Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים
26 ביוני 2010
פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בחלבונים הפלואורסצנטיים M orange two andron לצורך הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים, על מנת לסמן באופן סלקטיבי ארבע אוכלוסיות תאים נפרדות או מדורים תאיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הארת תאים באור עירור בעוצמה נמוכה של 488 nanometer כדי לכבות את כל הפלואורסצנציה של ה-green drawn per. כשלב שני, התאים נחשפים לאור עירור בעוצמה גבוהה של 488 nanometer, אשר מבצע המרה פוטונית של פלואורסצנציית ה-m orange לאדום.
לאחר מכן, התאים נחשפים לעירור דו-פוטוני באורך גל של 800 nanometer כדי להפעיל פלואורסצנציה כפולה. שוב, התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן לסמן תאים בארבעה שילובים שונים על בסיס הדגשה אופטית של גששים כפולים עם M Orange two ו-drawn ppa. היתרון העיקרי של הליך זה על פני ניסויים קיימים, כגון פרקציונציה סוב-צלולרית, הוא שביצועו מתבצע בתאים חיים.
נוהל זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי בטא, כגון הסיבה לכך שרק חלק קטן מהוסיקולות האינסולין מופרש. למרות שנוהל זה יכול לספק תובנה לגבי תפקוד תאי בטא, ניתן להחיל אותו גם על מערכות אחרות. לדוגמה, מעקב אחר תאי סרטן in vivo. דגימה של טיפות חלבון פלואורסצנטי מורכבת מאמולסיית מים אוקטלית עם חלבון פלואורסצנטי השוכן בפאזת המים.
אמולסיה זו מונחת כשכבה דקה בין זכוכית של מיקרוסקופ לבין כיסוי זכוכית ריבועי של 22 מילימטר ליישומים של מיקרוסקופיה. בתחילת הליך זה, יש לנקות את זכוכיתות המיקרוסקופ ואת כיסויי הזכוכית ולצפות אותם בחומר הידרופובי. נקו את כלי הזכוכית על ידי שטיפה באצטון למשך חמש דקות.
לאחר השטיפה, השאירו את כלי הזכוכית לייבוש באוויר. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 2% methyl trimethoxy silane באצטון וכסו את כלי הזכוכית בתמיסה למשך שתי דקות. לאחר הכיסוי, הוציאו את כלי הזכוכית מהתמיסה והניחו להם להתייבש.
לאחר מכן, שטפו את כלי הזכוכית ב-70% ethanol מבקבוק ספריי. לאחר השטיפה, הניחו לכלי הזכוכית להתייבש שוב באוויר והסירו כל שארית נוזל. באמצעות אוויר דחוס, ניתן לאחסן את כלי הזכוכית המצופים למשך חודש אחד לפחות.
לאחר הכנת כלי הזכוכית, השג חלבונים פלואורסצנטיים שטוהרו בעבר כחלבונים עם תג his מ-e coli. מדוד את ספקטרום הבליעה של החלבון המטוהר. הכן תמיסת מ वैसेstock בדילול עם צפיפות אופטית של כ-0.1 בתמיסת tris buffered saline עם pH 8 המכילה 0.1% bovine serum albumin.
בנוסף, הכינו 10 milliliters של תערובת ביחס של אחד לאחד של one octal ושל tris buffered saline solution בתוך מבחנה קונית של 15 milliliters וערבבו בעוצמה. לאחר הערבוב, השאירו את התערובת עד להשלמת הפרדת הפאזות. הפאזה העליונה היא ה-octal; כדי להכין את האמולסיה, פפטו 45 microliters של one octal וחמישה microliters של חלבון פלואורסצנטי לתוך מבחנת epi orph.
הקישו על המבחנה מספר פעמים כדי להתחיל ביצירת האמולסיה, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למבחנה למשך 30 שניות באמבט סוניקציה. במקביל, הכינו זכוכית כיסויה וסלייד מיקרוסקופ מצופה לאחר הסוניקציה. האמולסיה צריכה להיות עכורה לחלוטין.
העבירו מיד בעזרת פיפט ארבעה µL של האמולסיה ממרכז המבחנה אל על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ מצופה, וכסו אותה בכיסוי זכוכית מצופה. האמולסיה צריכה להיפרס באופן שווה בין זכוכית המיקרוסקופ לבין כיסוי הזכוכית. תוך דקות ספורות, הדגימה אמורה להיות יציבה.
ההליך הבא מהווה אסטרטגיה כללית להקמת ניסוי המרה פוטוכימית (photo conversion) של חלבון פלורסצנטי במיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי. ניתן להחיל הליך זה הן על חלבונים מנוקים והן על תאים חיים. בניסוי זה, דגימה של טיפה המכילה חלבון m orange two מנוקה משמשת כנקודת מוצא כללית לניסוי ההמרה הפוטוכימית.
הגדירו את מיקרוסקופ הסריקה הלייזרי הקונפוקאלי באופן הבא. השתמשו בעדשת שימור בשמן בעלת הגדלה של 40x ומספר מפתח (NA) של 1.3, ובגודל תמונה של 512 על 512 פיקסלים. הגדירו את זמן השהייה של הפיקסל ל-six microseconds לסריקה, את הזום ל-4, והגדילו את גודל הפינהול (pinhole) כך שיתאים לרזולוציית Z של 3 microns.
הגדירו שני ערוצי זיהוי עבור הפלואורסצנציה הראשונית והמומרת פוטו-כימית, וכן ערוץ המרה פוטו-כימית. צפו במינים הכתומים באמצעות אור עירור של 561 nanometer ואספו את הפלואורסצנציה בין 570 ל-630 nanometers. זהו את המינים האדומים שהומרו פוטו-כימית באמצעות אור עירור של 633 nanometer ואספו את הפלואורסצנציה בין 640 ל-700 nanometers.
עבור ערוץ ההמרה הפוטוכימית, בחר את קו הלייזר של 488 nanometer ואסוף את הפלואורסצנציה בין 490 ל-540 nanometers. Imaging. ערוץ ההמרה הפוטוכימית אינו הכרחי באופן מוחלט אך עשוי להועיל. כדי להתחיל בניסוי, השתמש בערוץ הגילוי כדי לדגם את הפלואורסצנציה הראשונית באמצעות סריקה רציפה, כדי להתאים את הספק הלייזר ואת הגבֶר של הגלאי להשגת איכות תמונה אופטימלית.
לאחר מכן, הפעילו את ערוץ ההמרה הפוטו-כימית ובחרו בעוצמת לייזר נמוכה. התחילו בצילום סדרת time-lapse והגבירו בהדרגה את לייזר ההמרה הפוטו-כימית עד שתיצפה הבהרה משמעותית של הפלואורסצנציה הראשונית. המשיכו בסריקה עד שהפלואורסצנציה הראשונית תהיה מובהרת בערך ב-75%.
בשלב הבא, בטלו את הפעלת ערוץ המרת הפוטונים והפעילו את ערוץ הגילוי עבור הפלורסצנציה שהומרה פוטונית. התחילו את הדמיה עם הגבר גלאי גבוה בהספק לייזר נמוך. לאחר מכן, הגבירו בהדרגה את הספק הלייזר עד לגילוי הפלורסצנציה שהומרה פוטונית.
לאחר הזיהוי, יש לכוון את הספק הלייזר ואת הזיהוי או ההגבר (gain) כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית. לבסוף, יש לבצע אופטימיזציה לספק הלייזר המשמש להמרה פוטונית (photo conversion) וכן למשך הזמן שלו. הגדלת הספק הלייזר תאיץ את קצב ההמרה הפוטונית.
עם זאת, עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום להבהרה פוטוכימית (photobleaching) של החלבון. ברגע שנקבעו ההמרה הפוטוכימית, עוצמת הלייזר ומשך הזמן האופטימליים, ניתן להשתמש בפרמטרים אלו כדי להגדיר מודול הבהרה פוטוכימית סטנדרטי או מודול התאוששות פלואורסצנציה לאחר הבהרה פוטוכימית (FRAP). לאחר מכן, ערוץ ההמרה הפוטוכימית לא יהיה נחוץ יותר בשל תכונות ההסחה לאדום (Redshift) של M orange two.
ניתן להשתמש בזה בשילוב עם החלבון הפלואורסצנטי הירוק הניתן למיתוג פוטואופטי ששורטט כ-PU לצורך הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים. כדי להתחיל בהדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים, גדלו תאי HeLa בצלחות MatTech בעלות תחתית זכוכית. בצעו טרנספקציה לתאים עם פלסמידים המקודדים לחלבונים הפלואורסצנטיים 24 שעות לפני הדימות, באמצעות טרנספקציית LIPECTOMY 2000 סטנדרטית.
הניחו את התאים החיים תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקלי והגדירו את המיקרוסקופ עבור המרת פוטונים של M orange two כפי שתוכנן קודם לכן. לאחר מכן, הגדירו את המיקרוסקופ עבור מיתוג פוטוני של DPA. DPA מעורר על ידי אור באורך גל של 488 nanometer וניתן לדמות את הפלואורסצנציה שלו באמצעות ערוץ ההמרת הפוטונים של M orange two.
יש לוודא כי עוצמת הלייזר המשמשת לדימוי של MPA היא מינימלית, שכן עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום להשבתה של mpa. הוסיפו ערוץ להפעלה פוטו-כימית של MPA באמצעות עירור דו-פוטוני באורך גל של 800 nanometer. לאחר מכן, קבעו את עוצמת הלייזר הנדרשת לדימוי של הפעלה פוטו-כימית והשבתה פוטו-כימית של פלורסצנציית OFA.
אחד ההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו הוא נטרול ה-RPA ללא המרת פוטו-כימית של M orange, מכיוון ששני האירועים מתרחשים באורך גל זהה. כדי למנוע זאת, חשוב מאוד לבצע אופטימיזציה קפדנית של ההמרה הפוטו-כימית.
הספק הלייזר ומשך הפעולה יש לנקוט זהירות כיוון שהמרה פוטוכימית של m orange 2 וביטול פעילות של PU מתרחשים שניהם בעת עירור באור של 488 nanometer, על מנת לבטל את פעילות ה-PU ללא המרה פוטוכימית משמעותית של m orange 2. השתמשו בהספק לייזר נמוך יותר לאחר שנקבעו הפרמטרים להמרה פוטוכימית של m orange 2 ולמעבר פוטוכימי (photo switching) של DPA.
ניתן להשיג הדגשה אופטית באמצעות גשש כפול. ראשית, בטלו את הפלואורסצנציה של DPA בכל שטח הראייה באמצעות עירור ב-488 nanometer בהספק נמוך. לאחר מכן, בחרו אזור עניין והמירו m orange two באמצעות עירור ב-488 nanometer בהספק גבוה.
לבסוף, בחרו אזור עניין והפעילו פלואורסצנציית DPA באמצעות עירור פוטונים כפולים באורך גל של 800 ננומטר. דגימות טיפות חלבון פלואורסצנטיות מתאימות באופן אידיאלי להקמה של יישומים להמרה פוטוכימית במיקרוסקופ קונפוקלי. כאשר דגימת הטיפות מוכנה כראוי, הטיפות נראות הומוגניות מאוד.
עם זאת, כאשר הדגימה מוכנה ללא ציפוי של תגית המיקרוסקופ בזכוכית כיסוי, הטיפות נוטות להימעך אל מול אחד ממשטחי הזכוכית בדגימות שהוכנו. בהיעדר 0.1%BSA, החלבון הפלואורסצנטי נוטה להצטבר בממשק מים אחד. יצירת הילה של המרת פוטו-פלואורסצנציה תלויה באופן קריטי בעוצמת הלייזר ובמשך החשיפה.
עוצמת לייזר גבוהה מדי או זמן חשיפה ממושך מדי יגרמו לפוטובליצ'ינג (photobleaching) ויובילו להפחתה של הפלורסצנציה האדומה שהומרה פוטו-כימית. התכונות הספקטרליות המובחנות של M orange two ו-PHO מאפשרות הדגשה אופטית של שני גששים לפני המרה פוטו-כימית; תאים המבטאים M orange two, histone H two B ו-DPA mito מראים פלורסצנציה כתומה בגרעין ופלורסצנציה ירוקה במיטוכונדריה. כאשר כל הפלורסצנציה כובית באמצעות עירור של 488 nanometer בעוצמה נמוכה, מתרחשת המרה פוטו-כימית מינימלית של M orange.
ניתן להמיר פוטו-כימית M orange two לאדום באמצעות עירור בעוצמה גבוהה באורך גל של 488 nanometer. לאחר ש-M orange two הומר פוטו-כימית, ניתן להפעיל מחדש את הפלואורסצנציית drawn puff באמצעות עירור פוטונים כפול באורך גל של 800 nanometer. באמצעות הדגשה אופטית של גשש כפול, ניתן לסמן תאים בארבע דרכים נפרדות.
באמצעות טכניקה זו, ניתן לסמן באופן ספציפי ארבע אוכלוסיות תאים שונות. כפי שראיתם, אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה הוא נטרול ה-MPA ללא המרה פוטו-כימית של m orange. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע ניסויים נוספים באמצעות מערכת זו, למשל, מעקב אחר אוכלוסיות מרובות בתאי בטא בלבלב.
זהו זה. אני מקווה שמצאתם את המצגת הזו מועילה, ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה להמרה פוטונית (photoconversion) של חלבונים פלורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקלי. הוא מפרט נהלים להמרה פוטונית של דגימות חלבון מטוהרות ולסימון אופטי באמצעות גששים כפולים בתאים חיים עם mOrange2 ו-Dronpa.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- דימיון חלבונים פלואורסצנטיים
- דימיון תאים חיים
- טכניקות הדגשה אופטית
רקע
- חלבונים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב לדימות תאי.
- פוטו-המרה (Photoconversion) מאפשרת מחקרים דינמיים של תהליכים תאיים.
- טכניקות של גשש כפול משפרות את הספציפיות בסימון.
- שיטה זו יתרונית למחקר תאים חיים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מטרת המחקר
- להדגמת הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים המשתמשים ב-mOrange2 וב-Dronpa.
- לסימון סלקטיבי של אוכלוסיות תאים או מדורים נבדלים.
- לשיפור שיטות קיימות של דימוי תאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הארת תאים באור בעוצמה נמוכה באורך גל של 488 nm כדי לכבות את הפלורסצנציה של Dronpa.
- שימוש באור בעוצמה גבוהה באורך גל של 488 nm כדי לבצע המרה פוטוכימית של פלורסצנציית mOrange לאדום.
- החלת עירור דו-פוטוני באורך גל של 800 nm כדי להפעיל את הפלורסצנציה של Dronpa.
- סימון תאים בארבעה שילובים נפרדים בהתבסס על ההדגשה האופטית.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאים בארבעה שילובים נבדלים.
- הוכחת ההיתכנות של הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים בתאים חיים.
- הצגת יתרונות על פני שיטות מסורתיות של הפרדת תתי-מבנים תאיים (subcellular fractionation).
- אספקת תובנות לגבי הדינמיקה של תהליכים תאיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סימון יעיל של תאים חיים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים כפולים.
- הוא מציע התקדמות משמעותית בטכניקות דימות עבור חוקרים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים שונים בביולוגיה תאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים מאפשרת סימון מרחבי-זמני מדויק של מדורים תאיים בתאים חיים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בדינמיקה של חלבונים ובתעבורה סוב-תאית. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת קריאות כמותיות בזמן אמת של התנהגות חלבונים בתנאים פיזיולוגיים, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על ארטיפקטים של תאים מקובעים. השיטה ישימה למסלולי עבודה של סריקה שבהם לוקאליזציה סוב-תאית מעניקה מידע על מעורבות המטרה ועל מודולציה של מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי מעקב אחר המרת חלבונים ודינמיקה ספציפית למדורים בתאים חיים.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הפיכה ולא פולשנית לתיקוף מיקום ותפקוד של מטרה ללא קיבוע או ליזיס של התאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות המתואמות עם יעילות פוטו-המרה של חלבונים ורגישות סביבתית.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בקרת הספק לייזר ופרמטרי חשיפה, ובכך משפר את השחזוריות לאורך מסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר מעקב אחר דינמיקה של חלבונים במערכות הרלוונטיות למחלות, כגון הפרשת ואסיקולות אינסולין בתאי בטא או נדידת תאי סרטן.
- ערך תפעולי: מאפשר מחקרים אורך בתאים חיים, ובכך תומך ברצף תרגומי משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת יכולות דימות של תאים חיים, המנחות את תיקוף המטרה ואת זיהוי המולקולות המובילות באמצעות דינמיקה של חלבונים ברזולוציה מרחבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות ויזואליזציה ישירה של שינויים במיקום החלבון בתגובה להפרעות ניסיוניות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות על ידי יצירת פלטים אופטיים סטנדרטיים וכמותיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות פלואורסצנציה רציומטריות (יחסי המרה מירוק לאדום) המאפשרות השוואה של מצבי חלבון בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרים פרה-קליניים על ידי כך שמאפשר מעקב אחר דינמיקה של חלבונים בתאים ראשוניים או במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוג רב-פעמית למספר מטרות וסוגי תאים, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במצבי לוקליזציה ואקטיבציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של פוטו-המרה (photoconversion) וכיול מבוסס טיפות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות של המטרה במערכות חיות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי תיקוף התנהגות המטרה בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולים ביישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובפוטופיזיקה של חלבונים פלואורסצנטיים.
- נדרש מיקרוסקופ סריקה בלייזר עם יכולות עירור דו-פוטוני של 488 nm ו-800 nm.
- נדרש סטנדרטיזציה של הספק הלייזר, זמן החשיפה וערוצי הזיהוי בין משתמשים ואתרים שונים.
- נדרש אופטימיזציה עבור כל זוג חלבונים פלואורסצנטיים כדי למנוע הפעלה צולבת (cross-activation) או דה-פלואורסצנציה (photobleaching).
- מוגבל על ידי היציבות הפוטו-כימית של החלבונים הפלואורסצנטיים ועל ידי ציטוטוקסיות פוטנציאלית כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור.
