Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג'ין

הליך זה בודק אינטראקציה של חלבון חלבון in vivo בין שני מווסתי שעתוק Arabidopsis, seus מאוית SEU, בקיצור ו-lu holog או LUH. על ידי שימוש בהשלמת הקרינה הביו-מולקולרית seus מתמזג לשבר הקצה של חלבון פלואורסצנטי צהוב, או YFP ו-LUH מתמזגים לשבר הטרמינל C של Y-F-P-D-N-A של שני מבני הפלסמיד. סוס, NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מופגזים לתאי אפידרמיס בצל כדי לבדוק את האינטראקציה ביניהם.

אינטראקציה בין סוס ל-LUH מביאה לאסוציאציה של מסוף הקצה ושברי מסוף C של YFP בגרעינים המובילים לפלואורסצנטיות YFP בגרעין. לאחר הדגירה במשך 16 עד 20 שעות בחושך, קליפות האפידרמיס של הבצל נצפות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על מנת לדמיין פלואורסצנטיות. היי, אני קורטני הולנדר מהמעבדה של ד"ר ג'י לו במחלקה לביולוגיה של התא וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת מרילנד.

היום נראה לכם נוהל לבדיקת אינטראקציה בין חלבון לחלבון בתאי בצל באמצעות אקדח הגנים BioRad Helios. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון ולוקליזציה של חלבון בתאי צמחים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מחסניות לאקדח הגן הליוס בעקבות פרוטוקול הווידאו ג'ו מאת וודס וזטו 2008 המדגים בפירוט את הליך הכנת המחסניות עבור כל הכנת מחסניות. 50 מיקרוגרם של DNA פלזמה כולל מעורבבים עם 12.5 מיליגרם חלקיקי זהב ו-0.5 מיליגרם למיליליטר של תמיסת PVP עבור BIFC. בשילוב אותו הכנת מחסנית, שני ה-DNA של הפלזמה של החלבונים האינטראקטיביים המשוערים סוס התמזגו למחצית הטרמינל N של YFP, בקיצור seus, NYFP ו-LU Homolog התמזגו למחצית הטרמינל C של YFP בקיצור L-U-H-C-Y-F-P.

הכמות המשולבת היא 50 מיקרוגרם להכנה, ומניבה עד 50 מחסניות במיקרוגרם אחד של DNA לכל 0.25 מיליגרם זהב למחסנית. כל מחסנית מיועדת לזריקה אחת. לאחר הכנת המחסנית, בדוק את המחסניות כדי ללמוד אם חלקיקי הזהב מונעים ביעילות.

עטפו חתיכה מרובעת של פרפורם סביב צלחת פטרי. לאחר מכן הגדר את לחץ ההליום בין 150 ל-200 PSI וירה את המחסניות החדשות שיוצרו לתוך ריבוע הפרם. שימו לב לחלקיקי זהב קלושים על הבושם.

כמויות שונות של חלקיקי זהב עשויות להיות מונעות על הבושם בלחצים שונים של הליום. עם זאת, אם אין הבדל משמעותי, בחר בלחץ הנמוך יותר להפצצה. בדיקה זו מציינת גם את האזור המכוסה על ידי כל ירייה ממשיכה.

להכנת רקמות הבצל, מקלפים את העור החיצוני מבצל צהוב גדול בעזרת סכין גילוח נקי וחד. חותכים שטח מלבני של שניים על שמונה סנטימטרים, בעומק ארבע עד חמש שכבות. מוציאים את רקמת הבצל המלבנית וזורקים את שתי השכבות החיצוניות.

חותכים את שכבות הבצל הנותרות לחתיכות מרובעות של כ -1.5 סנטימטר. מניחים את נתחי הבצל בצלחת פטרי המכילה עיגולים של נייר פילטר של שלושה מ"מ. מרטיבים במים סטריליים מכסים את צלחת הפטרי.

נתחי הבצל מוכנים להפצצה. ראשית טען את המחסניות למחזיקי המחסניות העגולים הלבנים טען מחסניות המכילות מבני פלסמיד שונים למחזיקי מחסניות שונים. כל מחזיק מחסנית יכול להכיל עד 12 מחסניות ל-12 צילומים.

שלושה מחזיקים שונים נטענים כאן. למחזיק הראשון יש מחסניות המכילות 35 S-G-F-P-A מקדם חזק ומכונן מווירוס פסיפס הכרובית. פלסמיד זה משמש כבקרה חיובית.

המחזיק השני טעון במחסניות הניסיוניות המכילות כמות שווה של S-E-U-N-Y-F-P ו-L-U-H-C-Y-F-P. מחזיק המחסנית השלישי עמוס במחסניות המכילות תערובת טוחנת שווה של וקטור עמוד השדרה של הדיסקית ותבלין פאק LUH. זה משמש גם כשליטה שלילית.

הכנס את הסוללה ואת תוחם הקנה הטרי לאקדח הגן של הליוס. ודא שגם לתוחם הקנה וגם לאקדח מחוברות טבעות ה-O שלהם. לאחר מכן, הכנס מחזיק מחסנית ריק לאקדח הגנים כשהסימן מספר 12 על מחזיק המחסנית פונה לחלק העליון של האקדח.

קדם את מחזיק המחסנית פעם או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כהלכה. לאחר מכן חבר את האקדח למיכל ההליום והתאם את הלחץ בין 150 ל-200 PS. אני לובש מגן אוזניים ויורה באקדח כמה פעמים על ידי לחיצה ממושכת על כפתור הצד תוך כדי לחיצה על ההדק. ירי האקדח עם מחזיק המחסנית הריק, טעון אותו מנקה את תא האקדח ומבטיח שהלחץ יציב.

לפני צילום ה- DNA, ירי חתיכת בצל כאן יכול להיות שליטה שלילית על הקרינה ברקע. כדי לירות בחלקיקי הזהב המצופים DNA, הסר את מחזיק המחסנית הריק והכנס את מחזיק המחסנית הטעון הראשון המכיל את הבקרה החיובית. קדם את מחזיק המחסנית כך שהמחסנית המיועדת לירי תמוקם בתחתית מחזיק המחסנית.

כעת הניחו חתיכות בצל באמצע צלחת פטרי ריקה כשהשכבה הפנימית ביותר של הבצל פונה כלפי מעלה. הנח את תוחם הקנה של אקדח הגנים על צלחת הפטרי וירה באקדח. מתקדמים למחסנית הבאה ויורים חתיכת בצל אחרת.

חזור על שלב זה עד שיורים ארבע עד חמש חתיכות בצל. כל נתח בצל נורה פעם אחת בלבד לאחר הצילום. העבירו את נתח הבצל המופצץ לצלחת פטרי המכילה נייר סינון לח של שלושה מ"מ כדי לירות במחסניות הניסיוניות.

החלף למחסנית הולדן. מספר שתיים, זכור להחליף את תוחם הקנה כדי למנוע זיהום. יורה ארבע עד חמש חתיכות בצל כפי שהוצג זה עתה לבקרה החיובית.

לאחר מכן החלף למחסנית הולדן. מספר שלוש, המכיל את ה-DNA של הבקרה השלילית. ושוב, יורים ארבע עד חמש חתיכות בצל.

החלף את תוחם הקנה כדי למנוע זיהום. לאחר הפצצה. מכסים את כלי הפטרי המכילים את נתחי הבצל במכסים.

עטפו אותם בפרפורם כדי למנוע ייבוש. דוגרים את נתחי הבצל בטמפרטורת החדר בחושך למשך 16 עד 48 שעות. לאחר סיום ההפצצה, כבה את הגז ושחרר את הלחץ לפני ניתוק אקדח הגנים ממיכל ההליום, פתח את תוחם הקנה והסר את מחזיק המחסנית ואת המחסניות המשומשות

לבסוף, נקו את מחזיקי המחסניות ואת ספינות הקנה על ידי טבילתם בכוס עם מי סבון וסוניקט. למשך 20 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון.

משרים פנימה 70% אתנול למשך שעה ואז מייבשים על מגבות נייר. המשך להתבונן בחתיכות הבצל 16 עד 20 שעות לאחר ההפצצה. לאחר הדגירה של נתחי הבצל המופגזים במשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורת החדר, השתמש במלקחיים עם קצוות שטוחים כדי לקלף לאט שכבת תא בודדת מהאפידרמיס הפנימי של הבצל.

זוהי השכבה הפונה ישירות לאקדח במהלך ההפצצה. מניחים את השכבה הקלופה על טיפת מים על מכסה שקופית עם החלקת כיסוי. אבל היזהר למזער בועות.

התבונן בפלואורסצנטיות GFP או YFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון צופה zes axio, נקודה Z אחת המוצגת כאן מתחת לשדה הבהיר של המיקרוסקופ. ראשית בדוק אם יש זרימה ציטופלזמית כדי לוודא שהתאים חיים. לעשות זאת.

חשוף את השקופית לאור השדה הבהיר למשך מספר דקות כדי לחמם את רקמת הבצל ולאחר מכן חפש פלסטיק נע זרימה ציטופלזמית לא תמיד קל לראות, אז אל תתייאש אם היא לא נראית בבירור. לזיהוי פלואורסצנטי, השתמש במסנני עירור וזיהוי מתאימים עבור GFP או YFP. בדוק גם את הפקדים השליליים, שהם חתיכות הבצל שנורו בפלסמיד שאינו פלואורסצנטי.

אותות צהובים קלושים עשויים להופיע מתאים פצועים ופסולת ובצל. כמו כן, בדוק את הפקדים החיוביים. הפלסמיד המכיל מדווח פלואורסצנטי המתבטא באופן מכונן.

פלואורסצנטיות GFP נראית בחלק מהתאים אך לא בכולם. בועות אוויר עשויות גם להניב פלואורסצנטיות ברקע. אותות GFP גלויים מתאי אפידרמיס בצל מצביעים על כך שהמחסניות, רקמות הבצל וירי אקדח הגנים מוכנים ומבוצעים כהלכה.

מוצג כאן הקרינה החזקה שנצפתה מ-35 SGFP פלסמיד חיובי. הקרינה החזקה נראית בכל התא, כולל הגרעין והציטופלזמה. תמונת השדה הבהיר מאפשרת לראות את קווי המתאר המתאימים של התאים והגרעינים.

לא כל תא עובר טרנספורמציה. האות הפלואורסצנטי של YFP מזוהה בגרעין תא הבצל כאשר השילוב הניסיוני Seuss, NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מופצץ לתאי בצל המצביע על כך ש-Seuss NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מתקשרים in vivo. עם זאת, הקרינה המתווכת אינטראקציה זו חלשה משמעותית מהפלואורסצנציה המתווכת 35 SGFP בבקרה החיובית.

בנוסף, גורמי השעתוק SEUS ו-LUH ממוקמים בגרעינים. לפיכך, הקרינה של YFP נצפית רק בגרעין. יתר על כן, מספר התאים הפלואורסצנטיים נמוך משמעותית מזה של הבקרה החיובית של 35 SGFP.

הסיבה לכך היא ש-B FFC פועל רק כאשר שני הפלסמידים השותפים באים לידי ביטוי באותם תאי בצל. לא מזוהה אות פלואורסצנטי בבצל, מופגז במחזיק מחסנית מספר שלוש המכיל תערובת של עמוד שדרה פאק, וקטור ו-L-U-H-C-Y-F-P כפי שמצופה מהבקרה השלילית. זה עתה הראינו לכם כיצד להפציץ תאי בצל כדי לבדוק אינטראקציות חלבון באמצעות מערכת אקדח הגנים BioRad Helios.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בבקרות חיוביות ושליליות מתאימות ולדעת שהפלואורסצנציה של BIFC עשויה להיות חלשה יותר באות ופחות במספר התאים הפלואורסצנטיים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.