחת פטרי. זה יהיה המבחן אם חלקיקי זהב יכול להיות מונעת ביעילות מחסניות, אתה אמור לראות את חלקיקי זהב קלוש על Parafilm. זה נותן לך מושג בתחום כי כל ירייה יכסה. ניתן להבחין כמויות שונות של חלקיקי זהב מונעת על Parafilm בלחצים הליום שונים (בטווח 150-200 psi). אם אין הבדל משמעותי, לבחור את הלחץ נמוך יותר הפגזה. ג. בצל רקמות הכנת ביום הירי, לקלף את העור החיצונית של בצל צהוב גדול. באמצעות סכין גילוח נקי וחד, לחתוך 4-5 שכבות עמוקות שטח מלבני של כ - 2 X 8 ס"מ. קח את רקמת בצל מלבני, לבטל את שתי השכבות החיצוניות, לחתוך את שכבות הבצל הנותר לתוך כ 2X1.5 ס"מ חתיכות. מניחים את חתיכות הבצל בצלחת פטרי המכילות נייר פילטר (נייר Whatman 3mm וחותכים עיגולים) טבולה במים סטריליים. מכסים את צלחת פטרי והם מוכנים ללכת. IV. הפצצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחסניות לתוך מחזיקי לבן מיכל עגול. מחסניות בונה פלסמיד המכיל שונים יש לטעון לתוך מחזיקי מחסנית שונים. כל בעל מחסנית יכול להכיל עד 12 מחסניות 12 יריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסוללה ואת אניה חבית טרי לתוך Gun הליוס ג'ין. ודא כי הן את אניה חבית את האקדח יש בהתאמה O-טבעות המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להוסיף בעל מחסנית אקדח ריק לתוך הגן, עם סימן # 12 על בעל מחסנית מול החלק העליון של האקדח. מחסנית בעל Advance פעם או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אקדח למיכל הליום ולהתאים את הלחץ בין 150-200 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבשי הגנה האוזן אקדח אש כמה פעמים עם בעל מחסנית ריקה לנקות את החדר של האקדח ואת לוודא כי הלחץ הוא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעל מחסנית ריקה להוסיף בעל מחסנית טעונה. מתקדם בעל מחסנית כך מחסנית אתה רוצה אש ממוקם בתחתית (06:00) של בעל מחסנית. קליעה חתיכת בצל כאן מספק סוג של שליטה שלילי הקרינה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכות בצל באמצע צלחת פטרי ריקות עם השכבה הפנימית ביותר של בצל פונה כלפי מעלה. מנוחה אניה קנה האקדח של הגן על צלחת פטרי ואש את האקדח על ידי לחיצה רצופה על כפתור בצד בזמן על ההדק. מעבירים את הבצל מופצצים כדי בצלחת פטרי לחות המכיל מסנן נייר 3mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש על המחסנית הבא ואש חתיכת בצל שונים. חזור על שלב זה עד 4-5 פיסות של בצל נורים. כל תכשיט בצל הוא ירה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה לבעל מחסנית שונה עמוסה מחסניות המכילות שילוב שונה פלסמיד פלסמיד או אחרת. זכור לשנות את אניה לחביתזה גם על מנת למנוע זיהום. תירה 4-5 חתיכות בצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההפצצה, להחזיר את כל הבצל עד מנות perti. מכסים את צלחות פטרי עם מכסים. לעטוף אותם עם Parafilm כדי למנוע התייבשות. דגירה חתיכות בצל בטמפרטורת החדר בחושך במשך 16-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את לחץ הגז ולשחרר את האקדח לפני ניתוק גן מהטנק הליום. פרקו את אניה לחבית, ולהסיר את בעל מחסנית של מחסניות בשימוש (או משומש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית על ידי השריית אותם בכוס עם מים וסבון. מניחים את כוס ב sonicator אמבטיה sonicate במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף אותם במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון. משרים אותם אתנול 70% למשך שעה ולאחר מכן לייבש אותם על מגבות נייר. </li></ol> V. תצפית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דוגרים חתיכות בצל מופגז במשך 16-20 שעות בטמפרטורת החדר, אנו יכולים לצפות GFP או YFP הקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון Axio Zeiss Observer.z1 השתמשו במחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים עם קצוות שטוחים לאט לקלף שכבה תא בודד את האפידרמיס הפנימית של הבצל (השכבה ישירות הפנים את האקדח במהלך ההפצצות). מניחים את קליפות על טיפת מים בשקופית. הוסף coverslip אבל להיזהר כדי למזער את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת שדה בהיר של המיקרוסקופ, בדוק תחילה להזרמת cytoplasmic על מנת להבטיח כי התאים הם בחיים. כדי לעשות זאת, לחשוף את השקופית האור בשדה בהיר במשך כמה דקות כדי לחמם את רקמות בצל ואז לחפש plastids נעים. הזרמת cytoplasmic לא תמיד קל לראות, אז אל תתייאש אם אתה לא רואה שום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי פלואורסצנטי, השתמש עירור מתאים ומסננים גילוי ה-GFP או YFP. חשוב לכלול בקרות שליליות כגון חתיכות בצל עם זריקה שאינה פלורסנט פלסמיד. אותות צהוב קלוש להופיע מתאי פצועים, בועות אוויר, או פסולת. חשוב גם לכלול שולטת חיובית. כתב פלסמיד המכיל הביעו פלורסנט constitutively כגון 35S:: ה-GFP הוא פקד חיובי מעולה. אותות ה-GFP Visible מתאי אפידרמיס הבצל (איור 1 א, ד) ציינו כי מחסניות, הרקמות בצל, ירי אקדח גנים מוכנים כהלכה והוצאו להורג. בהמשך, צפינו אינטראקציות בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE לחתיכות בצל מופגזים מחסניות המכילות תערובת של 35S:: שאו pSPYNE ו-35S:: LUH-pSPYCE DNAs. קלוש הקרינה YFP נצפתה גרעין בלבד (איור 1 B, E), המציין את האינטראקציה פיזי ישיר בין שאו ו LUH שהביא את שברי YFP לפצל יחד בגרעין. שים לב כי האות YFP מ BiFC הוא חלש יותר באופן משמעותי האות ה-GFP מן 35S:: ה-GFP. </li></ol> נציג תוצאות במחקר שלנו דיווחו כאן, 35S:: שליטה GFP חיובי פלסמיד פולט הקרינה חזקה הממלא את התא כולו, כולל בגרעין והן בציטופלסמה (איור 1 א, ד). חלבון ה-GFP הוא קטן מספיק כדי לנטרל לתוך הגרעין ללא לאות לוקליזציה גרעיני. לעומת זאת, שאו ו LUH שני גורמים תעתיק ארבידופסיס הראו בעבר לתקשר בשמרים שני היברידית assay 2. שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו-LUH pSPYCE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP), הן גדולות מדי מפוזר לתוך הגרעין, מכילים אותות לוקליזציה גרעיני 2,5. אות ניאון YFP זוהה בגרעין התא בצל (איור 1 B, E) עולה כי שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE יכולים לקיים אינטראקציה בגרעין בצל. אות לא פלורסנט מזוהה בצל מופגזים תערובת של pSPYNE וקטור פלסמיד פלסמיד המכיל את שבר N-מסוף של YFP ו-LUH pSPYCE (תרשים 1C, F). הקרינה BiFC בתיווך YFP משמעותית חלש יותר הקרינה GFP בתיווך מן 35S:: GFP פלסמיד. במחקר שלנו, הם גם הראו לוקליזציה subcellular שונים (איור 1A להשוות עם B). בנוסף, את מספר התאים פלורסנט נמוך באופן משמעותי עבור BiFC, כמו BiFC פועל רק כאשר שני פלסמידים שותף בהצלחה להיכנס באים לידי ביטוי בתאי הבצל זהה. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מופגז פלורסנט (A, B, C) ​​שדה בהיר (D, E, F) תמונות של תאים בצל עם בונה פלסמיד שונה. (א) ו - (ד), תאים בצל מופגזים 35S:: ה-GFP. GFP מפזרת ברחבי הציטופלסמה לבין הגרעין. (ב) ו - (ה), תאים בצל מופגזים מתערבב טוחנת שווה 35S:: שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו 35S:: LUH-pSPYCE (LUH התמזגו שבר בטרמינל C- ) פלסמיד דנ"א. האינטראקציה בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE מוצג על ידי גרעין ניאון. (ג) ו - (F), פקד שלילי מראה תאים בצל מופגזים תערובות של וקטור pUC19-SPYNE ו-LUH pSPYCE plasmiDS. אות לא פלורסנט מזוהה.

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li>
<li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li>
<li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li>
<li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משתמשים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל את ההליך כולו, מתוך הכנה מחסנית אל תצפית, עם כתבת אחת מכוננת פלסמיד כגון 35S:: GFP או 35S:: גאס. השתמשנו 35S:: GFP פלסמיד המתקבל בני הזוג. סטיב הר Xiaoning אנג 6 (איור 1 א, ד). ירו גן לשלוט מחסניות נמכר RioRad (חתול 165-2244) אינם מתאימים לצמחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור BiFC, שליטה חיובית השני הוא הכרחי, שאמור לכלול שני השותפים באינטראקציה ידוע התמזגו השברים בטרמינל C-N-מסוף של...

<table><tbody><tr><td>בצל צהוב</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helios Gene Gun</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים ל-GFP או YFP</td><td>Zeiss, Nikon, Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bimolecular השלמה פלואורסצנטי (bifc) assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

חקירת פונקציה הגן באורגניזמים שונים מסתמך על הידע של איך את המוצרים גן לתקשר אחד עם השני בסביבה הסלולר הרגיל שלהם. את הקרינה bimolecular השלמה (BiFC) Assay<sup&gt; 1</sup&gt; מאפשר לחוקרים לחזות חלבונים אינטראקציות בתאים חיים הפך לכלי מחקר חיוני. Assay זו מבוססת על הקשר בהנחייתם של שני שברים של חלבון פלואורסצנטי (GFP), כי הם התמזגו כל שותף פוטנציאלי אינטראקציה חלבון. האינטראקציה של שני השותפים חלבון יקל את הקשר של N-מסוף בטרמינל C-שבר של ה-GFP, המוביל פלואורסצנטי. עבור החוקרים צמח, התאים בצל אפידרמיס מהווים מערכת ניסיונית אידיאלי לביצוע assay BiFC בגלל הקלות בקבלת והכנת רקמות הבצל ואת להדמיה ישירה של הקרינה עם הקרינה רקע מינימלי. האקדח הליוס ג&#39;ין (BioRad) משמש בדרך כלל מפציצים פלסמיד דנ&quot;א לתאי הבצל. אנו מדגימים את השימוש הליוס Gun ג&#39;ין להציג בונה פלסמיד לאינטראקציה two<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt; גורמי שעתוק, סוס (שאו) ו homolog LEUNIG (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; ואת להדמיה של האינטראקציות ביניהם בתיווך BiFC בתאי אפידרמיס בצל.

מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג&#39;ין להציג פלסמיד דנ&quot;א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

חקירת תפקוד גנים באורגניזמים מגוונים נשענת על ידע לגבי האופן שבו תוצרי הגנים מקיימים אינטראקציה זה עם זה בתנאי התא הנורמליים...

נוהל זה בוחן אינטראקציה בין חלבונים in vivo בין שני ווסתי שעתוק של Arabidopsis, namely SEU ו-LUH. באמצעות שימוש במשלים פלואורסצנציה ביו-מולקולרי, SEU מחובר למקטע הקצאי N של חלבון פלואורסצנטי צהוב, או YFP, ו-LUH מחובר למקטע הקצאי C של ה-YFP בבניית שני הפלסמידים. SEU-NYFP ו-LUH-CYFP מוחדרים באמצעות הפגזה לתאי אפידרמיס של בצל כדי לבחון את האינטראקציה ביניהם.אינטראקציה בין Seuss ל-LUH גורמת לאסוציאציה של מקטעי הקצה הטרמינלי וה-C של YFP בגרעינים, מה שמוביל לפלואורסצנציית YFP בגרעינים. לאחר דגירה של 16 עד 20 שעות בחושך, קליפות האפידרמיס של הבצל נבחנות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי להדמיא את הפלואורסצנציה. שלום, אני קורטני הולאנדר מהמעבדה של ד"ר Zhi Lu במחלקה לביולוגיה של התא וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת מרילנד.היום נדגים לכם פרוטוקול לבדיקת אינטראקציה בין חלבונים בתאי בצל באמצעות פืน הגנים BioRad Helios. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו לבדיקת אינטראקציות בין חלבונים ומיקום חלבונים בתאי צמחים. בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מחסניות עבור רובה הגנים Helios בהתאם לפרוטוקול הווידאו של JoVE מאת Woods ו-Zeto 2008, המדגים בפירוט את הליך הכנת המחסניות עבור כל הכנה של מחסניות. 50 µg של total plasma DNA מעורבבים עם 12.5 mg של חלקיקי זהב ו-0.5 mg/mL של תמיסת PVP עבור BIFC. בשילוב של אותה הכנת מחסנית, שני ה-plasma DNAs של החלבונים בעלי האינטראקציה המשוערת Seuss המחובר לחצי ה-N terminal של YFP, בקיצור seus, NYFP, ו-LU Homolog המחובר לחצי ה-C terminal של YFP, בקיצור L-U-H-C-Y-F-P.הכמות המשולבת היא 50 micrograms לכל הכנה, מה שמאפשר ייצור של עד 50 מחסניות עם microgram אחד של DNA לכל 0.25 milligrams של זהב למחסנית. כל מחסנית מיועדת לירי אחד. לאחר הכנת המחסניות, יש לבחון אותן כדי לוודא שחלקיקי הזהב נורהים ביעילות.עטפו פיסה מרובעת של פאראפילם (paraform) סביב צלחת פטרי. לאחר מכן, הגדירו את לחץ ההליום לערך שבין 150 ל-200 PSI והשליכו את המחסניות שהוכנו acabado אל תוך ריבוע הפאראפילם. התבוננו בחלקיקי זהב עמומים על גבי הפאראפילם.ניתן להדוף כמויות שונות של חלקיקי זהב על גבי ה-parfum בלחצי הליום שונים. עם זאת, אם אין הבדל משמעותי, יש לבחור בלחץ הנמוך יותר עבור ההפצצה. בדיקה זו מעידה גם על השטח המכוסה על ידי כל סבב ירי.להכנת רקמות הבצל, קלפו את הקליפה החיצונית מבצל צהוב גדול באמצעות להב תער נקי וחד. חתכו שטח מלבני של שני על שמונה סנטימטרים, לעומק של ארבעה עד חמישה שכבות. הוציאו את רקמת הבצל המלבנית והשליכו את שתי השכבות החיצוניות.חתכו את השכבות הנותרות של הבצל לחתיכות ריבועיות של כ-1.5 סנטימטר. הניחו את חתיכות הבצל בתוך צלחת פטרי המכילה עיגולים של נייר סינון של 3 mm. הרטיבו במים סטריליים וכסו את צלחת הפטרי.פיסות הבצל מוכנות להפצצה. ראשית, טענו את המטבעים למחזיקי המטבעים העגולים והלבנים; טענו מטבעים המכילים תכני פלסמיד שונים למחזיקי מטבעים שונים. כל מחזיק מטבעים יכול להכיל עד 12 מטבעים עבור 12 יריות.כאן טוענים שלושה מחזיקים שונים. המחזיק הראשון מכיל מחסניות עם 35 S-G-F-P-A, מקדם חזק וקונסטיטוטי מנגיף הפסיפס של הכרובית. פלסמיד זה משמש כביקורת חיובית.המעמד השני נטען עם המחסניות הניסיוניות המכילות כמות שווה של S-E-U-N-Y-F-P ו-L-U-H-C-Y-F-P. מעמד המחסניות השלישי נטען עם מחסניות המכילות תערובת מולרית שווה של וקטור ה-puck spine ושל LUH puck spice. זה משמש גם כביקורת שלילית.הכנס את הסוללה ואת בטנת הקנה החדשה אל תוך ה-Helios gene gun. וודא שלבטנת הקנה ולרובה מחוברים טבעות ה-O-rings המתאימות. לאחר מכן, הכנס מחזיק מחסנית ריק אל תוך ה-gene gun, כאשר סימון המספר 12 על מחזיק המחסנית פונה כלפי מעלה.הזיזו את מחזיק המחסנית פעם אחת או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כראוי. לאחר מכן, חברו את האקדח למיכל ההליום וכווןנו את הלחץ לטווח שבין 150 ל-200 PSI. עליכם להשתמש במגני אוזניים ולהפעיל את האקדח מספר פעמים על ידי לחיצה ממושכת על כפתור הצד תוך כדי לחיצה על ההדק. הפעלת האקדח כאשר מחזיק המחסנית ריק מנקה את תא האקדח ומבטיחה שהלחץ יציב.לפני ירי ה-DNA, ניתן לירות פיסה של בצל כאן כביקורת שלילית עבור פלואורסצנציית רקע. כדי לירות את חלקיקי הזהב המצופים ב-DNA, הסר את מחזיק המחסניות הריק והכנס את מחזיק המחסניות הטעון הראשון המכיל את הביקורת החיובית. העבר את מחזיק המחסניות כך שהמחסנית המיועדת לירי תמוקם בתחתית מחזיק המחסניות.כעת הניחו חתיכות בצל במרכזו של Petri dish ריק, כאשר השכבה הפנימית ביותר של הבצל פונה כלפי מעלה. הניחו את מעטפת הקנה של תותח הגנים על ה-Petri dish והפעילו את התותח. התקדמו למחסנית הבאה וירו בחתיכת בצל אחרת.חזור על שלב זה עד לצילום של ארבעה עד חמישה חלקי בצל. כל חלק בצל מצולם פעם אחת בלבד לאחר הצילום. העבר את חלק הבצל שהופצץ לצלח פטרי המכיל נייר סינון לח בעובי 3 mm כדי לצלם את מחסניות הניסוי.עברו למחסנית Holden. שנית, זכרו להחליף את ליינר הקנה כדי למנוע זיהום. ירו בארבעה עד חמישה חלקי בצל כפי שהודגם כעת עבור הביקורת החיובית.לאחר מכן, העבירו למחסנית Holden מספר שלוש, המכילה את ה-DNA של ביקורת השלילה. ושוב, הניחו ארבע עד חמש חתיכות בצל.החליפו את דיפון התוף כדי למנוע זיהום. לאחר ההפצצה, כסו במכסים את צלוחיות הפטרי המכילות את חתיכות הבצל.עטפו אותם בפרפורם כדי למנוע התייבשות. דגרו את חלקי הבצל בטמפרטורת החדר בחושך למשך 16 עד 48 שעות. עם סיום ההפגזה, כבו את הגז ושחררו את הלחץ לפני ניתוק תותח הגנים ממכל ההליום, הבריגו החוצה את תבנית הקנה והוציאו את מחזיק המחסניות ואת המחסניות המשומשות.לבסוף, נקו את מחזיקי המחסניות ואת התשמיות של הגליל על ידי טבילתם בכלי כימי עם מי סבון וביצוע סוניקציה למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון.השרו ב-70% ethanol למשך שעה ולאחר מכן ייבשו על נייר סופג. המשיכו לתצפית על חתיכות הבצל 16 עד 20 שעות לאחר ההפגזה. לאחר דגירה של חתיכות הבצל המופגזות למשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפינצטה עם קצוות שטוחים כדי לקלף לאט שכבת תאים אחת מהאפידרמיס הפנימי של הבצל.זוהי השכבה הפונה ישירות לעבר התותח במהלך ההפצצה. הנח את השכבה שקולפה על טיפת מים על זכוכית כיסוי של למסחית, עם זכוכית כיסוי. אך היזהר למזער את כמות הבועות. Beobserve פלואורסצנציית GFP או YFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, כגון zeiss axio observer, point Z1 המוצג כאן תחת שדה בהיר (bright field) של המיקרוסקופ. ראשית, בדקו את זרימת הציטופלזמה (cytoplasmic streaming) כדי לוודא שהתאים חיים. כדי לעשות זאת.חשפו את השקופית לאור של השדה המואר (bright field) למשך מספר דקות כדי לחמם את רקמת הבצל, ולאחר מכן חפשו פלסמידים נעים. זרימה ציטופלזמית אינה תמיד קלה לצפייה, לכן אל תתייאשו אם היא אינה נראית בבירור. לזיהוי פלואורסצנציה, השתמשו במסנני עירור וזיהוי מתאימים עבור GFP או YFP. בדקו גם את הביקורות השליליות, שהן חלקי בצל שהוחדרו עם פלסמיד שאינו פלואורסצנטי.אותות צהובים חלשים עשויים להופיע מתאים פגועים, משארי תאים ומבצלים. כמו כן, יש לבדוק את הביקורות החיוביות: הפלסמיד המכיל רפורטר פלואורסצנטי המבטא באופן קבוע.פלואורסצנציית GFP נראית בחלק מהתאים אך לא בכולם. בועות אוויר עשויות אף הן להוביל לפלואורסצנציית רקע. אותי GFP גלויים מתאי אפדרמיס של בצל מעידים כי המחסניות, רקמי הבצל והירי מה-gene gun הוכנו ובוצעו כראוי.כאן מוצגת הפלורסצנציה העזה שנצפתה מהפלסמיד החיובי ל-35 SGFP. הפלורסצנציה העזה נראית בתא כולו, כולל הגרעין והציטופלזמה. תמונת השדה הבהיר (brightfield) מאפשרת לראות את קווי המתאר התואמים של התאים והגרעינים.לא כל תא עבר טרנספורמציה. אות פלואורסצנציה של YFP מזוהה בגרעין תאי הבצל כאשר השילוב הניסיוני Seuss, NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מוחדר לתאי בצל באמצעות הפגזה, מה שמעיד על כך ש-Seuss NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מקימים אינטראקציה in vivo. עם זאת, פלואורסצנציה זו המתווכת על ידי האינטראקציה חלשה משמעותית מהפלואורסצנציה המתווכת על ידי 35 SGFP בביקורת החיובית.בנוסף, גורמי השאירה SEUS ו-LUH ממוקמים בגרעינים. לפיכך, הפלואורסצנציית YFP נצפית רק בגרעין. יתרה מכך, מספר התאים הפלואורסצנטיים נמוך באופן משמעותי מזה של בקרת החיוביות 35 SGFP.זאת משום ש-B FFC עובד רק כאשר שני הפלסמידים השותפים מובעים באותם תאי בצל. לא מזוהה אות פלואורסצנטי בבצלים שהופצצו באמצעות מחזיק המגזין מספר שלוש, המכיל תערובת של puck spine, וקטור ו-L-U-H-C-Y-F-P, כפי שצפוי בביקורת השלילית. כעת הדגמנו כיצד להפציץ תאי בצל כדי לבחון אינטראקציות בין חלבונים באמצעות מערכת ה-gene gun מסוג BioRad Helios.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בבקרה חיובית ושלילית מתאימות, ולדעת כי עוצמת הפלואורסצנציה של BIFC עשויה להיות חלשה יותר ומספר התאים הפלואורסצנטיים עשוי להיות נמוך יותר. זהו כל הפרוצדורה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

למד את שיטת BiFC לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי בצל באמצעות אקדח גנים Helios. הטכניקה משתמשת בפלואורסצנציה YFP לבחינת אינטראקציות בין גורמי שעתוק Arabidopsis.

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג'ין

גלה סרטונים נוספים