Name: גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למד לגזור תאי גזע טרופובלסט מבלסטוציסטים עכבריים ולתרבותם בתנאים המתאימים. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות השליה וביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ג&#39;נט Rossant עבור הפרוטוקול המקורי. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק CA106308 ל WH.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הכנת blastocysts עכבר והקמת קווי TS התא. מניפולציות עכבר כללי לפני גביית blastocysts, כולל הגדרת עבור ההזדווגות הטבעי הגיוס הביוץ סופר, בעצם לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי מאויר על ידי נאגי ואח'. 2003 (pp146-150). גזירת ותחזוקה של תאים TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבייה ההתקנה הכלאה בין העכברים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמו תאים מזין. יומיים לפני גביית blastocysts, MEFs (2 x 10 6 תאים) הם מצופה ב 100 מנות מ"מ. למחרת, תאים אלו מטופלים עם 10 מ"ל של מדיום TS המכיל mitomycin C (20 מ"ג / מ"ל) במשך הדגירה שעות 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה ואחריו כביסה תאים פעמיים עם PBS. C mitomycin תאים שטופלו הם זורעים אז 12 גם צלחות (1 x 10 5 תאים / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אוסף הבלסטוציסט (3.5 DPC, המכונה ביום אחד), בינונית MEF תרבות מוחלפת TS בינוני פלוס 1x FGF4/Heparin (0.5 מ"ל / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה אוסף של הרחם: להרדים את העכבר ולאתר את הרחם (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם ידי אחיזה עם מלקחיים על צוואר הרחם (הנמצא מאחורי שלפוחית ​​השתן) וחצתה צומת של הרחם וצוואר הרחם (איור 1B). משוך את הרחם, חתוך את קרום ורקמות שומן משם לחתוך את הרחם מתחת לצומת עם oviduct (תרשים 1C). מניחים את uteri (איור 1D) בנפח קטן (0.2 מ"ל) של המדיום TS בצלחת 60 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן כל קרן הרחם עם 1 מ"ל של מדיום TS באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. הכנס את המחט לתוך הבסיס של הרחם ולשטוף לאט לתוך צלחת 60 מ"מ עם המדיום החדש מ"ל 1 TS. הרחם צריך להיות מנופח המורחבת מלא במהלך השטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף והעברת blastocysts בזהירות לתוך צלחת 12 נקי היטב המכיל בינוני TS בעזרת פיפטה בפה מבוקר. לשטוף blastocysts שלוש פעמים על ידי העברת סדרתי דרך המדיום TS ב 12 גם הצלחות. מקום אחד לכל הבלסטוציסט היטב (איור 2 א) בצלחת 12-היטב המכיל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blastocysts יבקעו מתוך zona pellucida ולצרף את בארות 24 עד 36 שעות. תוצאה קטנה יהיה לצפות בקלות ביום 3. פיד התרבויות עם המדיום TS μl 500 טרי בתוספת 1x FGF4/Heparin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 או 5, תוצאה הבלסטוציסט צריך להיות מוכן disaggregation בהתאם לגודלה. גודל אידיאלי עבור disaggregation תא TS מתואר באיור 3 ב. שטפו את התרבויות פעם עם 0.5 מ"ל PBS. מוסיפים 100 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הפסקת תוצאה לגושים קטנים על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ עם pipetteman P100. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס"מ-TS-1.5F4H (בינוני TS 30%, 70% MEF-CM פלוס FGF4/Heparin 1.5x) לתוך הבאר. שנה בינונית 8 שעות לאחר disaggregation וממשיכים להאכיל תאים כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 6 ימים ו - 10 (משתנה מאוד) מושבות תאים TS ניתן לצפות. יש להם דף שטוח, אפיתל כמו מורפולוגיה עם גבול המושבה ברור (איור 2C). המשך להאכיל את כל התרבויות 2 ימים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים TS להגיע confluency 50% (בדרך כלל בין הימים 15 ו -20), לשטוף פעם עם PBS ולהוסיף 100 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA. פיפטה מעלה ומטה במהלך trypsinization כדי להבטיח השעיה ליד תא בודד. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס"מ-TS-1.5F4H ולהעביר חדש צלחות 6-60mm טוב או הכולל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF (2.5 x 10 5 cells/6-well או 5 x10 5 cells/60mm צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 8 שעות לאחר המעבר וממשיכים להאכיל את כל התרבויות 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אחד או שניים יותר קטעים (3-5 ימים בין קטעים) על ניזונים MEF, תאים TS יכול להיות מתורבת בלעדיהם. מכיוון MEFs לצרף צלחת התרבות הרבה יותר מהר מאשר תאים TS לאחר trypsinization, הבדל כזה בשיעור חסיד יכול להיות מנוצל כדי להפריד תאים TS מן ניזונים MEF. לאחר פטירתו תאים בתרבית, דגירה אותם 37 ° C CO, 2 5% למשך 30 דקות. רוב MEFs יצרף צלחת לבין האוכלוסייה ט.ס. נשאר ההשעיה. מעבירים את supernatant לצלחת חדשה. חזור על תהליך זה עבור כמה קטעים להשיג האוכלוסייה TS טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים TS ב-TS-70 ס"מ 1.5F4H ולהעביר אותם כל 4 ימים (1:10-1:20 מפוצל) או כאשר התרבות מגיע 70% confluency. מירוץ תאים עם צפיפות גבוהה (יותר מאשר לפצל 01:05) או culturing אותם כאשר ומחוברות יתר על המידה עלול לגרום הבידול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהותו של תאים TS שניתן לאשר על ידי immunostaining של סמן תא, Cdx2 (איור 3). </li></ol> TS בתאי הקפאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x בינוני הקפאה (50% FBS, TS 30% בינוניים DMSO 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coתאים llect TS ידי trypsinization, ואחריו צנטריפוגה ב 450 דקות 6. Resuspend אותם בינוני TS עם נפח שווה של המדיום הקפאת 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התאים לאט באמצעות תא אלכוהול איזופרופילי ב -70 ° C ו להעביר חנקן נוזלי לאחר 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 60 מ"מ (70% ומחוברות) נשמר בדרך כלל 2 מבחנות. </li></ol> הפשרת התאים TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר את הבקבוקון ב 37 ° C, לאסוף אותם 10 מ"ל התקשורת TS ידי צנטריפוגה (450, 6 דק '), ו resuspend ב 30% TS מדיה, 70 ס"מ, 1.5F4H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון אחד של תאים זורעים בצלחת 60 מ"מ. </li></ol> TS התמיינות תאים לתוך TGC התמיינות של תאים TS לענק תאים trophoblast (TGCs) יכול להיגרם על ידי נסיגת MEF-CM, FGF4 ו הפרין. פנוטיפ TGC (גרעינים גדולים) ניתן לאתר ארבעה ימים אחרי הזירוז (טנקה et al. 1998 ו Chiu et al. 2008). Immunostaining של p450scc לזהות את הביטוי של סמן זה TGC בתרבות הבדיל (איור 4 א). ניתוח תזרים cytometric של PI (יודיד propidium) תאים מוכתם נוסף מראה נוכחות של תאים המכילים תוכן מובחן DNA גבוה יותר (איור 4 ב). התוצאות מראות כי תאים TS לעבור endoreduplication להפוך TGCs polyploid. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Dissection uteri של העכבר. (א) מיקום uteri הוא מסומן על ידי החצים. (ב) חוצים צומת של הרחם וצוואר הרחם כפי שמוצג. (ג) חותכים את הרחם ממש מתחת oviduct (OD) מתחת בשחלה (OV). (ד) מקדימה של uteri. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תמונות הנציג להמחיש הבלסטוציסט העכבר, תולדה הבלסטוציסט ואת המושבה trophoblast. (א) הבלסטוציסט עכבר שנאספו E3.5 מוצג. ICM, בתא המסה הפנימית; MT, trophectoderm ציור קיר; PT, trophectoderm הקוטב. (ב) תוצאה trophoblast על ניזונים MEF מוצג. TS, תא גזע trophoblast. (ג) גזע trophoblast המושבה תא מראה יתרון ברור על ניזונים MEF. החצים מצביעים על גבול תא. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. זיהוי של התאים על ידי TS immunostaining ניתוח. TS (AD) ו - ES (שליטה, EH) תאים כפופים זיהוי הסמן. תאים הם immunostained עם נוגדנים להכיר Oct4 (A, E) או Cdx2 (B, F), וכן על ידי counterstained DAPI (C, G) מוצגים תמונות הממוזגת (D, H). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. התמיינות של תאים TS במבחנה. (א) מובחן (Undiff) או מובחן (הבדל) התאים בתרבית נבדקו לביטוי של סמן TGC, counterstained p450scc (ירוק), עם DAPI (אדום). (ב) ניתוח תזרים cytometric של תאים מובחנים, מוכתם לצרכן, המודד את תכולת ה-DNA (M1, 03:58 עותקים; M2, יותר מארבעה עותקים). אוכלוסיית M2 מייצג את התאים trophoblast polyploid.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך לאסוף E3.5 blastocysts מהנהלים uteri וניסיוני להקים שורות תאים TS. אנו גם מתארים את המצב כדי לשמור על stemness של תאים TS כדי להשרות התמיינות לתאים שלהם מובחנים. שני צעדים קריטיים להשגת טהור שורות תאים TS הם עיתוי disaggregation תוצאה (שלב 9) ועיבוד המעבר הראשון (שלב 11). זה כבר דווח כי פרימיטיבי האנדודרם הנגזרות תאים יכולים להיווצר בתרבות לאחר הבלסטוציסט נרחב להגמל בשלב 9 או צמיחת יתר של מושבות TS (&gt; 50% confluency) בשלב 11 (Kunath et al. 200...

ריאגנטים TS בינוני: RPMI-1640, FBS 20%, 1 mM pyruvate נתרן, 100 מ&quot;מ, בטא mercaptoethanol ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין. Mitomycin C: ממיסים 2 מ&quot;ג mitomycin C (Sigma M-0503) ב 2 מ&quot;ל PBS ומוסיפים את התערובת לתוך בינוני 2 מ&quot;ל 200 מ&quot;ל TS (10 ng / ml). בצע 20 aliquots (10 מ&quot;ל) ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש. מוסיפים לכל צלחת aliquot 100 מ&quot;מ. עכבר עובריים פיברובלסטים, מצבו בינוני (MEF-CM): פלייט MEFs ב 100 מ&quot;מ צלחות (1 x 10 6 / צלחת). למחרת, להוסיף 10 מ&quot;ל בינוני TS לכל צלחת וממשיכים התרבות במשך 48 שעות. איסוף בינוני תרבות, לסנן אותם (0.45 מ&quot;מ) ולאחסן ב -20 מעלות 35 aliquots מ&quot;ל. הפשירי כל aliquot בעת הצורך, אשר ניתן לאחסן 4 ° C. MEFs ניתן להשתמש כדי להכין שתי קבוצות של CM יותר לפני שהן הופכות ומחוברות. PBS / BSA: ממיסים BSA, חלק V (Sigma A3311, 0.1% (w / v)) ב-PBS (10 מ&quot;ל), לסנן באמצעות מזרק 0.45 מ&quot;מ לסנן ולעשות 1 aliquots מ&quot;ל 1.5 מ&quot;ל צינורות. חנות ב -70 ° C ו להפשיר שפופרת אחת בעת הצורך להכין FGF4. FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 מ&quot;ג) עם 1 מ&quot;ל של תמיסת PBS / BSA. מערבבים היטב את 10 aliquots (100 מ&quot;ל) לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -70 ° C. הפשירי כל הצינור בעת הצורך ולאחסן הנותרים בבית 4 ° C, אין להקפיא מחדש. מדולל 1000 פעמים בינוני TS להשיג 1x FGF4 (25 ng / ml). הפרין (1000x): Resuspend הפרין (Sigma H3149, 10,000 יחידות) ב-PBS לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(1000x). הפוך את 100 מ&quot;ל aliquots לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -70 ° C. Aliquots הפשירי בעת הצורך ולאחסן הנותרים בבית 4 ° C, לא להקפיא מחדש. מדולל 1000 זמן בינוני TS להשיג 1x הפרין (1 ng / ml).

גזירת trophoblast עכבר בתאי גזע blastocysts

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

מפרט של trophectoderm הוא אחד האירועים בידול המוקדם של התפתחות היונקים. השושלת trophoblast נגזר ההשתלה trophectoderm מתווכת ומייצר את החלק העוברי של השליה. כתוצאה מכך, את הפיתוח של שושלת זו היא חיונית להישרדות העובר. גזירת trophoblast גזע (TS) תאים blastocysts עכבר תוארה לראשונה על ידי טנקה<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. היכולת של תאים TS לשמור על רכוש trophoblast ספציפיים הביטוי שלהם הבמה ואת סוג התא הסמנים הספציפיים אחרי גירוי מתאים מספק מערכת מודל ערך לחקור את שושלת היוחסין פיתוח trophoblast לפיה השחזור אירועים placentation מוקדם. יתר על כן, התאים trophoblast הם אחד מסוגי כמה תאים סומטיים עוברת הגברה הגנום טבעי. אף על פי המסלולים המולקולריים שבבסיס polyploidization trophoblast החלו להיפרם, התפקיד יתרון פיזיולוגי של הגברה הגנום trophoblast נותר חמקמק ברובו. הפיתוח של בתאי גזע לתאי דיפלואידי trophoblast polyploid בתרבות עושה את זה<em&gt; לשעבר vivo</emמערכת&gt; כלי מצוין עבור הבהרת מנגנון הרגולציה של שכפול הגנום וחוסר היציבות בריאות ומחלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על דיווחים קודמים עם שינוי שפורסם Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

ספציפיקציה של הטרופאלקטודרם (trophectoderm) היא אחד מאירועי ההבדלה המוקדמים ביותר בהתפתחות יונקים. שושלת הטרופובלסט, הנגזרת מה...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק תאי TS מעוברי עכבר בשלב הבלסטוציסט. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד קרני הרחם והשגת בלסטוציסטים מעכברים ההרה. השלב השני של ההליך הוא תרבית של הבלסטוציסטים על תאי מאכל (feeders) מסוג MET ובתנאים המעודדים צמיחה של תאי TS.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא להרחיב מושבות TS ובסופו של דבר לגדל תאי TS בהיעדר מאכילי meth. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא גידול תאי TS תוך שמירה על תכונות תאי גזע לצורך ביצוע קריו-שימור והשראת דיפרנציאציה של טרופובלסט. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של סמן לתאי גזע טרופובלסטים IE CDX two בתאי TS לא מובחנים, או סמן דיפרנציאציה IEP four 50 SCC לאחר הבשלתם לתאי ענק טרופובלסטים באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.שלום, אני שאני צ'ו מהמעבדה במחלקה לגנטיקה ביו-רפואית במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר. היום נראה לכם הליך של בידוד תאי גזע של טרופובלסט. אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את הגדילה וההתמיינות של הטרופובלסט ואת תפקידו ברקמות חוץ-עובריות ליצירת שליה בריאה.אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הגדירו הכלאה לרבייה בין העכברים הרלוונטיים. לאחר מכן, הכינו פיברובלסטים עובריים של עכברים ORMs כתאי מאכיל (feeder cells).יומיים לפני איסוף הבלסטוציסטים, זרעו תאי MEF בצלחות של 100 מילימטר ביום למחרת. טפל בתאי MEF אלו ב-10 מיליליטר של מצע TS המכיל 20 מיקרוגרם למילילטר של mitomycin C למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני. לאחר שעתיים, שטוף את התאים פעמיים ב-PBS, השהה מחדש את תאי ה-MEF שטופלו ב-mitomycin C ב-10 מיליליטר של מצע TS והעבר את התאים לפלטה של 12 בארות. ביום איסוף הבלסטוציסטים, החלף את מצע התרבית של ה-MEF במצע TS בתוספת one X FGF four heparin.עתה אנו מוכנים לאסוף בלאסטוציסטים מרחם העכבר. ראשית, הנח את החיה שהורגזה על גבה ונקה את העור והפרווה בעזרת 70% ethanol. לאחר מכן, בצע חתך צדי קטן ומשוך את העור לכיוון הראש כדי לחשוף את הבטן, ולאחר מכן חתוך את הפריטונאום באופן צדי.כדי לחשוף את חלל הבטן, אתרו את הרחם. הסירו את הרחם על ידי תפיסתו עם פינצטה בצוואר הרחם הממוקם מאחורי השלפוחית, וחיתוך בנקודת החיבור בין הרחם לצוואר הרחם. משכו את הרחם וגזמו את הקרומים ורקמות השומן מסביבו.לאחר מכן, גזרו את הרחם מתחת לנקודת החיבור עם בית החורג. העבירו את הרחם ל-0.2 milliliters של מצע TS בצלחית של 60 מילימטר. כעת מלאו מזרק של מיליליטר אחד ב-1 milliliter של מצע TS.חברו מחט בכיליה (gauge) 26 והחדירו את המחט לבסיסו של רחם אחד. בצעו שטיפה איטית לתוך צלחת חדשה בקוטר 60 מילימטרים. על הרחם להיות מנופח ומתוח במלואו במהלך השטיפה.באותה הדרך, שטפו את קרן הרחם השנייה באמצעות פיפטה מבוקרת פה. אספו והעבירו את ה-blast assist בזהירות לפלטה נקייה בעלת 12 בארות המכילה מצע TS; שטפו את ה-blast assist שלוש פעמים באמצעות העברה סדרתית דרך מצע TS בפלטות בעלות 12 בארות.מקמו blast assist אחד בכל באור. בתוך פלטה בעלת 12 באורים המכילה תרבית של מזיני meth שעברו טיפול ב-mitomycin C בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. ה-blast assists יבקעו מה-zona lucita וייקלטו לבוארים בתוך 24 עד 36 שעות.ביום השלישי ניתן יהיה להבחין בקלות בצמיחה קטנה. האכילו את התרביות ב-500 µL של מצע TS טרי בתוספת 1X FGF4 heparin ביום הרביעי או החמישי. צמיחת ה-blast assist צריכה להיות מוכנה לפירוק (disaggregation), בהתאם לגודלה.הגודל האידיאלי לפירוק TSL מוצג כאן. שטפו את התרביות פעם אחת עם 0.5 milliliters של PBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 microliters של 0.25%trips ב-EDTA והדגרימו למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide.כעת אנו מוכנים לפרק את הבלסטים (blasts), שזהו ככל הנראה החלק הקריטי ביותר בפרוצדורה זו. לאחר מכן, פרקו את צמיחת העזר של הבלסטים לגושים קטנים על ידי פיפטינג נמרץ מעלה ומטה באמצעות פיפט P 100. עצרו את התהליך של הטרפסינציה (trypsinization) על ידי הוספת 0.5 milliliters של 70 cm 1.5 F four H medium לבאר. החזירו את התאים מיד לאינקובטור. שמונה שעות לאחר הפירוק (disaggregation), החליפו את המצע.המשיכו להזין את התאים מדי יומיים בין הימים השישי לעשירי. פרק זמן זה הוא משתנה מאוד. ניתן להבחין במושבות TSL.הם בעלי מורפולוגיה של שכבה אפיתלית שטוחה עם גבול מושבה ברור. המשיכו להאכיל את התרביות מדי יומיים. כאשר תאי ה-TS מגיעים ל-50% fluency, בדרך כלל בין הימים 15 ל-20, שטפו אותם פעם אחת עם PBS והוסיפו 100 µL של 0.25% trypsin EDTA; בצעו פיפטינג למעלה ולמטה במהלך הטרפסיניזציה כדי להבטיח קבלת תרחיף של תאים בודדים כמעט לחלוטין.לאחר חמש דקות, הפסיקו את פעולת ה-trypsin על ידי הוספה של שבעה DCM 1.5 F four H medium. לאחר מכן, העבירו את התאים לפלטות שש בארות חדשות המכילות את תאי ה-meth feeders המטופלים ב-mitomycin C שהוכנו מראש, והדגירו ב-37 degrees Celsius ו-5%Carbon dioxide. החליפו את המצע שמונה שעות לאחר המעבר (passage) והמשיכו להזין את התרביות מדי יומיים. לאחר מעבר אחד או שניים נוספים על ה-meth feeders, ניתן להתרבית את ה-TSL ללא השפעתם, כדי להפריד את ה-TSL מה-meth feeders.לאחר העברת התאים המטופחים, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. מכיוון שתאי mes נצמדים לפלטת התרבית הרבה יותר מהר מתאי TS לאחר טיפול בטריפסין, רוב תאי ה-mes ייצמדו לפלטה בעוד שאוכלוסיית ה-TS תישאר בתרחיף. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) לפלטה חדשה.חזור על תהליך הפרדת תאי ה-TS ממזיני ה-meth למשך מספר מעברים כדי לקבל אוכלוסיית TS טהורה. תחזק את תאי ה-TS ב-70 cm, 1.5 F four H medium והעבר אותם בכל ארבעה ימים או כאשר התרבית מגיעה ל-70% co fluency. לבסוף, ניתן לאשר את זהותם של תאי ה-TS באמצעות צביעה אימונוכימית של סמן תאי.הקפאו תאי TS ב-CDX 2, אספו אותם באמצעות ization, ולאחריו סנטריפוגציה ב-450 GS למשך שש דקות. השעיו מחדש את התאים במדיום TS עם נפח שווה של מדיום הקפאה בריכוז 2x והעבירו למבחנות קריו. צלחת של 60 מילימטר עם 70% התמזגות (confluent) נשמרת בדרך כלל בשתי מבחנות.הקפיאו את התאים באיטיות באמצעות תא אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורה של minus 70 °C. העבירו לחנקן נוזלי לאחר 24 עד 48 שעות. יש להפשיר את ה-TSL במהירות על ידי הפשרת המבחנה בטמפרטורה של 37 °C.העבירו את תאי ה-haw לשפופרת של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של מצע TS ואספו את התאים על ידי סנטריפוגציה. השעיקו מחדש את התאים ב-70 cm, 1.5 F four H medium וזרעו כל מבחנה של תאים בצלחת של 60 מילימטר. ניתן להשריע דיפרנציאציה של תאי TS לתאי ענק של טרופובלסט (trophoblast giant cells) או tgc על ידי הסרת MEC four והפרין. ניתן לזהות בקלות את תאי ה-T GCs בתרבית לפי גרעינים וגופי תא מוגדלים.ניתן לזהות את הפנוטיפ של TGC גם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של סמן ה-TGC שנקרא P40 SCC המוצג בירוק, עם צביעת נגד ב-DAPI המוצגת באדום, כפי שנראה כאן. תאים מובחנים מביעים P40 SCC בעוד שתאים לא מובחנים אינם מביעים אותו. ניתוח ציטומטרי של התאים המובחנים שצבעו ב-propidium iodide מראה תכולת DNA גבוהה יותר, כאשר M1 מייצג שתי עד ארבע עותקים ו-M2 מייצג יותר מארבעה עותקים של DNA.תוצאות אלו מצביעות על כך ש-TSLs עוברים שכפול אנדו-מיטוטי כדי להפוך ל-TCS פוליפלואידיים, המיוצגים על ידי אוכלוסיית M two. הרגע הראינו לכם כיצד לאסוף blasts, ptosis, ולהפיק תאי TS של עכבר מ-blasts, ptosis. חשוב לזכור לעקוב אחר הצמיחה בעת הקמת קווי ה-TSL, ולוודא שפלוריפוטנטיות התאים נשמרת בתנאי התרבית.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

היכולת של בתאי גזע עובריים אנושיים עצמית לחדש להתמיין לכל סוגי התאים בגוף עולה כי הם מחזיקים הבטחה גדולה עבור שניהם יישומים רפואיים ככלי מחקר להתמודדות עם שאלות יסוד בהתפתחות מחלות. כאן, אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול הגזירה של בתאי גזע עובריים אנושיים מעוברים על ידי בידוד immunosurgical של מסת התאים הפנימית.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

פרוטוקול המתאר את היווצרותם של בלסטואידים אנושיים היוצרים ביעילות, בזמן וברצף תאים דמויי בלסטוציסט.

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

למד לגזור תאי גזע טרופובלסט מבלסטוציסטים עכבריים ולתרבותם בתנאים המתאימים. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות השליה וביולוגיה התפתחותית.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

גלה סרטונים נוספים