פלאש מקפיא Cryosectioning E12.5 מוח עכבר

שלום, אני ספנסר קרלי מאוניברסיטת קליפורניה אירביין וממעבדתו של אד מאקי, ואני אדגים כיצד לבצע חיתוך קריוסטטי (cryosectioning). לשם כך, אשתמש תחילה בריאגנטים הנפוצים הבאים. תרכובת ההטמעה או מדיום ההטמעה שבהם אני משתמש נקראים OCT, עבור optimal cutting temperature.

זהו תמיסה שקופה, היא סמיכה וצמיגית מאוד, והיא מחזיקה את הרקמה היטב בזמן שניתן להכווינה ולאחר מכן היא קופאת, ובסופו של דבר היא מסיסה במים כך שניתן להסירה במהלך כל סוג של הליך צביעה. לכן אני מטמיע את הרקמה בתבנית. מישורי הקפאה אלו עבור דגימות ביופסיה מגיעים בגדלים שונים.

אני אשתמש בתבנית קטנה יותר זו מכיוון שאני עובד עם רקמה עוברית של עכבר. אנו מקפיאים את הרקמה שלנו בהקפאה מהירה בתוך חנקן נוזלי. לכן, ראשית אני אמלא את בקבוק הוואקום המגן הזה בחנקן נוזלי מהמכל שלנו כאן.

לפני הקפאה מהירה של הרקמה, יש לבצע שלב הנקרא הגנה קריוגנית (cryoprotection) של הרקמה, אחרת תהליך ההקפאה עצמו יהרוס אותה. לשם כך, טובעים את הרקמה בתמיסת סוכרוז 30% למשך לילה. אם התהליך אורך זמן רב יותר, הדבר אינו מהווה בעיה, כל עוד הרקמה שוקעת.

וכפי שניתן לראות, ראשי עכברים ביום עוברי 12.5 שקעו בתוך תמיסת הסוכרוז, ולכן הם מוכנים להקפאה. כעת אני פשוט אשפוך את הרקמה שנמצאת בתמיסת הסוכרוז לתוך צלחת גדולה יותר, כדי שאוכל לטפל ברקמה. אני אקח מעט מ-OCT ואשפוך אותו לתוך צלחת של 35 מילימטר המונחת על מכסיה, כדי שאוכל להגיע אליה בזווית.

מכיוון שה-OCT נערם לאורך הקצה לצורך העמקה, אני משתמש בזוג פינצטות קהות ישנות, פשוט כי אין צורך שהן יהיו חדות ואין רצון להרוס זוג פינצטות נוסף. לכן, אני לוקח אותן, מרים בעדינות רבה את אחד הראשים הללו, ומניח אותו בתוך אמבט ה-OCT הראשון.

אני רק רוצה לצפות את העובר ב-OCT. דבר זה מאפשר הקפאה טובה ואחידה יותר של הרקמה. יש לוודא שלא נשאר סוכרוז סביב הרקמה ושאין בועות אוויר.

הימנעו לחלוטין מבועות אוויר. לכן, אני מערבב בעדינות את ה-OCT סביב ומתחת לראש, מזיז את הראש בתוך ה-OCT ומניח לו להישאר שם למשך מספר שניות בעוד אני ממלא את תבנית הקריו. כעת אני ממלא את תבנית הקריו ב-OCT, ושוב, תוך הימנעות מבועות.

אני פשוט אמלא את התבנית עד למעלה. וכפי ששמתם לב, סימנתי את התבנית, כך שאוכל לזהות את הכיוון לאחר ההקפאה.

כאשר ה-OCT קופא, הוא הופך ללבן ולא ניתן לראות יותר את הרקמה. לכן, יש לסמן את תבנית הקריו (cryo mold) בעזרת טוש קבוע.

למעשה קיבלתי בועה ב-OCT, לכן אשתמש בפינצטה כדי לדחוף אותה החוצה מעבר לקצה. אין לרצות שהבועה תפריע להקפאת הרקמה. כעת אעביר את הראש מצלחת זו אל ה-OCT שנמצא בתבנית שלי.

אני פשוט ארים אותו מהצלחית ואעביר אותו לתבנית בעדינות רבה. לאחר מכן, אעבור למיקרוסקופ כדי ליישר את הרקמה. הרקמה נמצאת כעת בתבנית הקריו שלי, ואני אסתכל דרך המיקרוסקופ כדי שאוכל לקבוע את הכיוון שלה.

אני עומד לבצע חתכים קורונליים דרך ראש העכבר הזה. לכן, עלי להכווינו כך שאוכל למקמו בקריוסטט לצורך ביצוע החתכים הקורונליים. שוב, אני משתמש בפינצטה קהה זו, וכפי שניתן לראות, יש כאן כמה בועות ואני אנסה כמיטב יכולתי להוציא אותן.

אבל הבועות הקטנות הללו אינן גרועות. לא הבחנתי בשום בעיה בגלל הבועות הקטנות הללו. פשוט חשוב להימנע מבועות גדולות.

לכן אני פשוט אזיז אותם החוצה כמיטב יכולתי ואנגב את הפינצטה לעיתים קרובות, כיוון שבאופן זה ניתן להימנע מבועות בצורה טובה יותר. וכעת, אם ניתן לראות את הסימונים שלי, יש לי T כאן למעלה ו-F משמאלי. זה פשוט מציין עבורי שהראש, החלק העליון של הראש, יהיה למעלה והחלק הקדמי או הפנים יהיו משמאלי.

בדרך זו אני יודע איזה משטח לחתוך עבור חתכים קורונליים ואני רק מזיז בעדינות את הרקמה. ושוב, לעיתים הדבר גורם להיווצרות בועות וכדאי פשוט לדחוף אותן החוצה כדי שלא יקפאו יחד עם הרקמה. לכן נוכחות של בועות היא בעייתית, בעיקר משום שבמהלך ההקפאה, בועות ברקמה עלולות לגרום להקפאה לא אחידה.

מטרת ההקפאה המהירה היא להקפיא את כל הדגימה בבת אחת. כמו כן, בעת החיתוך של הרקמה באמצעות הקריוסטט, אם הלהב יעבור דרך בועה במקום דרך ה-OCT או הרקמה, הדבר עלול לגרום לתקיעה או לקריעה, ולהרוס או לשבור את הרקמה. לכן, יש להימנע מבועות אלו בכל מחיר.

במיוחד הגדולים יותר. לכן אני עדיין מיישרת אותו כאן. רקמה זו קובעה במשך 24 שעות, כך שהיא די עמידה למניפולציות שלי.

רקמות אחרות עשויות להיות רכות יותר, ולכן יש לפעול בעדינות רבה. לאחר שמיקמתי את הדגימה תחת המיקרוסקופ, כאשר הפנים פונה שמאלה וראש הדגימה פונה למעלה, עליי לוודא שהמיקום נכון גם במישורי התמצאות אחרים. לכן, אגביה את הדגימה ואבחן את כל פאות הקובייה כדי לוודא שהיא ממוקמת כהלכה.

ואני רואה שזה מוטה מעט למטה, לכן עליי פשוט להרים עם הפינצטה שלי. בסדר? וזה בהחלט דורש תרגול רב. אוקיי, זה נראה טוב.

כעת אני אגש לכאן ואקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. כעת, לאחר שהרקמה מונחת באופן נכון בתבנית הקריו, אני אשפוך את החנקן הנוזלי לתוך צלחת זו. זוהי צלחת פטרי פלסטית רגילה לתרבית רקמה, עד למילוי מלא.

זה מתאדה די במהירות. אני אקח את הפינצטה ואוריד את תבנית הקריו. וכפי שניתן לראות, כיפפתי את השפה התחתונה.

זה בהחלט מאפשר טיפול טוב יותר. אני עומד להקפיא את זה. וככל שהרקמה וה-OCT קופאים, הם הופכים ללבן מוצק.

וברגע שזה יושלם, הכל יהיה לבן. ואז עליי להעביר במהירות את הרקמה הקפואה למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות לצורך אחסון. יש להחזיק אותה כך שהרקמה לא תשקע.

לכן יש להיות זהירים מאוד ולהחזיק את הדגימה רק על פני השטח של החנקן הנוזלי. אוקיי, כעת היא קפואה. אחזיקו אותה שם למשך מספר שניות נוספות לפני שאעביר אותה למקפיא של 80-°C.

אוקיי, עכשיו אני מעבירה את זה למינוס 80. הוצאתי את הרקמה מהמינוס 80 והנחתי אותה בתוך הקריוסטט הזה. טמפרטורת התא היא למעשה מינוס 24 °C.

בשלב זה יש להמתין כחצי שעה עד שעה כדי שהרקמה תגיע לשיווי משקל טרמי לפני שניתן להתחיל בחיתוך. אחרת, היא תהיה שבירה מדי. מכיוון שכל מכשירי הקריוסטט שונים, אני רק אצביע על כמה מהדברים הבסיסיים לגבי המכונה הזו.

אנו משתמשים ב-Leica CM 30 50 s. זוהי מכונה טובה כיוון שיש לה יחידת קירור נפרדת לדגימה עצמה, המהווה יתרון משמעותי. ניתן לקבוע את טמפרטורת הדגימה, שכן רקמות שונות דורשות טמפרטורות חיתוך שונות.

לכן, כאשר אתם טוענים את הרקמה לראשונה, עליכם לבצע מספר כיוונונים. אלו דומים בכל מכשירי הקריוסטט; חלקם אלקטרוניים וחלקם מופעלים ידנית.

לדוגמה, תצטרכו להסיג את זרוע הקריוסטט או להקימה כדי למקם אותה רחוק יותר או קרוב יותר להב. ניתן לעשות זאת במהירות או לאט. ניתן לקבוע את עובי החיתוך באמצעות סימני הפלוס והמינוס כאן.

תוכלו לבחור בין עובי קיצוץ (trim) לעובי חיתוך (section), כפי שמוצג בכפתור המרכזי כאן. תוכלו לקבוע את הטמפרטורה של התא או של הדגימה עצמה לצד התצוגה הדיגיטלית הזו, פשוט על ידי לחיצה על הכפתור הזה ושימוש בחצי הטיפוח למעלה או למטה כדי להתאים את הטמפרטורה. עבורנו, כאשר אנו מבצעים קיריו-חיתוך (cryosectioning), אנו משתמשים בעגיות מיקרוסקופ מסוג Super frosts plus של מותג Fisher.

הם מצופים בדבק כלשהו כדי שהרקמה לא תיפרד במהלך העיבוד. לעיתים, במהלך החיתוך, תבחינו שהרקמה נראית מעט רכה, וסימנים לכך יהיו כאשר היא פוגשת את הלהב ומתקבצת. כדי לפתור זאת, ניתן להשתמש במכשיר ה-super friendly freeze של מותג Fisher.

המכשיר מקפיא את הרקמה בהקפאה מהירה; פשוט מכוונים אותו אל הרקמה ולוחצים על ההדק, והוא יקפיא במהירות את הרקמה אם היא רכה מדי. לפני הצמדת הרקמה לראש המכשיר (chuck) לצורך חיתוך, ארצה להוביל אתכם לסיור קצר בחלק מהמרכיבים של המכונה כאן. זהו המקום שבו טוענים את הלהב, המאובטח באמצעות לוחית מתכת זו.

על ידי הרמה של זרוע זו, ניתן להסיר ולהחליף את הלהב לפי הצורך. ודאו שהלהב מהודק היטב. אין להדק את הלהב יתר על המידה, שכן הדבר עלול לגרום לעיוותו.

תוכלו להבחין בחיתוך שעובי הרקמה אינו עקבי. לכן, אין להוריד את הזרוע הזו עד הסוף. יש להביא אותה למצב שבו היא כמעט גובהה של הלהב עצמו.

זהו רכיב נוסף שייתכן ותצטרכו לכוון במהלך החיתוך. זהו לוח מניעת גלגול (anti-roll plate). זהו חלק זכוכית המתאים למחזיק זה, וניתן לכוון אותו באמצעות בורג הקפיץ הזה.

ובשكل בסיסי אתם מזיזים אותו קדימה או אחורה. פעולה זו תשמור על הרקמה או על החתכים שלכם שטוחים, כך שתוכלו להניח אותם על שקופית. דבר נוסף שייתכן והתרצו לכוונן במהלך החיתוך הוא המיקום על הלהב שבו מתבצע החיתוך בפועל.

כיצד מבצעים את הכיוון? פשוט מרימים את המנוף הזה וניתן להזיז את כל המנגנון שמאלה או ימינה. משתמשים בכך רק אם מבחינים שהרקמה נתקעת בחלק מסוים של הלהב, או אם רוצים לחסוך בלהבים כיוון שהם יקרים למדי. כך ניתן למצוא אזור נקי ומתאים פשוט על ידי הזזת המנגנון קדימה ואחורה.

דבר נוסף שניתן לכוון הוא זווית החיתוך. כעת, בצד כאן, שלא תוכלו לראות, ישנם שלושה תנוחות שונות. אנו משתמשים רק בתנוחה המרכזית, ואת הכוונון מבצעים על ידי הרמת המנוף השני הזה.

בנוסף, ניתן להעלות ולהוריד את המכשיר הזה. אנו תמיד שומרים אותו במרכז, לכן אני אשאיר אותו כך כעת.

כאן מאחור נמצא ראש הקריוסטט. הוא מחזיק את דגימת הרקמה הקפואה בזמן שהיא נחתכת. הוא נע למעלה ולמטה ומתקדם לעבר הלהב.

ובאופן בסיסי, מרכיבים את הרקמה על הצ'אק (chuck) הזה, ואת הצ'אק נמקם בראש המכשיר, נהדק אותו, ולאחר מכן נשתמש בכפתורים שמאחור כדי לכוונן את הזווית לצורך השגת חיתוך ישר יותר. כעת אני עומד להרכיב את הרקמה על הצ'אק. יש לשמור על הצ'אקים בטמפרטורת החדר, כיוון שראשית מוסיפים שכבה של OCT ולא רוצים שהיא תקפא באופן מיידי, כדי שתיווצר שכבה שטוחה ויפה.

ונשתמש במכשיר הזה כאן, הוא נקרא מחלץ חום (heat extractor). למעשה, הוא ישמש להשטחת ה-OCT בזמן ההקפאה. לכן, הדבר הראשון שאני עושה הוא לקחת את ה-OCT בטמפרטורת החדר ולהניח אותו במחזיק הזה.

קחו חלק מהבועות של ה-OCT שלי. זה לא משנה כאן כי הן ייסחטו החוצה. פשוט הוסיפו מעט, אתם לא זקוקים לכמות גדולה.

קחו את מו extracts החום והניחו אותו בדיוק שם. המתינו מספר שניות. כעת ניתן לראות שה-OCT שטוח ויציב.

כעת, לאחר שיש לי את הרקמה, עליי לסמן את ה-OCT עצמו. אסמן נקודה על ה-OCT כדי להצביע על מיקומו. סימנתי את החלק העליון בנקודה כחולה.

כעת אוציא את בלוק הרקמה מהתבנית, ואעשה זאת פשוט על ידי לחיצה על גבה. אלחץ בעדינות על הגב ואדחף אותו לכף ידי, אך שוב, איני רוצה שהוא יפשיר, לכן אחזיר אותו מיד פנימה.

כעת ניתן לראות את גוש הרקמה עם הסימון הכחול שהנחתי עליו. כך אני יודע שזהו החלק העליון של ראשו של העובר. אני מעוניין לבצע חיתוך דרך הפנים, כיוון שמדובר בחתכים קורונליים.

כעת אוסיף טיפה גדולה נוספת של OCT, ועלי לפעול במהירות כיוון שהכל קר. אקח את הרקמה ואניח אותה בדיוק במרכז, ואוודא שהיא שטוחה כנגד שכבת ה-OCT שכבר נוצרה. כעת אמתין שהיא תקפא, דבר שייקח כדקה או שתיים.

כעת תהליך ההקפאה הושלם. אני עומד לקחת את הרקמה שמותקנת על הצ'אק, להניח אותה בתוך הראש, ליישר אותה ככל הניתן, ולאחר מכן להדק. כך היא תהיה מהודקת היטב.

אני אמקם זאת ממש לפני הלהב ולאחר מכן אקדם אותו, דבר שעשוי להיערך מספר שניות. אוקיי, כעת אשתמש בקצה השטוח של הלהב כדי לבצע מיקום מדויק של הרקמה. לכן, פשוט אסתכל על הקצה ואניע את הרקמה למעלה ולמטה רק כדי לוודא שהקצוות מיושרים.

אם הם לא עשו זאת, אתם יודעים, זה עשוי להיראות בערך כך. אני מגזים באופן ברור, אך ניתן לראות כאן שזה לא ישר ביחס ללהב. לכן אני ממשיך לבצע התאמות עד שאני מרגיש שזה ישר ככל שניתן.

אני חושב שזה נראה די טוב. לכן אני בוחן את זה מכל זווית כדי לוודא שהרקמה תיחתך בקו ישר מול הלהב, ואני משתמש בקצה הלהב כדי לסמן זאת. אני מסתכל מלמעלה ומסתכל מהצד, והרקמה נראית למעשה די טוב.

אינני צריך לבצע התאמות רבות, אך אם הייתי צריך, הייתי משתמש פשוט בכפתורים שנמצאים בחלק האחורי של הראש. באמצעות סיבובם שמאלה או ימינה, ניתן לראות שניתן לבצע התאמות מדויקות בדרך זו. אך זה נראה די טוב.

כעת, אני מקדם את הרקמה. היא עדיין לא נחתכת מכיוון שהיא אינה נשענת על הלהב. הרקמה מוטמעת עמוק בתוך ה-OCT.

לכן, הגעה לרקמה עשויה להיארך מספר דקות. אין להניע את המכשיר במהירות גבוהה מדי, שכן הדבר עלול לגרום לתפיסה ולסדק ב-OCT וברקמה, אך גם אין להניע אותו לאט מדי כדי שהתהליך לא יימשך זמן רב מדי. במכשיר זה קיימת פונקציה שימושית המאפשרת ביצוע קיצוץ (trim) בחיתוך עבה יותר, מה שמאפשר התקדמות מהירה יותר.

כעת אני למעשה חותך דרך ה-OCT, ולכן אני מאיט מעט. עדיין לא הגעתי לרקמה, אך זהו השלב שבו אני מעריך כיצד תמשיך החיתוך. משתנים רבים יכולים לגרום לכך שחיתוך הרקמה ילך בצורה טובה מאוד או גרועה מאוד.

מה שאני מגלה שקורה הכי הרבה עם הקריוסטט הזה הוא שהרקמה למעשה קרה מדי. הורדתי את הטמפרטורה, אך נראה שהיא עדיין מעט קרה מדי. והתוצאה היא שהלהב רועד בזמן החיתוך דרך הרקמה ודרך ה-OCT.

כך תבחינו בקווים קטנים הללו, קווים אופקיים העוברים דרך ה-OCT. מה שאני עושה הוא להשתמש באגודל כדי לחמם פשוט את הקצה, לחמם את ה-OCT רק על ידי נגיעה עדינה, תוך החלקת האגודל, למשך זמן קצר בלבד. לאחר מכן, כאשר ביצעתי חיתוכים דרכו, שמתי לב שהתוצאות טובות בהרבה ושהרעידות (chattering) פסקו.

אלו הם הדברים שאבחן לפני שאגיע לרקמה. שמתי לב שכאשר הלהב עובר דרך הרקמה, נוצרת תקיעה או סדק, למעשה, ב-OCT. לכן, אחד הדברים שאעשה תחילה הוא להחליף את הלהב.

אינני בטוח כמה זמן הלהב הזה מורכב כאן ומי השתמש בו לפני, לכן פשוט אשיג להב חדש. אלו להבים חדים מאוד כמובן, לכן יש להיזהר. כעת אכוון את לוחית מניעת הגלילה; ישנו בורג עם קפיץ בחלק התחתון כאן, שרק צריך להגיע אליו מלמטה ואפשר להזיז אותו פנימה או החוצה.

כעת התקדמתי וביצעתי מספיק חיתוכים כך שהגעתי לרקמה. לרוע המזל, ישנו סדק בבלוק ה-OCT, דבר שקורה לעיתים קרובות ולרוע המזל לא ניתן באמת לשלוט בו, אך ישנם דברים שניתן לעשות כדי לתקן זאת. אם הסדק היה עובר דרך הרקמה, היה עלי להשליך את הדגימה או לנסות להציל את מה שניתן.

במקרה זה, נראה שהסדק נמצא מעל הרקמה. לכן, מה שאעשה הוא לקחת להב תער שהיה בתוך הקריוסטט. הוא מקורר.

אני אנסה פשוט להסיר את החלק הסדוק, שנמצא בחלקו העליון של בלוק ה-OCT. שוב, אשתמש באגודל שלי כדי לחמם את פניו של בלוק ה-OCT. לאחר מכן אבצע חיתוך, ואם תוכלו לראות כאן, הוא סדוק.

בשלב זה הסרתי את החלק עם הרקמה, ואת שאר ה-OCT פשוט השלכתי, שכן זה היה החלק הסדוק. לכן, מה שאעשה כעת הוא לנסות לקלף את החלק הסדוק באמצעות להב תער מקורר. עליי להיכנס בזווית ישרה מאוד, להשתמש בשתי הידיים ולהפעיל לחץ אחיד על הלהב.

אני אזיז את הלהב קדימה ואחורה לתוך ה-OCT. אני מניע אותו הלוך ושוב, תוך כדי חיתוך איטי לתוך ה-OCT. אני מקווה שאני מסיר את החלק הסדוק.

בסדר, אני אגזור על ידי הסרת עודפי ה-OCT. בסדר, זה נראה טוב. כעת אני אסוג מעט עם הראש מכיוון שיצרתי קצוות שעלולים להיקלע להב, ואם זה יקרה, זה עלול למעשה לשבור את ה-OCT והרקמה, מה שיהרוס את הדגימה שלי.

סבבתי אחורה, לכן אצטרך להתקדם מעט יותר כדי לחזור לרקמה, ובתקווה שתיקנתי את הסדק. אוקיי, עכשיו אני חוזר לרקמה. אוקיי, נראה שכן תיקנתי זאת.

כעת אין עוד סדקים ב-OCT שיהפכו את לקיחת החתכים להרבה יותר קלה. עכשיו אתקדם לחלק ברקמה שמעניין אותי. כרגע הגעתי ממש לפני השטח ואני מעוניין להגיע למוח של עובר זה.

אלה גדולים מספיק כדי שאוכל לראות בפועל את המבנים שמעניינים אותי. שכחתי לציין שאני משתמש במברשות אלו כדי לנקות את הלהב בין כל חיתוך שאני עומד ללכוד. הגדולה שבהן משמשת רק לניקוי האזור ולהסרת שאריות ה-OCT.

אני משתמש גם במברשות עדינות אלו כדי להזיז את החתך כנגד פלטה קרה זו, כדי למקמו בעת לכידתו על המשטח. שוב, אלה נשמרות קרות, כדי שה-OCT לא יימס וידבק למברשות. כדי ללכוד את הרקמה, אני אחמם תחילה את ה-OCT והרקמה באמצעות האגודל שלי.

ואקח אחת מהשקופיות שכבר סימנתי. אני מחזיק אותה הפוך, וכל אחד עושה זאת בצורה שונה. אך הדרך שבה אני עושה זאת היא שאני מעדיף להחזיק את הפינה הימנית העליונה ביד ימנית כאשר השקופית פונה כלפי מטה.

לאחר מכן, אשתמש באגודל שמאל כנקודת ציר כדי שאוכל לרדת במאונך אל הפלטה וללכוד את השבב. ה-OCT והרקמה למעשה יימסו על השקף וייצמדו אליו. לכן, ראשית אחמם את הרקמה עם האגודל, אבצע חיתוך איטי, אקח את השקף, אחזיק בפינה הימנית ביד ימין, אזיז את הפלטה, אוריד אותה במאונך למטה ואתן לה להמיס.

אבדוק את הרקמה כדי לוודא שאין קפלים או בועות ושהיא נראית תקינה. אמשיך בכך עד שאבצע חיתוכים של המוח כולו. אני בוחן כעת את החיתוכים דרך מיקרוסקופ ההשבחה כדי לוודא שהם נראים תקינים, והם אכן נראים כך; ניתן לראות את המוח הקדמי בחלקו העליון של החיתוך, וכולם נראים טוב מאוד.

ניתן להשתמש בחתכים קריוגניים אלו עבור תהליכים כגון היברידיזציה במקום (in situ hybridization). לעיתים אנו מבצעים היסטולוגיה בסיסית, צביעות H&E. ניתן לבצע גם אימונופלואורסצנציה ומספר בדיקות דומות.

עבורי באופן ספציפי, חתכים אלו קובעו ועובדו עבור היברידיזציה in situ. לכן, זהו השלב שאבצע בהמשך.