ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח ביטוי גנים ברקמות ובשלבי התפתחות של emerald ash Borer באמצעות PCR כמותי. דבר זה מושג על ידי דיסקציה של רקמות זחלים וסיווג של שלבי ההתפתחות. כשלב שני, מופק RNA מהרקמות ומשלבי ההתפתחות באמצעות triol reagent, המשמש לאחר מכן כתבנית ליצירת הגדיל הראשון, cDNA; לאחר סינתזת הגדיל הראשון של cDNA, מבוצע quantitative RT-PCR.

התוצאות שהתקבלו מראות ביטוי דיפרנציאלי של הגן המטרה ברקמות זחלים שונות ובשלבי התפתחות שונים, בהתבסס על נתוני השינוי המלא שהתקבלו מערכי סף המחזור (cycle threshold) לאחר הגברת quantitative R-T-P-C-R. שלום, אני Prakash Mi, החוקר הראשי (PI) של מעבדה זו במחלקה לאנטומולוגיה באוניברסיטת אוהיו (Ohio State University).

המעבדה שלי מתמקדת בעיקר בהיבטים הגנומיים או המולקולריים של האינטראקציות בין ה-emal, lash, burer לבין האש. ה-emal, lash Burer או EAB הוא מזיב פולש אקזוטי מסין המאיים על עצם קיומם של אוכלוסיות האש ברחבי צפון אמריקה. היום נציג בפניכם פרוטוקול ללמידת ניתוח ביטוי גנים ב-EAP באמצעות QPCR או PCR כמותי בזמן אמת.

חברי המעבדה שיהיו מעורבים בפרוטוקול זה הם Swapna pri ou, שתבצע את הדיסקציות של השסתומים, ולאחר מכן bin Bandari שידגים את בידוד ה-RNA. ולסיום, Lauren Rivera Vega תבצע את אנליזת ה-QPC. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את הביטוי הגני של ash.

אם כך, נתחיל. לפני תחילת הפרוצדורה, הניחו פגס אפר אמריקאי (emerald ash B) או פגס אפר אירופאי (EAD) בשלב הזחל על נייר סופג לח. עד לביצוע ההפרדות, שמרו תמיסת סליין במלח פוספט (phosphate buffered saline) בריכוז 1x שהוכנה טריה על קרח, כדי לשמור על קרירות הבאפר לאורך כל תהליך ההפרדה.

ראשית, קבעו את ה larvae של ה-EAB על לוחית הנתיחה באמצעות סיכות נתיחה עדינות. לאחר מכן, הוסיפו 1x PBS קר ללוחית הנתיחה. שלב ראשון, בצעו כריתת ראש ל-larvae באמצעות מספרי נתיחה עדינים.

לאחר מכן, הסר את פלג הבטן האחרון של הזחלים באמצעות פינצטה עדינה (של שעון). הרם את הקוטיקולה מגוף הזחל, ולאחר מכן בצע חתך לאורך הגוף באמצעות מספריים. הקפד לא לקרוע את המעי.

בזמן ביצוע החתך, יש לבודד בזהירות את רקמת המעי האמצעי (midgut) מרקמות אחרות כגון גופי שומן ורקמה חיבורית. לאחר מכן, שטפו את הרקמה בבופר 1X PBS טרי כדי להבטיח שאין זיהום של גופי שומן. העבירו את המעי האמצעי ל-500 µL של ריאגנט TRIzol שקולל מראש, בתוך מבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.5 mL.

בשלב הבא, בודדו את רקמת גוף השומן באמצעות פינצטה והעבירו אותה לשפופרת Eppendorf בנפח 1.5 milliliter המכילה 500 microliters של ריאגנט TRIzol מקורר. לבסוף, בודדו את רקמת הקוטיקולה מגוף הזחל על ידי גירוד של כל רקמה דבוקה, תוך הקפדה לא לפגוע בשלמות הרקמה.

שטפו את רקמת הקוטיקולה המבודדת בבופר PBS טרי והעבירו אותה לשפרורת eppendorf בנפח 1.5 מיליליטר המכילה 500 מיקרוליטר של ריאגנט טריאזול מקורר. ניתן לאחסן את רקמות גוף השומן, הקוטיקולה והמעי האמצעי המבודדות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד להפקת ה-RNA. כהכנה להפקת ה-RNA, מינו את דגימות ה-EAB השונות בהתאם לשלבי ההתפתחות.

שלבים אלה כוללים את השלבים הראשון, השני, השלישי והרביעי בכוכבים, ב-PrepU ובמבוגרים. כדי להתחיל את מיצוי ה-RNA, השתמשו תחילה בפיסות פלסטיק (pestles) כדי להומוגניзировать את הרקמות בתוך מבחנות einor בנפח 1.5 milliliter המכילות triol. לאחר ההומוגניזציה, השלימו את הנפח הכולל של כל דגימה ל-one milliliter באמצעות ריאגנט ה-triol.

עבור שלבי ההתפתחות, הומוגניזרו את החיה השלמה בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. לאחר מכן, הוסיפו מנה (aliquot) מההומוגנאט למיליליטר אחד של triol. דגרו את מבחנות הדגימה עם מיליליטר אחד של triol למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הוסף 200 microliters של כלורופורם לכל מבחנה מיד לאחר הוספת הכלורופורם. נער את המבחנות בעוצמה במשך כ-15 שניות. לאחר מכן, הדגר את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש דקות נוספות.

בשלב הבא, סבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 GS למשך 15 דקות בטמפרטורה של שני מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, ה-RNA יימצא בשכבה המימית. נפח השכבה המימית צריך להיות 600 µL או 60% מהנפח הכולל של ה-triol.

הסר בזהירות אך ורק את הפאזה המימית. נוכחות של חומרים מתחת לפאזה המימית תגרום לזיהום של ה-RNA שהופק. לאחר מכן, העבר את הפאזה המימית למבחנת einor של 1.5 milliliter המסומנת כראוי.

כדי להשקיע את ה-RNA מתערובת הפאזה המימית, הוסיפו 0.5 milliliters של isopropyl alcohol לכל מבחנה. הדגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר ההדגרה, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-12,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של שני מעלות צלזיוס. עם סיום הסבוב, השליכו את ה-S natin מהמבחנות.

RNA נמצא במשקע דמוי-ג'ל שנוצר בתחתית המבחנה. שטפו את המשקע ב-75% ethanol, על ידי הוספה של לפחות מיליליטר אחד של 75% ethanol לכל מיליליטר של תמיסה, וערבבו באמצעות vortexing. לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-7,500 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של 2°C.

שפכו את supernatant מהמבחנות. צנטריפוגו את המבחנות שוב בצנטריפוגה השולחנית הקטנה למשך דקה אחת. הסירו כל שארית supernatant מהמבחנה באמצעות פיפוט זהיר.

השאירו את המבחנה פתוחה ותנו למשקע להתייבש באוויר במשך חמש עד 10 דקות. היזהרו לא לייבש את המשקע יתר על המידה, שכן הדבר יפחית משמעותית את ממיסותו לאחר הייבוש באוויר. השעיקו מחדש את המשקע ב-dathyl percarbonate או במים שעברו טיפול ב-dep sea.

כמות המים המשמשת להשעיה מחדש של המשקע תהיה תלויה בגודלו. השתמש ב-50 µL של מים שעברו טיפול deep sea עבור משקע קטן, או ב-100 µL עבור משקע גדול. אפשר למשקע להתמוסס לחלוטין בתוך המים שעברו טיפול deep sea על ידי הזזת קצה הפ pipette מעלה ומטה מספר פעמים.

לאחר שהמשקע נמס, יש להניח את הדגימה בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש למדוד את הריכוז של כל דגימת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. לבסוף, יש לבצע סינתזה של הגדיל הראשון של cDNA עבור דגימות ה-RNA המתאימות באמצעות מערכת Invitrogen SuperScript first strand synthesis עבור RT-PCR.

ניתן למצוא הליך זה בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. כדי להתחיל בתכנון qPCR (quantitative real-time PCR), תכננו כל פריימר כך שתהיה לו טמפרטורת התכה של 60 °C וגודל תוצר של כ-100 base pairs. הגן AP par one משמש כגן העניין בניסוי זה.

גן ייחוס או בקרה פנימית נחוצים לצורך ניתוח מאוחר יותר ונורמליזציה של הנתונים. כאן, החלבון הריבוזומלי a P RRP one משמש כגן הייחוס. לאחר מכן, תכננו תבנית המציינת את שם הדגימה עבור כל באר ואת פלטת ה-QR tpcr.

זכרו לכלול סטנדרטים עבור כל גן ולפחות שתי חזרות טכניות לכל דגימה. לאחר מכן, הפעילו את מכשיר ה-QRT PCR והזינו את פרמטרי המחזור כדי להגדיר את הפלטה עבור מכשיר ה-CFX 96. ראשית, הכינו את ה-master mix עבור כל גן בשפופרת נפרדת לכל באר.

תערובת המאסטר (master mix) מורכבת משני מיקרוליטרים של מים נקיים מנוקלאז, ארבעה מיקרוליטרים של 2.5 x cyber green, מיקרוליטר אחד של פריימר קדמי (forward primer) ומיקרוליטר אחד של פריימר אחורי (reverse primer), לנפח כולל של שמונה מיקרוליטרים. בהתאם לתבנית שתוכננה מראש, יש להוסיף שני מיקרוליטרים של CDNA לכל באער. לאחר מכן, יש להוסיף שמונה מיקרוליטרים מתערובת המאסטר לכל באער, כך שיתקבל נפח כולל של 10 מיקרוליטרים לכל תגובה. יש לבצע שאיבה ושחרור חוזרים (pipette up and down) כדי להבטיח שהדגימה מעורבבת היטב.

יש לוודא שלא נשאר נוזל על הטיפ. כדי למנוע זיהום צולב, יש להשתמש בטיפ חד עבור כל דגימה. לאחר השלמת הכנת הפלטה כולה, יש לכסות את הפלטה בסרט הדבקה אופטי.

הימנעו מנגיעה בסרט, שכן נוכחות של שומן עלולה להשפיע על הקריאה. לאחר מכן, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-500 RPM למשך דקה אחת כדי להבטיח שכל התוצרים בבארות נמצאים בתחתית הפלטה לאחר הסבב. ודאו שאין קרח או מים בתחתית הפלטה.

לבסוף, מקמו את הפלטה במכשיר ה-QR TPCR והפעילו את תוכנית ה-PCR; התוצאות המייצגות הן עבור זחלי EAB. הדיסקציה וה-QR TPCR מוצגים כאן. דיסקציה של זחלי EAB צריכה לחשוף את המעי האמצעי במרכזו של זחל ה-EAB.

המעי האמצעי של זחל EAB מבודל כפי שמוצג כאן, ערכי ביטוי יחסיים ממוצעים או RAVs. עבור הגן para trophin AP par one מוצגים כאן נתונים עבור רקמות זחל שונות, כולל הקוטיקולה, המעי האמצעי וגופי השומן. החלבון הריבוזומלי הספציפי ל-EAB, ARP one, שימש כביקורת פנימית לנרמול הנתונים שהתקבלו עבור הגן הנחקר.

שינוי הקיפול היחסי של AP AP par one חולץ עבור רקמות הזחלים השונות. רקמת הקוטיקולה הראתה את הביטוי הנמוך ביותר ולכן נלקחה כדגימת כיול לממוצע ה-RVs עבור AP Perry. One בשלבים התפתחותיים שונים של EAB, כולל הזחלים הראשונים, השניים, השלישיים והרביעיים בכוכבים.

רמות ה-PrepU והמבוגרים נקבעו באמצעות aprp one כביקורת פנימית לנורמליזציה של הנתונים. השינוי היחסי (fold change) של AP Perry one נקבע עבור שלבי התפתחות שונים. במקרה זה, דגימת ה-PrepU הראתה את הרמה הנמוכה ביותר של mRNA ולכן שימשה ככיול (calibrator).

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע דיסקציות לטרליות ולאחריהן ניתוח ביטוי גנים באמצעות הלטרל, וכן של שלבי התפתחות שונים של Emeral ra באמצעות quantitative R-T-P-C-R במהלך ביצוע פרוצדורה זו. יש להקפיד במהלך הדיסקציה על מניעת זיהום צולב של דגימות הרקמה. כמו כן, יש לנקוט זהירות בעת ביצוע Q-R-T-P-C-R כדי להבטיח שכל דגימה תופלט לפיפט אל תא ה-PCR המתאים לה.

זהו זה. תודה שצפיתם בסרטון שלנו ובהצלחה בניסוייכם.