Name: Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: למד המרת פוטו של חלבונים פלורסנטיים וסימון אופטי כפול בתאים חיים באמצעות mOrange2 ו-Dronpa. שיטה זו מאפשרת תיוג של ארבע אוכלוסיות תאים שונות לחקר תהליכים תאיים דינמיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מייק W. דוידסון (פלורידה סטייט) למתן DNA פלסמיד קידוד חלבוני ניאון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM72048 (עד בעירייה).

1. הכנת דוגמאות אגל חלבון פלואורסצנטי מדגם ניאון אגל חלבון מורכב תחליב 1-octanol/water עם חלבון פלואורסצנטי המתגוררים שלב המים. אמולסיה זו היא דחוקה בין שקופיות מיקרוסקופ ו 22 מ"מ מרובע זכוכית לכסות עבור יישומים במיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע דגימות חלבון פלואורסצנטי טיפה את השקופיות מיקרוסקופ ומשקפיים לכסות צריכים לנקות ומצופה סוכן הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי זכוכית על ידי שטיפה 5 דקות עם אצטון ולהשאיר לייבוש באוויר. (לחלופין, לאחר ניקוי כלי זכוכית יכולים להיות מטופלים במשך 30 שניות שואב פלזמה כדי להשיג תוצאות אופטימליות ציפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון methyltrimethoxysilane 2% אצטון המעיל זכוכית במהלך הדגירה דקות 2 בפתרון זה. לאחר להסיר את ציפוי זכוכית מפתרון ולהשאיר לייבוש באוויר. לאחר מכן לשטוף עם אתנול 70% מבקבוק תרסיס ולהשאיר לייבוש שוב. (לחלופין, בשלב זה, כלי זכוכית ניתן לאפות במשך שעה 1 ב 80 ° C עד קוולנטית הקישור ציפוי זכוכית). כלי זכוכית מצופים יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים פלורסנט הם מטוהרים כמו חלבון 6-tagged שלו מ E. קולי 1. מדוד את ספקטרום הספיגה של החלבון מטוהרים להכין דילול המניה עם צפיפות אופטית של 0.1 ~ ב STE חיץ (150 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl pH 8, 1 mM EDTA), המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA) . בנוסף להכין 10 מ"ל של תערובת 01:01 של חיץ 1-octanol ו STE בצינור חרוטי 15 מ"ל וערבבו במרץ. לאחר לעזוב ערבוב עד הפרדת פאזות תושלם. השלב העליון הוא 1-octanol. (זהירות: מכיוון 1-octanol יש ריח חזק חשוב להשתמש מיכל פסולת סגור על כל מה בא במגע עם 1-octanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פיפטה אמולסיה 45 μl 1-octanol ו 5 חלבון פלואורסצנטי μl בצינור microfuge. לחץ על צינור כמה פעמים עם האצבע להתחיל היווצרות של אמולסיה, ואז sonicate הצינור למשך 30 שניות באמבטיה sonication. ב בינתיים לקבל שקופיות מיקרוסקופ מצופה זכוכית לכסות מוכן. לאחר sonication אמולסיה צריך להיות מעונן לחלוטין. מיד לאחר אמולסיה sonication 4 פיפטה μl מאמצע הצינור לשקופית מיקרוסקופ מצופה ומכסים כיסוי זכוכית מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההליך נעשה בצורה נכונה אמולסיה צריך להתפשט באופן שווה בין שקופיות מיקרוסקופ ואת זכוכית האובייקט. בתוך דקות המדגם צריך להיות יציב, המורכב ~ 10 מיקרומטר טיפות פלורסנט עבה עם קוטר משתנה. הטיפות הגדולות קרובים במרכז המדגם קטן ממוקמים נוסף לעבר הקצוות. </li></ol> 2. הגדרת הניסוי photoconversion ההליך הבא היא אסטרטגיה כללית להגדרת ניסוי photoconversion חלבון פלואורסצנטי. הליך זה יכול להיות מיושם על חלבונים טהורים, כמו גם עבור תאים חיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרמטרים הבאים לספק נקודת התחלה בכלל להגדיר ניסוי photoconversion שלך: טבילה 40X 1.3NA שמן אובייקטיבי גודל תמונה = 512 x 512 פיקסלים סריקה זום = 4 Pixel להתעכב זמן = 6 μsec. Z-ברזולוציה (גודל חריר) = 3 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שני ערוצי גילוי הקרינה הראשוני photoconverted, כמו גם "ערוץ photoconversion". בדוגמה זו נשתמש מטוהרים mOrange2 חלבון, שהוא חלבון כתום אל אדום ניאון photoconvertible. מינים תפוז מזוהה באמצעות עירור 561 ננומטר לבין הקרינה נאסף בין 570 nm ו 630 nm. מינים אדומים photoconverted מזוהה באמצעות עירור 633 ננומטר לבין הקרינה נאסף בין 640 ננומטר ו -700 ננומטר. עבור "ערוץ photoconversion" עירור לבחור 488 ננומטר ולאסוף הקרינה בין 490 nm ו 540 nm. (הערה:. לערוץ הדמיה photoconversion הוא לא הכרחי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הערוץ עבור דימות פלואורסצנטי ראשוני עם סריקה רציפה כדי להתאים את כוח לייזר ולהשיג גלאי עבור איכות תמונה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ערוץ photoconversion ובחר כוח לייזר נמוך. התחל הדמיה סדרה זמן לשגות ובהדרגה להגביר את הלייזר photoconversion משמעותי עד להלבנה של הקרינה הראשונית הוא ציין. המשך סריקה עד פלואורסצנציה הראשוני הוא כ -75% מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל את הערוץ photoconversion ולהפעיל את ערוץ גילוי הקרינה photoconverted. התחל הדמיה עם רווח גלאי גבוהה כוח לייזר נמוך ובהדרגה להגביר את כוח לייזר עד פלואורסצנציה photoconverted מזוהה. ברגע שאתה מזהה את הקרינה photoconverted תוכל להתאים כוח לייזר ולהשיג גלאי עבור איכות תמונה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, כוח לייזר המשמשיםעבור photoconversion וכן את משך הזמן של photoconversion צריך להיות מותאם. הגדלת כוח לייזר photoconversion יאיץ את קצב photoconversion, כוח לייזר עם זאת יותר מדי יהיה photobleach את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר photoconversion אופטימלי לייזר כוח משך נקבעו, פרמטרים אלה ניתן להשתמש כדי להגדיר photobleaching סטנדרטי או מודול FRAP את "ערוץ photoconversion" הוא כבר לא נדרש. </li></ol> 3. Dual-בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa בגלל אדום העביר תכונות ספקטרליות, mOrange2 ניתן להשתמש בשילוב עם Dronpa חלבון הפלואורסצנט הירוק photoswitchable עבור dual-הדגשת בדיקה אופטי לאפשר הדגשת סלקטיבי של תאים בודדים 4 (אברון) אוכלוסיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלים בתחתית צלחות זכוכית MatTek ו transfected 24 שעות לפני הדמיה באמצעות transfection תקן Lipofectamine2000 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ עבור photoconversion mOrange2 כמתואר בסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מיקרוסקופ עבור photoswitching Dronpa. Dronpa הקרינה ניתן הדמיה באמצעות "ערוץ photoconversion" mOrange2 (ראה שלב 2.2). (הערה: מזער את כוח לייזר המשמש הדמיה Dronpa, כי כוח לייזר רב מדי יגרום איון של Dronpa.) הוסף ערוץ photoactivation Dronpa. אנו משתמשים ב 800 ננומטר שני הפוטונים עירור עבור photoactivation, אבל לחילופין זו יכולה להיות מושגת באמצעות עירור 405 ננומטר. קבע את כוח לייזר נדרש הדמיה, photoactivation ו photoinactivation של Dronpa פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: photoconversion של mOrange2 ו איון של Dronpa הן מתרחשות על עירור 488 ננומטר. בגלל הכוח הלייזר גבוהה נדרש photoconversion mOrange2 זה יהיה גם להשבית Dronpa פלואורסצנטי. מצד שני, איון Dronpa מתרחשת כבר כוח לייזר נמוך בהרבה וניתן לבצעו ללא photoconversion mOrange2 משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים photoconversion mOrange2 ו photoswitching Dronpa מוגדרים, הדגשת בדיקה אופטי כפול מושגת באמצעות הצעדים הבאים. ראשית, להשבית Dronpa הקרינה בתחום שלם של נוף עם כוח נמוך עירור 488 ננומטר. שנית, לבחור אזור עניין mOrange2 photoconvert עם כוח גבוה עירור 488 ננומטר. לבסוף, בחר אזור של אינטרס להפעיל Dronpa פלואורסצנטי. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Droplet הכנת המדגם. מדגם) אגל מוכן כראוי. ב) Sample מוכן ללא ציפוי השקופית מיקרוסקופ זכוכית המכסה. ג) מדגם מוכן ללא הוספת BSA 0.1%. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. השפעת כוח photoconversion לייזר משך על photoconversion mOrange2. טיפות יחיד המכיל חלבון mOrange2 היו photoconverted ברציפות באמצעות כמויות שונות של כוח לייזר 488 ננומטר. כוח לייזר יחסית המשמש photoconversion היה 10% (מוצק), 25% (מקווקו), ו -100% (מנוקד). א) כתום מינים ניאון. ב) מינים Photoconverted ניאון אדום. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Dual-בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa. Cell) להביע mOrange2-היסטון H2B ו-Dronpa מיטו לפני photoconversion, מראה הקרינה כתום בגרעין ו פלואורסצנטי ירוק במיטוכונדריה. ב) Dronpa הקרינה היה כבוי עם עירור נמוך 488 כוח ננומטר, גרימת photoconversion מינימלי של mOrange2. ג) היה mOrange2 photoconverted לאדום עם עירור גבוה 488 כוח ננומטר. ד) Dronpa הקרינה דלקה שוב באמצעות 800 ננומטר 2-פוטון עירור. הלוחות הם שכבות של תמונות פלואורסצנציה יחד עם התמונה התערבות ההפרש לעומת זאת.

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המדגם מטוהרים פלורסנט אגל חלבון הוא פורמט דגימה מאוד נוח אפיון photophysical של חלבוני ניאון, למשל ללמוד photobleaching קינטיקה קינטיקה photoconversion. נפח טיפה קטנה מאוד (~ 20 picoliter) מקלה photobleaching וניסויים photoconversion, אשר יכול להיות קשה לבצע במערכות קובט מבוסס. בנוסף, כפי שמוצג כאן המדגם אגל הוא אידיאלי עבור הגדרת מיקרוסקופ confocal עבור יישומים photoconversion. ציפוי הידרופובי ואת הנוכחות של BSA חשובים להשגת טיפות הומוגנית. ללא ציפוי הטיפות נוטים להיות מעוכה כנגד...

<table><tbody><tr><td>זכוכיות מיקרוסקופ</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 22 מ"מ</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-אוקטנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>מתילטרימתוקסיסילאן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות MatTek</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

חלבוני ניאון Photoconvertible (pc-FPS) הם קבוצה של חלבוני ניאון עם יכולת &quot;סימון אופטי&quot;, כלומר, את צבע פלואורסצנטי ניתן לשנות על ידי חשיפה לאור באורך גל מסוים. הדגשת אופטית לא פולשנית מאפשרת סימון של subpopulation של מולקולות ניאון, ולכן הוא אידיאלי עבור מעקב אחר תאים בודדים או אברונים. פרמטרים קריטיים עבור photoconversion יעיל הן בעוצמה את זמן החשיפה של האור photoconversion. אם העוצמה נמוכה מדי, photoconversion יהיה איטי או לא להופיע בכלל. מצד שני, בעוצמה רבה מדי או חשיפה ארוכה מדי יכולה photobleach החלבון ובכך להפחית את היעילות של photoconversion. פרוטוקול זה מתאר גישה כללית כיצד להגדיר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה עבור PC-FP יישומים photoconversion. ראשית, אנו מתארים תהליך להכנת מטוהרים אגל דגימות חלבון. מתכונת זו מדגם מאוד נוח לחקר התנהגות photophysical של חלבוני ניאון מתחת למיקרוסקופ. שנית, אנו נשתמש מדגם טיפה חלבון כדי להראות כיצד להגדיר את המיקרוסקופ עבור photoconversion. ולבסוף, אנו נראה כיצד לבצע סימון אופטי בתאים חיים, כולל כפול בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa.

פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

חלבונים פלורסצנטיים ניתנים להמרה פוטונית (pc-FPs) הם סוג של חלבונים פלורסצנטיים בעלי יכולת "הדגשה אופטית", כלומר שהצבע של...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בחלבונים הפלואורסצנטיים M orange two andron עבור הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים, כדי לסמן באופן סלקטיבי ארבעה אוכלוסיות תאים נפרדות או מדורים תאיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הארת התאים באור עירור בעוצמה נמוכה של 488 nanometer כדי לכבות את כל הפלואורסצנציה הירוקה. כשלב שני, התאים נחשפים לאור עירור בעוצמה גבוהה של 488 nanometer, אשר מבצע המרה פוטונית של הפלואורסצנציית ה-m orange לאדום.בשלב הבא, התאים נחשפים לעירור דו-פוטוני של 800 nanometer כדי להפעיל פלואורסצנציה כפולה. שוב, התוצאות המתקבלות מראות כי ניתן לסמן תאים בארבעה שילובים נפרדים המבוססים על הדגשה אופטית של גששים כפולים עם M Orange two ו-drawn ppa. היתרון המרכזי של הליך זה על פני ניסויים קיימים, כגון פרקציונציה סוב-צלולרית, הוא שביצועו נעשה בתאים חיים.נוהל זה יכול לסייע במענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי בטא, כגון הסיבה לכך שרק חלק קטן מהוסיקולות האינסולין מופרש. למרות שנוהל זה יכול לספק תובנות לגבי תפקוד תאי בטא, ניתן ליישמו גם על מערכות אחרות. לדוגמה, מעקב אחר תאי סרטן in vivo. דגימה של טיפות חלבון פלואורסצנטי מורכבת מאמול מים אוקטלי שבו חלבון פלואורסצנטי נמצא בשלב המים.אמולסיה זו מונחת כשכבה שבין זכוכית מיקרוסקופ לבין כיסית זכוכית ריבועית בגודל 22 מילימטר ליישומים של מיקרוסקופיה. בתחילת הליך זה, יש לנקות את זכוכית המיקרוסקופ ואת כיסיות הזכוכית ולצפות אותן בחומר הידרופובי. נקו את כלי הזכוכית על ידי שטיפה בממתק אצטון במשך חמש דקות.לאחר השטיפה, השאירו את כלי הזכוכית לייבוש באוויר. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 2% methyl trimethoxy silane באצטון וטבלו את כלי הזכוכית בתמיסה למשך שתי דקות. לאחר הציפוי, הוציאו את כלי הזכוכית מהתמיסה והניחו להם להתייבש.לאחר מכן, שטפו את כלי הזכוכית ב-70% ethanol מבקבוק נסpray. לאחר השטיפה, הניחו לכלי הזכוכית להתייבש שוב באוויר והסירו כל שארית נוזל. באמצעות אוויר דחוס, ניתן לאחסן את כלי הזכוכית המצופים למשך חודש אחד לפחות.לאחר הכנת כלי הזכוכית, השג חלבונים פלואורסצנטיים שטוהררו בעבר כחלבונים בעלי תג his מ-e coli. מדוד את ספקטרום הבליעה של החלבון המטוהר. הכן תמיסת סטוק בדילול בעלת צפיפות אופטית של בערך 0.1 בתמיסת tris buffered saline ב-pH שמונה המכילה 0.1% bovine serum albumin.בנוסף, הכין 10 מיליליטר של תערובת ביחס של אחד לאחד של אוקטנול ותמיסת tris buffered saline בתוך פרועת קונית של 15 מיליליטר וערבב בעוצמה. לאחר הערבוב, השאר את התערובת עד להשלמת הפרדת הפאזות. הפאזה העליונה היא האוקטנול; כדי להכין את האמולסיה, העבר בעזרת פיפט 45 מיקרוליטר של אוקטנול ו-5 מיקרוליטר של חלבון פלואורסצנטי אל תוך פרועת epi orph.הקישו על המבחנה מספר פעמים כדי להתחיל ביצירת האמולסיה, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למבחנה למשך 30 שניות באמבט סוניקציה. בינתיים, הכינו זכוכית כיסויה וסלייד מיקרוסקופ מצופה לאחר הסוניקציה. האמולסיה צריכה להיות עכורה לחלוטין.שאי מיד ארבעה µL מהאמולסיה מחלקו המרכזי של המבחנה אל תוך זכוכית כיסוי מצופה, וכסה אותה עם זכוכית כיסוי מצופה. האמולסיה צריכה להתפשט באופן אחיד בין זכוכית הכיסוי לבין זכוכית המיקרוסקופ. תוך מספר דקות, הדגימה צריכה להיות יציבה.הפרוצדורה הבאה מהווה אסטרטגיה כללית להקמת ניסוי המרה פוטוכימית של חלבון פלואורסצנטי במיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי. ניתן להחיל פרוצדורה זו הן על חלבונים מופרדים והן על תאים חיים. בניסוי זה, דגימה של טיפה המכילה חלבון m orange two מופרד משמשת כנקודת התחלה כללית לניסוי ההמרה הפוטוכימית.הגדירו את מיקרוסקופ הסריקה הלייזרית הקונפוקלית באופן הבא. השתמשו בעדשה שמאית עם טבילה בשמן בעלת הגדלה של 40 x ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.3, ובגודל תמונה של 512 על 512 פיקסלים. הגדירו את זמן השהייה של הפיקסל לשש מיקרו-שניות לסריקה, את הזום ל-4 והגדילו את גודל הפינהול (pinhole) כדי להתאים לרזולוציית Z של שלוש מיקרונים.הגדירו שני ערוצי זיהוי עבור הפלורסצנציה הראשונית והמומרת פוטו-כימית, וכן ערוץ להמרה פוטו-כימית. צפו במינים הכתומים באמצעות אור עירור של 561 ננומטר ואספו את הפלורסצנציה בין 570 ל-630 ננומטר. זהה את המינים האדומים שהומרו פוטו-כימית באמצעות אור עירור של 633 ננומטר ואסוף את הפלורסצנציה בין 640 ל-700 ננומטר.עבור ערוץ המרת הפוטונים, בחר בקו הלייזר של 488 ננומטר ואסוף את הפלואורסצנציה בין 490 ל-540 ננומטר. עבור ערוץ המרת הפוטונים אין צורך מחייב, אך הוא עשוי לסייע. כדי להתחיל בניסוי, השתמש בערוץ הגילוי כדי לדגם את הפלואורסצנציה הראשונית באמצעות סריקה רציפה, במטרה להתאים את עוצמת הלייזר ואת הגבר הגילוי (detector gain) לאיכות תמונה אופטימלית.לאחר מכן, הפעילו את ערוץ ההמרה הפוטו-כימית (photo conversion) ובחרו בעוצמת לייזר נמוכה. התחילו בצילום סדרת time-lapse והגבירו בהדרגה את לייזר ההמרה הפוטו-כימית עד שתיצפה דהייה (bleaching) משמעותית של הפלואורסצנציה הראשונית. המשיכו בסריקה עד שהפלואורסצנציה הראשונית תדע דהייה של כ-75%.לאחר מכן, בטלו את פעולתו של ערוץ המרת הפוטו והפעילו את ערוץ הגילוי עבור הפלורסצנציה שהומרה פוטו-כימית. התחילו את הדמיה עם הגבר גילוי גבוה בהספק לייזר נמוך. לאחר מכן, הגבירו בהדרגה את הספק הלייזר עד לגילוי הפלורסצנציה שהומרה פוטו-כימית.לאחר הזיהוי, כווננו את הספק הלייזר ואת הגבירה (gain) או הזיהוי לקבלת איכות תמונה אופטימלית. לבסוף, בצעו אופטימיזציה לספק הלייזר המשמש להמרה פוטוכימית וכן למשך הזמן שלו. הגדלת ספק הלייזר תאיץ את קצב ההמרה הפוטוכימית.עם זאת, הספק לייזר גבוה מדי יגרום להבהרה פוטוכימית (photobleaching) של החלבון. ברגע שנקבעו ההמרה הפוטוכימית האופטימלית, הספק הלייזר ומשך הזמן, ניתן להשתמש בפרמטרים אלו להגדרת מודול הבהרה פוטוכימית סטנדרטי או מודול התאוששות פלואורסצנציה לאחר הבהרה פוטוכימית (FRAP). לאחר מכן, ערוץ ההמרה הפוטוכימית לא יהיה נחוץ יותר בשל תכונות הסדירה הספקטרליות של mOrange2.ניתן להשתמש בו בשילוב עם החלבון הפלואורסצנטי בעל המתג הפוטו-ירוק ששורטט כ-PU לצורך הדגשה אופטית באמצעות גשושית כפולה. כדי להתחיל בהדגשה אופטית באמצעות גשושית כפולה, גדלו תאי hela בצלחות עם תחתית זכוכית מסוג mat tech; העבירו לתאים פלסמידים המקודדים לחלבונים הפלואורסצנטיים 24 שעות לפני הדמיון באמצעות טרנספקציה סטנדרטית של LIPECTOMY 2000.הניחו את התאים החיים תחת מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי והגדירו את המיקרוסקופ עבור המרה פוטו-כימית של M orange two כפי שתוואר קודם לכן. לאחר מכן, הגדירו את המיקרוסקופ עבור מיתוג פוטו-כימי של DPA. DPA מעורר באמצעות אור של 488 nanometer וניתן לדמות את הפלואורסצנציה שלו באמצעות ערוץ ההמרה הפוטו-כימית של M orange two.יש לוודא שהספק הלייזר המשמש לדימות של MPA יהיה מינימלי, שכן הספק לייזר גבוה מדי יגרום להשבתה של mpa. הוסיפו ערוץ להפעלה פוטוכימית של MPA באמצעות עירור דו-פוטוני של 800 nanometer. לאחר מכן, קבעו את הספק הלייזר הנדרש לדימות, להפעלה פוטוכימית ולהשבתה פוטוכימית של פלואורסצנציית OFA.אחד ההיבטים הקשים ביותר בפרוצדורה זו הוא נטרול ה-RPA ללא המרה פוטוכימית של M orange, מכיוון ששני האירועים מתרחשים באותו אורך גל. כדי למנוע זאת, חשוב מאוד לבצע אופטימיזציה מדויקת של ההמרה הפוטוכימית.הספק ומשך הלייזר יש לנקוט במשנה זהירות, שכן המרה פוטוכימית של M orange two וביטול פעילות של PU מתרחשים שניהם בעת עירור באמצעות אור של 488 nanometer; כדי לבטל את פעילות ה-PU ללא המרה פוטוכימית משמעותית של M orange two, יש להשתמש בהספק לייזר נמוך יותר לאחר שנקבעו הפרמטרים עבור ההמרה הפוטוכימית של M orange two והמעבר הפוטוכימי של DPA.ניתן להשיג הדגשה אופטית באמצעות גששים כפולים. ראשית, בטלו את הפלואורסצנציה של DPA בכל שדה הראייה באמצעות עירור בעוצמה נמוכה של 488 nanometer. לאחר מכן, בחרו אזור עניין והמירו m orange two באמצעות עירור בעוצמה גבוהה של 488 nanometer.לבסוף, בחרו אזור עניין והפעילו פלואורסצנציית DPA באמצעות עירור דו-פוטוני ב-800 nanometer. דגימות של טיפות חלבון פלואורסצנטי מתאימות באופן אידיאלי להקמת יישומים של המרת תמונות (photo conversion) במיקרוסקופ קונפוקאלי. כאשר דגימת הטיפות מוכנה כראוי, הטיפות נראות הומוגניות מאוד.עם זאת, כאשר הדגימה מוכנה ללא ציפוי של זכוכית הכיסוי על עליית המיקרוסקופ, הטיפות נוטות להימעך כנגד אחד ממשטחי הזכוכית בדגימות שהוכנו. בהיעבדת 0.1%BSA, החלבון הפלואורסצנטי נוטה להצטבר בממשק המים היחיד. יצירת הילה של המרה פוטו-פלואורסצנטית תלויה באופן קריטי בעוצמת הלייזר ובמשך החשיפה.עוצמת לייזר גבוהה מדי או זמן חשיפה ארוך מדי יגרמו לפוטובליצ'ינג (Photobleaching) ויובילו להפחתה של הפלואורסצנציה האדומה שהומרה פוטו-כימית. התכונות הספקטרליות המובחנות של M orange two ו-PHO מאפשרות הדגשה אופטית של שני גששים לפני המרה פוטו-כימית; תאים המבטאים את M orange two, היסטון H two B ו-DPA mito מראים פלואורסצנציה כתומה בגרעין ופלואורסצנציה ירוקה במיטוכונדריה. כאשר כל הפלואורסצנציה כובה באמצעות עירור ב-488 nanometer בעוצמה נמוכה, מתרחשת המרה פוטו-כימית מינימלית של M orange.ניתן לבצע המרה פוטונית של M orange two לאדום באמצעות עירור בעוצמה גבוהה באורך גל של 488 nanometer. לאחר שה-M orange two עבר המרה פוטונית, ניתן להדליק שוב את הפלואורסצנציה של drawn puff באמצעות עירור פוטון כפול באורך גל של 800 nanometer. באמצעות הדגשה אופטית של גששים כפולים, ניתן לסמן תאים בארבע דרכים נבדלות.באמצעות טכניקה זו, ניתן לסמן באופן ספציפי ארבעה אוכלוסיות תאים שונות. כפי שראיתם, אחד ההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו הוא השבתת ה-MPA ללא המרה פוטוכימית של m orange. לאחר שליטה בשיטה, ניתן לבצע ניסויים נוספים באמצעות מערכת זו, למשל, מעקב אחר אוכלוסיות מרובות בתאי בטא בלבלב.זה הכל. אני מקווה שמצאתם מצגת זו מועילה, ובהצלחה בניסוייכם.

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

למד המרת פוטו של חלבונים פלורסנטיים וסימון אופטי כפול בתאים חיים באמצעות mOrange2 ו-Dronpa. שיטה זו מאפשרת תיוג של ארבע אוכלוסיות תאים שונות לחקר תהליכים תאיים דינמיים.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים