ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח ביטוי גנים ברקמות ובשלבי התפתחות של emerald ash borer באמצעות qPCR כמותי. דבר זה מושג על ידי ה disection של רקמות זחליים וסיווג של שלבי ההתפתחות. כשלב שני, יש לחלץ RNA מרקמות ומשלבי התפתחות באמצעות trizol reagent, המשמש לאחר מכן כתבנית ליצירת הגדיל הראשון, cDNA; לאחר סינתזת הגדיל הראשון של ה-cDNA, מבוצע quantitative RT-PCR.

התוצאות שהתקבלו מראות ביטוי דיפרנציאלי של הגן המטרה ברקמות זחליות שונות ובשלבי התפתחות שונים, בהתבסס על נתוני שינוי מלאים שהתקבלו מערכי סף המחזור (cycle threshold) לאחר הגברות של quantitative R-T-P-C-R. שלום, אני פראקש מי, החוקר הראשי (PI) במעבדה זו במחלקה לחרקים באוניברסיטת אוהיו סטייט.

המעבדה שלי מתמקדת בעיקר בהיבטים הגנומיים או המולקולריים של האינטראקציות בין ה-emal, lash, burer וה-ash. ה-emal, lash Burer או EAB הוא מזיק פולש אקזוטי מסין, המאיים על עצם קיומן של אוכלוסיות ה-ash ברחבי צפון אמריקה. היום נדגים לכם פרוטוקול ללמידת ניתוח ביטוי גנים ב-EAP באמצעות QPCR או PCR כמותי בזמן אמת.

חברי המעבדה שישתתפו בפרוטוקול זה הם Swapna pri ou, שתבצע את הדיסקציות של השסתום, ולאחר מכן bin Bandari שתדגים את בידוד ה-RNA. ולבסוף, Lauren Rivera Vega שתבצע את ניתוח ה-QPC. אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את ביטוי הגנים של ash.

בואו נתחיל. לפני תחילת ההליך, הניחו זחליי emerald ash B או EAD על נייר ספיגה לח. עד לביצוע ההבדילה, שמרו תמיסת 1x phosphate buffered saline או PBS שהוכנה טרי על קרח, כדי לשמור על קרירות הבופר לאורך כל תהליך ההבדילה.

لتחילת, קבע את הפסוליות של ה-EAB על לוח הניתוח באמצעות סיכות ניתוח דקות. לאחר מכן, הוסף 1x PBS קר ללוח הניתוח. ראשית, בצע דקפיטציה (הסרת ראש) לפסוליות בעזרת מספרי ניתוח עדינים.

לאחר מכן, הסירו את פלח הבטן האחרון של הלרווה באמצעות פינצטה של שעון. הרימו את הקוטיקולה מגוף הלרווה, ולאחר מכן בצעו חתך לאורך הגוף בעזרת מספריים. היזהרו לא לקרוע את מערכת העיכול.

בעת ביצוע החתיכה, בודד בזהירות את רקמת המעי האמצעי מרקמות אחרות, כגון גופי שומן ורקמה מחברת. לאחר מכן, שטוף את הרקמה בבופר 1X PBS טרי כדי להבטיח שאין זיהום של גופי שומן. העבר את המעי האמצעי ל-500 µL של ריאגנט TRIzol שהיה מקורר מראש, בתוך פרובל של 1.5 mL.

בשלב הבא, בודדו את רקמת גוף השומן באמצעות פינצטה והעבירו אותה למבחנה מסוג eend orph בנפח 1.5 מיליליטר המכילה 500 µL של ריאגנט triol מקורר. לבסוף, בודדו את רקמת הקוטיקולה מגופת הזחל על ידי גירוד של כל רקמה דבקה, תוך הקפדה שלא לפגוע בשלמות הרקמה.

שטפו את רקמת הקוטיקולה המבודדת בבופר PBS טרי והעבירו אותה לפקום Eppendorf בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 500 µL של ריאגנט טריאזול קר. ניתן לשמור את רקמות גוף השומן, הקוטיקולה והמעי האמצעי המבודדות בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע הפקת ה-RNA. כהכנה להפקת ה-RNA, מינו את דגימות ה-EAB השונות בהתאם לשלבי ההתפתחות.

שלבים אלו כוללים את השלב הראשון, השני, השלישי והרביעי בכוכבים, ב-PrepU ובמבוגרים. כדי להתחיל את מיצוי ה-RNA, השתמשו תחילה בעלי פסטל מפלסטיק כדי להומוגניзировать את הרקמות בתוך מבחנות einor בנפח 1.5 milliliter המכילות triol. לאחר ההומוגניזציה, הגבירו את הנפח הכולל של כל דגימה ל-one milliliter באמצעות ריאגנט ה-triol.

עבור שלבי הפיתוח, הומוגניזו את החיה כולה בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. לאחר מכן, הוסיפו מנה של ההומוגנאט למיליליטר אחד של triol. דגרו את מבחנות הדגימה עם מיליליטר אחד של triol למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הוסיפו 200 µl של כלורפורמה לכל מבחנה מיד לאחר הוספת הכלורפורמה. נערו את המבחנות בעוצמה למשך כ-15 שניות. לאחר מכן, הדגירו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש דקות נוספות.

בשלב הבא, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 GS למשך 15 דקות בטמפרטורה של 2°C. לאחר הצנטריפוגה, ה-RNA יימצא בשכבה המימית. נפח השכבה המימית צריך להיות 600 µL או 60% מנפח ה-triol הכולל.

הסיר בזהירות רק את הפאזה המימית. נוכחות של חומרים מתחת לפאזה המימית תגרום לזיהום של ה-RNA שהופק. לאחר מכן, העבר את הפאזה המימית לפרועת אפנידורן של 1.5 מיליליטר המסומנת כראוי.

כדי להשקיע את ה-RNA מתערובת הפאזה המימית, הוסיפו 0.5 milliliters של isopropyl alcohol לכל מבחנה. הדגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר ההדגרה, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של two degrees Celsius. לאחר הסבוב, השליכו את ה-S natin מהמבחנות.

ה-RNA נמצא במשקע בעל המרקם הג'לי שנוצר בתחתית המבחנה. שטפו את המשקע ב-75% ethanol, על ידי הוספה של לפחות מיליליטר אחד של 75% ethanol לכל מיליליטר של תמיסה, ולאחר מכן ערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-7,500 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של שתי מעלות צלזיוס (°C).

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנות. סובבו את המבחנות שוב בצנטריפוגה השולחנית הקטנה למשך דקה אחת. הסירו כל שארית של נוזל עליון מהמבחנה באמצעות פיפוט זהיר.

השאירו את המבחנה פתוחה והניחו למשקע להתייבש באוויר במשך חמש עד 10 דקות. היזהרו לא לייבש את המשקע יתר על המידה, שכן הדבר יפחית משמעותית את מסיסותו לאחר הייבוש באוויר. השעיקו מחדש את המשקע ב-dathyl percarbonate או במים שעברו טיפול ב-dep sea.

כמות המים המשמשת לריסספנסיה של המשקע תהיה תלויה בגודלו של המשקע. השתמש ב-50 µL של מים שעברו טיפול ב-dep sea עבור משקע קטן, או ב-100 µL עבור משקע גדול. הנח למשקע להתמוסס לחלוטין בתוך המים שעברו טיפול ב-dep sea על ידי העלייה והירידה של טיפ הפ pipette מספר פעמים.

לאחר שהמשקע נמס, מקם את הדגימה בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, מדוד את הריכוז של כל דגימת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. לבסוף, בצע סינתזה של הגדיל הראשון של cDNA עבור דגימות ה-RNA המתאימות באמצעות מערכת Invitrogen SuperScript first strand synthesis עבור RT-PCR.

ניתן למצוא פרוצדורה זו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. כדי להתחיל ב-quantitative real-time PCR או Q-R-T-P-C-R, תכננו כל פריימר כך שיהיה בעל טמפרטורת התכה של 60 °C וגודל תוצר של כ-100 base pairs. עבור ניסוי זה, AP par one משמש כגן למטרה.

נדרש גן ייחוס או בקרת פנימית לצורך ניתוח ומנורמליזציה של הנתונים בשלב מאוחר יותר. כאן, החלבון הריבוסומלי a P RRP one משמש כגן הייחוס. לאחר מכן, תכננו תבנית המציינת את שם הדגימה עבור כל באר ואת לוח ה-QR tpcr.

זכרו לכלול סטנדרטים עבור כל גן ולפחות שתי חזרות טכניות לכל דגימה. לאחר מכן, הפעילו את מכשיר ה-QRT PCR והזינו את פרמטרי המחזור כדי להגדיר את הפלטה עבור מכשיר ה-CFX 96. ראשית, הכינו את תערובת המאסטר (master mix) עבור כל גן בשפופרת נפרדת עבור כל באר.

התערובת הראשית (master mix) מורכבת משני מיקרוליטרים של מים נטולי נוקליאז, ארבעה מיקרוליטרים של 2.5 x cyber green, מיקרוליטר אחד של פריימר קדימה (forward primer) ומיקרוליטר אחד של פריימר אחורה (reverse primer), לנפח כולל של שמונה מיקרוליטרים. בהתאם לתבנית שתוכננה מראש, הוסיפו שני מיקרוליטרים של CDNA לכל באר. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים מהתערובת הראשית לכל באר, כך שיתקבל נפח כולל של 10 מיקרוליטרים לכל תגובה. בצעו פעולת פיפטאז (pipette up and down) כדי לוודא שהדגימה מעורבבת היטב.

בדקו שלא נשאר נוזל על הטיפ. כדי למנוע זיהום צולב, השתמשו בטיפ חדש עבור כל דגימה. לאחר הגדרת הפלטה כולה, כסו את הפלטה בסרט דביק אופטי.

הימנעו מנגיעה בסרט, כיוון שנוכחות של שומן עלולה להשפיע על הקריאה. לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-500 RPM למשך דקה אחת כדי להבטיח שכל המוצרים בבארות נמצאים בתחתית הפלטה לאחר הצנטריפוגציה. בדקו שאין קרח או מים בתחתית הפלטה.

לבסוף, מקמו את הפלטה במכשיר ה-QR TPCR והפעילו את תוכנית ה-PCR; התוצאות המייצגות עבור פstס של EAB מוצגות כאן. הניתוח וה-QR TPCR מוצגים כאן. ניתוח של פstס EAB אמור לחשוף את המעי האמצעי במרכז הזחול של ה-EAB.

המעי האמצעי של זחלי EAB מבודל כפי שמוצג כאן, ערכי ביטוי יחסי ממוצעים או RAVs. עבור הגן para trophin AP par one מוצגים כאן נתונים לרקמות זחליות שונות, כולל הקוטיקולה, המעי האמצעי וגופי השומן. החלבון הריבוסומלי ARP one, הספציפי ל-EAB, שימש כשליטה פנימית לנרמול הנתונים שהתקבלו עבור הגן הנחקר.

השינוי היחסי (relative fold change) של AP AP par one חולץ מרקמות זחליות שונות. רקמת הקוטיקולה הראתה את רמת הביטוי הנמוכה ביותר ולכן שימשה כדגימת כיול לממוצע ה-RVs עבור AP Perry. One בשלבים התפתחותיים שונים של EAB, כולל הגוזל הראשון, השני, השלישי והרביעי ב-stars.

רמות ה-PrepU והמבוגרים נקבעו תוך שימוש ב-aprp one כביקורת פנימית לנורמליזציה של הנתונים. השינוי היחסי (relative fold change) של AP Perry one נקבע עבור שלבי התפתחות שונים. במקרה זה, דגימת ה-PrepU הראתה את הרמה הנמוכה ביותר של mRNA ולכן שימשה ככיול (calibrator).

הראינו כעת כיצד לבצע דיסקציות לטראליות ולאחר מכן ניתוח ביטוי גנים באמצעות הרקמה הלטראלית, וכן של שלבי התפתחות שונים של Emeral ra באמצעות quantitative R-T-P-C-R במהלך הליך זה. יש להיזהר בעת הדיסקציה כדי למנוע זיהום צולב של דגימות הרקמה. כמו כן, יש לנהוג בזהירות בעת ביצוע Q-R-T-P-C-R כדי להעביר באמצעות פיפט את הדגימות הרלוונטיות לתוך תאי ה-PCR המתאימים.

זה הכל. תודה שצפיתם בסרטון שלנו ובהצלחה בניסוייכם.