Name: הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למדו הכנת תאי S2 של Drosophila למיקרוסקופ אור באמצעות ציפוי lectin לשיפור הידבקות התאים ושטחתם. שיטה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של מבני תאים ולוקליזציה של חלבונים באמצעות פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לסרטן P30 CA23074, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מוסדיים גרנט 74-001-31, ואת Univ. אריזונה GI נבג (NCI / CA9506O NIH).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עבור שדה ביולוגיה של התא, מערכת האידיאלי יהיה זול לתחזוקה, קל לתפעל, ו מקובל מגוון רחב של טכניקות. תאים תסיסנית S2 לספק את הדרישות הללו, ולכן יש להפוך במהירות את המערכת של בחירה עבור מספר הולך וגדל של התא מעבדות הביולוגיה. הצגנו סקירה קצרה של השיטות להכנת תאים S2 עבור מיקרוסקופיה. בתוקף בולט של תאים S2 היא העובדה כי הם גדלים היטב באווירה נורמלית בטמפרטורת החדר, ולכן הם יכולים שמאל על המיקרוסקופ במשך תקופ...

<table><tbody><tr><td>תאי S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>תאי S2</td><td>DGRC</td><td>מספר מלאי 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>תאי S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>מצע ללא סרום</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>מצע ללא סרום</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>מצע ללא סרום</td></tr><tr><td>מצע Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>יש להוסיף 10% (סופי) FBS שעבר אינאקטיבציה תרמית כדי להכין מצע מלא.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (Fetal bovine serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>עבר אינאקטיבציה תרמית</td></tr><tr><td>תמיסת אנטיביוטיקה 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>מכילה penicillin (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomycin (10000 &amp;#x03BC;g/mL), ו-&lt;br/&gt;amphotericin B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>פורמלהיד</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>תמיסת 32%</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>אנहाइडרי, בדרגת ACS</td></tr><tr><td>נכוחי מולקולרי (Molecular sieves)</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>סוג 3A</td></tr></tbody></table>

הכנת תסיסנית תאים s2 עבור במיקרוסקופ אור

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

מערכת הניסוי האידיאלי יהיה זול וקל לתחזוקה, מקובל מגוון רחב של טכניקות, יהיה נתמך על ידי ספרות ענפה רצף הגנום באתר. בתרבית תאים תסיסנית S2, תוצר של 20-24 עוברים משויך 1 שעה הישן, בעל כל התכונות האלה. כתוצאה מכך, התאים S2 הם מאוד מתאימים לניתוח של תהליכים תאיים, כולל גילוי הגנים המקודדים את המרכיבים המולקולריים של תהליך או מנגנון של עניין. התכונות של תאים S2 שאחראים ביותר עבור השירות שלהם הקלות שבה הם נשמרים, רגישות מופלאה שלהם להפרעות פעמיים תקועים RNA בתיווך (DS) (RNAi), ו נהילות שלהם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו גם לחיות או קבוע תאים. תאים S2 ניתן לגדל מגוון רחב של כלי התקשורת, כולל מספר זול, זמין מסחרית, מלא מוגדרים, סרום ללא התקשורת 2. בנוסף, הם גדלים בצורה אופטימלית ובמהירות על 21-24 מעלות צלזיוס, יכול להיות מתורבת במגוון רחב של מיכלים. שלא כמו בתאי יונקים, תאים S2 אינם דורשים אווירה מוסדר, אך במקום לעשות היטב עם אוויר רגיל יכול אפילו להיות נשמר צלוחיות אטום. משלימים את הקלות של RNAi בתאים S2 היא היכולת לנתח בקלות פנוטיפים בניסוי המושרה על ידי שלב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים קבוע או לחיות. תאים S2 לגדול בתרבות כמו בשכבה יחידה, אבל לא להציג עיכוב קשר. במקום זאת, תאים נוטים לגדול במושבות בתרבויות צפופה. באותה צפיפות נמוכה, תרבויות S2 גדל על זכוכית או תרבות שטופלו פלסטיק רקמות עגולות רופף המצורפת. עם זאת, ציטולוגיה של תאים S2 ניתן לשפר במידה ניכרת בכך שפיתה אותם לשטח נרחב על ידי culturing בקצרה אותם על משטח מצופה לקטינים, concanavalin (ConA) 3. תאים S2 יכול להיות גם transfected ביציבות עם סמנים fluorescently-tagged למבנים תווית או אברונים עניין בתאים חיים או קבוע. לכן, התרחיש הרגיל עבור ניתוח מיקרוסקופי של תאים היא זו: הראשונה, תאים S2 (אשר יכול להחזיק transgenes להביע סמנים מתויג) מטופלים על ידי RNAi לחסל את חלבון המטרה (ים). זמן RNAi הטיפול יכול להיות מותאם כדי לאפשר הבדלים חלבון להתהפך קינטיקה כדי למזער טראומה תא / מוות אם חלבון המטרה חשובה הכדאיות. בשלב הבא, בתאים שטופלו מועברים מאכל המכיל coverslip מראש מצופה conA לגרום לתאים להתפשט בחוזקה לדבוק הזכוכית. לבסוף, התאים הם צילמו עם הבחירה של החוקר מצבי במיקרוסקופ. תאים S2 טובים במיוחד ללימודי הדורשים ראיה מורחבת של תאים חיים מאז תאים אלה להישאר בריאים בטמפרטורת החדר ואת האווירה נורמלי.

תסיסנית שניידר (S2) הם תאים מערכת פופולרי יותר ויותר על גילוי וניתוח פונקציונלי של גנים. המטרה שלנו היא לתאר כמה טכניקות להפוך תאים מיקרוסקופיים S2 כגון מערכת ניסיונית חשוב יותר ויותר.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

המערכת הניסויית האידיאלית תהיה זולה וקלה לתחזוקה, ניתנת ליישום של מגוון טכניקות, ותהיה נתמכת על ידי ספרות רחבה...

המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר את הכנת תאי Drosophila S2 עבור מיקרוסקופיה של אור. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת צלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית. השלב השני של ההליך הוא ציפוי תחתית הזכוכית בלקטין conval.A כדי לקדם היצמדות והשטחה של תאי S two. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא הוספת מצע גידול ותאי S two לצלוחית התרבית. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא קיבוע וצביעה אימונוהיסטוכימית של תאי S two בצלוחית התרבית.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות לוקליזציה של חלבונים רצויים המסומנים ב-fluoro four או מסומנים אימונולוגית, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאי S two חיים או מקובעים, בהתאמה. היי, אני ג'ואי קלאב מהמעבדה של גרג רוג'רס במחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה באוניברסיטת אריזונה. אני ג'ון ניי, גם אני ממעבדתו של רוג'רס.ואני דן באסטר. אני מהמעבדה של גרג רוג'רס. היום נדגים לכם פרוטוקול להכנת תאי Drosophila S2 עבור מיקרוסקופיה של אור.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את הבקרה של השכפול המרכזי ב-Drosophila, באמצעות בדיקת שינויים במספר ובמבנה המרכזי בעקבות השמדה או ביטוי יתר של חלבוני בקרה חשובים. אז בואו נתחיל. אנו משתמשים בצלחות פטרי סטנדרטיות של 35 מילימטר כדי להכין את הצלחות בעלות התחתית הזכוכיתית שלנו.צלחות אלו בעלות תחתית זכוכית שומרות על התאים בתנאים הדומים מאוד לתנאי התרבית הרגילים

preparation-of-drosophila-s2-cells-for-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.

אברון תחבורה בתרבית דרוזופילה תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

ניתוח SEM הוא שיטה יעילה כדי לסייע לזן או פנוטיפי אפליה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבחינת המסוימות מורפולוגי של שלושה סוגי האורגניזמים נציג ויהיה בהרחבה החלים על בחינת תכונות של רבים organismal סוגי רקמות.

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

למדו הכנת תאי S2 של Drosophila למיקרוסקופ אור באמצעות ציפוי lectin לשיפור הידבקות התאים ושטחתם. שיטה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של מבני תאים ולוקליזציה של חלבונים באמצעות פלואורסצנציה.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

גלה סרטונים נוספים