Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים
26 ביוני 2010
פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בחלבונים הפלואורסצנטיים M orange two andron עבור הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים, כדי לסמן באופן סלקטיבי ארבעה אוכלוסיות תאים נפרדות או מדורים תאיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הארת התאים באור עירור בעוצמה נמוכה של 488 nanometer כדי לכבות את כל הפלואורסצנציה הירוקה. כשלב שני, התאים נחשפים לאור עירור בעוצמה גבוהה של 488 nanometer, אשר מבצע המרה פוטונית של הפלואורסצנציית ה-m orange לאדום.
בשלב הבא, התאים נחשפים לעירור דו-פוטוני של 800 nanometer כדי להפעיל פלואורסצנציה כפולה. שוב, התוצאות המתקבלות מראות כי ניתן לסמן תאים בארבעה שילובים נפרדים המבוססים על הדגשה אופטית של גששים כפולים עם M Orange two ו-drawn ppa. היתרון המרכזי של הליך זה על פני ניסויים קיימים, כגון פרקציונציה סוב-צלולרית, הוא שביצועו נעשה בתאים חיים.
נוהל זה יכול לסייע במענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי בטא, כגון הסיבה לכך שרק חלק קטן מהוסיקולות האינסולין מופרש. למרות שנוהל זה יכול לספק תובנות לגבי תפקוד תאי בטא, ניתן ליישמו גם על מערכות אחרות. לדוגמה, מעקב אחר תאי סרטן in vivo. דגימה של טיפות חלבון פלואורסצנטי מורכבת מאמול מים אוקטלי שבו חלבון פלואורסצנטי נמצא בשלב המים.
אמולסיה זו מונחת כשכבה שבין זכוכית מיקרוסקופ לבין כיסית זכוכית ריבועית בגודל 22 מילימטר ליישומים של מיקרוסקופיה. בתחילת הליך זה, יש לנקות את זכוכית המיקרוסקופ ואת כיסיות הזכוכית ולצפות אותן בחומר הידרופובי. נקו את כלי הזכוכית על ידי שטיפה בממתק אצטון במשך חמש דקות.
לאחר השטיפה, השאירו את כלי הזכוכית לייבוש באוויר. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 2% methyl trimethoxy silane באצטון וטבלו את כלי הזכוכית בתמיסה למשך שתי דקות. לאחר הציפוי, הוציאו את כלי הזכוכית מהתמיסה והניחו להם להתייבש.
לאחר מכן, שטפו את כלי הזכוכית ב-70% ethanol מבקבוק נסpray. לאחר השטיפה, הניחו לכלי הזכוכית להתייבש שוב באוויר והסירו כל שארית נוזל. באמצעות אוויר דחוס, ניתן לאחסן את כלי הזכוכית המצופים למשך חודש אחד לפחות.
לאחר הכנת כלי הזכוכית, השג חלבונים פלואורסצנטיים שטוהררו בעבר כחלבונים בעלי תג his מ-e coli. מדוד את ספקטרום הבליעה של החלבון המטוהר. הכן תמיסת סטוק בדילול בעלת צפיפות אופטית של בערך 0.1 בתמיסת tris buffered saline ב-pH שמונה המכילה 0.1% bovine serum albumin.
בנוסף, הכין 10 מיליליטר של תערובת ביחס של אחד לאחד של אוקטנול ותמיסת tris buffered saline בתוך פרועת קונית של 15 מיליליטר וערבב בעוצמה. לאחר הערבוב, השאר את התערובת עד להשלמת הפרדת הפאזות. הפאזה העליונה היא האוקטנול; כדי להכין את האמולסיה, העבר בעזרת פיפט 45 מיקרוליטר של אוקטנול ו-5 מיקרוליטר של חלבון פלואורסצנטי אל תוך פרועת epi orph.
הקישו על המבחנה מספר פעמים כדי להתחיל ביצירת האמולסיה, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למבחנה למשך 30 שניות באמבט סוניקציה. בינתיים, הכינו זכוכית כיסויה וסלייד מיקרוסקופ מצופה לאחר הסוניקציה. האמולסיה צריכה להיות עכורה לחלוטין.
שאי מיד ארבעה µL מהאמולסיה מחלקו המרכזי של המבחנה אל תוך זכוכית כיסוי מצופה, וכסה אותה עם זכוכית כיסוי מצופה. האמולסיה צריכה להתפשט באופן אחיד בין זכוכית הכיסוי לבין זכוכית המיקרוסקופ. תוך מספר דקות, הדגימה צריכה להיות יציבה.
הפרוצדורה הבאה מהווה אסטרטגיה כללית להקמת ניסוי המרה פוטוכימית של חלבון פלואורסצנטי במיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי. ניתן להחיל פרוצדורה זו הן על חלבונים מופרדים והן על תאים חיים. בניסוי זה, דגימה של טיפה המכילה חלבון m orange two מופרד משמשת כנקודת התחלה כללית לניסוי ההמרה הפוטוכימית.
הגדירו את מיקרוסקופ הסריקה הלייזרית הקונפוקלית באופן הבא. השתמשו בעדשה שמאית עם טבילה בשמן בעלת הגדלה של 40 x ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.3, ובגודל תמונה של 512 על 512 פיקסלים. הגדירו את זמן השהייה של הפיקסל לשש מיקרו-שניות לסריקה, את הזום ל-4 והגדילו את גודל הפינהול (pinhole) כדי להתאים לרזולוציית Z של שלוש מיקרונים.
הגדירו שני ערוצי זיהוי עבור הפלורסצנציה הראשונית והמומרת פוטו-כימית, וכן ערוץ להמרה פוטו-כימית. צפו במינים הכתומים באמצעות אור עירור של 561 ננומטר ואספו את הפלורסצנציה בין 570 ל-630 ננומטר. זהה את המינים האדומים שהומרו פוטו-כימית באמצעות אור עירור של 633 ננומטר ואסוף את הפלורסצנציה בין 640 ל-700 ננומטר.
עבור ערוץ המרת הפוטונים, בחר בקו הלייזר של 488 ננומטר ואסוף את הפלואורסצנציה בין 490 ל-540 ננומטר. עבור ערוץ המרת הפוטונים אין צורך מחייב, אך הוא עשוי לסייע. כדי להתחיל בניסוי, השתמש בערוץ הגילוי כדי לדגם את הפלואורסצנציה הראשונית באמצעות סריקה רציפה, במטרה להתאים את עוצמת הלייזר ואת הגבר הגילוי (detector gain) לאיכות תמונה אופטימלית.
לאחר מכן, הפעילו את ערוץ ההמרה הפוטו-כימית (photo conversion) ובחרו בעוצמת לייזר נמוכה. התחילו בצילום סדרת time-lapse והגבירו בהדרגה את לייזר ההמרה הפוטו-כימית עד שתיצפה דהייה (bleaching) משמעותית של הפלואורסצנציה הראשונית. המשיכו בסריקה עד שהפלואורסצנציה הראשונית תדע דהייה של כ-75%.
לאחר מכן, בטלו את פעולתו של ערוץ המרת הפוטו והפעילו את ערוץ הגילוי עבור הפלורסצנציה שהומרה פוטו-כימית. התחילו את הדמיה עם הגבר גילוי גבוה בהספק לייזר נמוך. לאחר מכן, הגבירו בהדרגה את הספק הלייזר עד לגילוי הפלורסצנציה שהומרה פוטו-כימית.
לאחר הזיהוי, כווננו את הספק הלייזר ואת הגבירה (gain) או הזיהוי לקבלת איכות תמונה אופטימלית. לבסוף, בצעו אופטימיזציה לספק הלייזר המשמש להמרה פוטוכימית וכן למשך הזמן שלו. הגדלת ספק הלייזר תאיץ את קצב ההמרה הפוטוכימית.
עם זאת, הספק לייזר גבוה מדי יגרום להבהרה פוטוכימית (photobleaching) של החלבון. ברגע שנקבעו ההמרה הפוטוכימית האופטימלית, הספק הלייזר ומשך הזמן, ניתן להשתמש בפרמטרים אלו להגדרת מודול הבהרה פוטוכימית סטנדרטי או מודול התאוששות פלואורסצנציה לאחר הבהרה פוטוכימית (FRAP). לאחר מכן, ערוץ ההמרה הפוטוכימית לא יהיה נחוץ יותר בשל תכונות הסדירה הספקטרליות של mOrange2.
ניתן להשתמש בו בשילוב עם החלבון הפלואורסצנטי בעל המתג הפוטו-ירוק ששורטט כ-PU לצורך הדגשה אופטית באמצעות גשושית כפולה. כדי להתחיל בהדגשה אופטית באמצעות גשושית כפולה, גדלו תאי hela בצלחות עם תחתית זכוכית מסוג mat tech; העבירו לתאים פלסמידים המקודדים לחלבונים הפלואורסצנטיים 24 שעות לפני הדמיון באמצעות טרנספקציה סטנדרטית של LIPECTOMY 2000.
הניחו את התאים החיים תחת מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי והגדירו את המיקרוסקופ עבור המרה פוטו-כימית של M orange two כפי שתוואר קודם לכן. לאחר מכן, הגדירו את המיקרוסקופ עבור מיתוג פוטו-כימי של DPA. DPA מעורר באמצעות אור של 488 nanometer וניתן לדמות את הפלואורסצנציה שלו באמצעות ערוץ ההמרה הפוטו-כימית של M orange two.
יש לוודא שהספק הלייזר המשמש לדימות של MPA יהיה מינימלי, שכן הספק לייזר גבוה מדי יגרום להשבתה של mpa. הוסיפו ערוץ להפעלה פוטוכימית של MPA באמצעות עירור דו-פוטוני של 800 nanometer. לאחר מכן, קבעו את הספק הלייזר הנדרש לדימות, להפעלה פוטוכימית ולהשבתה פוטוכימית של פלואורסצנציית OFA.
אחד ההיבטים הקשים ביותר בפרוצדורה זו הוא נטרול ה-RPA ללא המרה פוטוכימית של M orange, מכיוון ששני האירועים מתרחשים באותו אורך גל. כדי למנוע זאת, חשוב מאוד לבצע אופטימיזציה מדויקת של ההמרה הפוטוכימית.
הספק ומשך הלייזר יש לנקוט במשנה זהירות, שכן המרה פוטוכימית של M orange two וביטול פעילות של PU מתרחשים שניהם בעת עירור באמצעות אור של 488 nanometer; כדי לבטל את פעילות ה-PU ללא המרה פוטוכימית משמעותית של M orange two, יש להשתמש בהספק לייזר נמוך יותר לאחר שנקבעו הפרמטרים עבור ההמרה הפוטוכימית של M orange two והמעבר הפוטוכימי של DPA.
ניתן להשיג הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים. ראשית, בטלו את הפלואורסצנציה של DPA בכל שדה הראייה באמצעות עירור בעוצמה נמוכה של 488 nanometer. לאחר מכן, בחרו אזור עניין והמירו m orange two באמצעות עירור בעוצמה גבוהה של 488 nanometer.
לבסוף, בחרו אזור עניין והפעילו פלואורסצנציית DPA באמצעות עירור דו-פוטוני ב-800 nanometer. דגימות של טיפות חלבון פלואורסצנטי מתאימות באופן אידיאלי להקמת יישומים של המרת תמונות (photo conversion) במיקרוסקופ קונפוקאלי. כאשר דגימת הטיפות מוכנה כראוי, הטיפות נראות הומוגניות מאוד.
עם זאת, כאשר הדגימה מוכנה ללא ציפוי של זכוכית הכיסוי על עליית המיקרוסקופ, הטיפות נוטות להימעך כנגד אחד ממשטחי הזכוכית בדגימות שהוכנו. בהיעבדת 0.1%BSA, החלבון הפלואורסצנטי נוטה להצטבר בממשק המים היחיד. יצירת הילה של המרה פוטו-פלואורסצנטית תלויה באופן קריטי בעוצמת הלייזר ובמשך החשיפה.
עוצמת לייזר גבוהה מדי או זמן חשיפה ארוך מדי יגרמו לפוטובליצ'ינג (Photobleaching) ויובילו להפחתה של הפלואורסצנציה האדומה שהומרה פוטו-כימית. התכונות הספקטרליות המובחנות של M orange two ו-PHO מאפשרות הדגשה אופטית של שני גששים לפני המרה פוטו-כימית; תאים המבטאים את M orange two, היסטון H two B ו-DPA mito מראים פלואורסצנציה כתומה בגרעין ופלואורסצנציה ירוקה במיטוכונדריה. כאשר כל הפלואורסצנציה כובה באמצעות עירור ב-488 nanometer בעוצמה נמוכה, מתרחשת המרה פוטו-כימית מינימלית של M orange.
ניתן לבצע המרה פוטונית של M orange two לאדום באמצעות עירור בעוצמה גבוהה באורך גל של 488 nanometer. לאחר שה-M orange two עבר המרה פוטונית, ניתן להדליק שוב את הפלואורסצנציה של drawn puff באמצעות עירור פוטון כפול באורך גל של 800 nanometer. באמצעות הדגשה אופטית של גששים כפולים, ניתן לסמן תאים בארבע דרכים נבדלות.
באמצעות טכניקה זו, ניתן לסמן באופן ספציפי ארבעה אוכלוסיות תאים שונות. כפי שראיתם, אחד ההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו הוא השבתת ה-MPA ללא המרה פוטוכימית של m orange. לאחר שליטה בשיטה, ניתן לבצע ניסויים נוספים באמצעות מערכת זו, למשל, מעקב אחר אוכלוסיות מרובות בתאי בטא בלבלב.
זה הכל. אני מקווה שמצאתם מצגת זו מועילה, ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה להמרה פוטונית (photoconversion) של חלבונים פלורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקלי. הוא מפרט נהלים להמרה פוטונית של דגימות חלבון מטוהרות ולסימון אופטי באמצעות גששים כפולים בתאים חיים עם mOrange2 ו-Dronpa.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- דימיון חלבונים פלואורסצנטיים
- דימיון תאים חיים
- טכניקות הדגשה אופטית
רקע
- חלבונים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב לדימות תאי.
- פוטו-המרה (Photoconversion) מאפשרת מחקרים דינמיים של תהליכים תאיים.
- טכניקות של גשש כפול משפרות את הספציפיות בסימון.
- שיטה זו יתרונית למחקר תאים חיים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מטרת המחקר
- להדגמת הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים המשתמשים ב-mOrange2 וב-Dronpa.
- לסימון סלקטיבי של אוכלוסיות תאים או מדורים נבדלים.
- לשיפור שיטות קיימות של דימוי תאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הארת תאים באור בעוצמה נמוכה באורך גל של 488 nm כדי לכבות את הפלורסצנציה של Dronpa.
- שימוש באור בעוצמה גבוהה באורך גל של 488 nm כדי לבצע המרה פוטוכימית של פלורסצנציית mOrange לאדום.
- החלת עירור דו-פוטוני באורך גל של 800 nm כדי להפעיל את הפלורסצנציה של Dronpa.
- סימון תאים בארבעה שילובים נפרדים בהתבסס על ההדגשה האופטית.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאים בארבעה שילובים נבדלים.
- הוכחת ההיתכנות של הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים בתאים חיים.
- הצגת יתרונות על פני שיטות מסורתיות של הפרדת תתי-מבנים תאיים (subcellular fractionation).
- אספקת תובנות לגבי הדינמיקה של תהליכים תאיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סימון יעיל של תאים חיים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים כפולים.
- הוא מציע התקדמות משמעותית בטכניקות דימות עבור חוקרים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים שונים בביולוגיה תאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים מאפשרת סימון מרחבי-זמני מדויק של מדורים תאיים בתאים חיים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בדינמיקה של חלבונים ובתעבורה סוב-תאית. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת קריאות כמותיות בזמן אמת של התנהגות חלבונים בתנאים פיזיולוגיים, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על ארטיפקטים של תאים מקובעים. השיטה ישימה למסלולי עבודה של סריקה שבהם לוקאליזציה סוב-תאית מעניקה מידע על מעורבות המטרה ועל מודולציה של מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי מעקב אחר המרת חלבונים ודינמיקה ספציפית למדורים בתאים חיים.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הפיכה ולא פולשנית לתיקוף מיקום ותפקוד של מטרה ללא קיבוע או ליזיס של התאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות המתואמות עם יעילות פוטו-המרה של חלבונים ורגישות סביבתית.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בקרת הספק לייזר ופרמטרי חשיפה, ובכך משפר את השחזוריות לאורך מסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר מעקב אחר דינמיקה של חלבונים במערכות הרלוונטיות למחלות, כגון הפרשת ואסיקולות אינסולין בתאי בטא או נדידת תאי סרטן.
- ערך תפעולי: מאפשר מחקרים אורך בתאים חיים, ובכך תומך ברצף תרגומי משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת יכולות דימות של תאים חיים, המנחות את תיקוף המטרה ואת זיהוי המולקולות המובילות באמצעות דינמיקה של חלבונים ברזולוציה מרחבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות ויזואליזציה ישירה של שינויים במיקום החלבון בתגובה להפרעות ניסיוניות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות על ידי יצירת פלטים אופטיים סטנדרטיים וכמותיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות פלואורסצנציה רציומטריות (יחסי המרה מירוק לאדום) המאפשרות השוואה של מצבי חלבון בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרים פרה-קליניים על ידי כך שמאפשר מעקב אחר דינמיקה של חלבונים בתאים ראשוניים או במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוג רב-פעמית למספר מטרות וסוגי תאים, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במצבי לוקליזציה ואקטיבציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של פוטו-המרה (photoconversion) וכיול מבוסס טיפות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות של המטרה במערכות חיות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי תיקוף התנהגות המטרה בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולים ביישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובפוטופיזיקה של חלבונים פלואורסצנטיים.
- נדרש מיקרוסקופ סריקה בלייזר עם יכולות עירור דו-פוטוני של 488 nm ו-800 nm.
- נדרש סטנדרטיזציה של הספק הלייזר, זמן החשיפה וערוצי הזיהוי בין משתמשים ואתרים שונים.
- נדרש אופטימיזציה עבור כל זוג חלבונים פלואורסצנטיים כדי למנוע הפעלה צולבת (cross-activation) או דה-פלואורסצנציה (photobleaching).
- מוגבל על ידי היציבות הפוטו-כימית של החלבונים הפלואורסצנטיים ועל ידי ציטוטוקסיות פוטנציאלית כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור.
