טכניקות הדמיה Ca ^{2 +} איתות זרע אנושי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג סדרות תמונות של תאי זרע אנושיים מקובעים המסומנים בצבע פלואורסצנטי המדווח על רמות סידן. תאים בעלי יכולת תנועה מבודלים מהפלזמה של נוזל הזרע על ידי הנחייתם לשחות למעלה אל תוך תוך כדי דגירה במצע גידול. לאחר קפצטציה, התאים מסומנים באינדיקטור סידן פלואורסצנטי, ולאחר מכן מועברים לתא דימות הניתן להיתוך, המורכב על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך.

תגובות ריכוז יוני סידן נלכדות כסדרה של תמונות במרווחי זמן (time-lapse) ומנותחות כדי להפיק תגובות של תאים בודדים. שלום, אני אדווין אנדרס מוראלס גרסיה מהמעבדה של ד"ר Steven J.Public Cova בבית הספר למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ברמינגהאם, בריטניה. אני קתרין נאש, גם מהמעבדה של Public Overlap.

ואני ג'ניפר מוריס מה-Public Overlap. היום נראה לכם פרוצדורה לדימוג תגובות סידן תוך-תאיות בתאי זרע אנושיים בודדים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הרגולציה של פעילויות זרע באמצעות גירויים המופקים מהביצית ומהמסלול הנשי.

כך נתחיל. יש לאחסן את דגימות הזרע בטמפרטורה של 37 °C למשך לא יותר מ-30 דקות מרגע האספה, כדי לבודד את התאים הנעים מהפלזמה של הזרע. העבירו 1 mL של תמיסת מלחים מאוזנת (L'S balance salt solutions) מועשרת ב-0.3% BSA, המכונה S-E-B-S-S, לסדרה של מבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה בנפח 5 mL. הוסיפו בעדינות 0.3 mL של זרע כשכבה תחתונה ל-S-E-B-S-S בכל מבחנה, וסגרו את המבחנה באופן רופף.

דגרו את המבחנות בזווית של 45 מעלות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C וב-6% carbon dioxide. כדי לאפשר לתאים ניידים לשחות מעלה אל ה-S-E-B-S-S, שאבו בעדינות את 0.7 milliliter העליונים של התמיסה והעבירו את התמיסה מכל המבחנות למבחנה צנטריפוגית נקייה מפסטירן בנפח 15 milliliter. נערה בעדינות כדי לערבב, וספרו את התאים שקובעו באמצעות פורמלין בתא ספירה מסוג bowel חדש.

הביאו את הריכוז ל-6 מיליון תאים למיליליטר ב-S-E-B-S-S וחלקו את הזרע למכסות (aliquots) של 200 µL במבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה בנפח 5 מיליליטר. סגרו את הפקקים באופן רופף. אם נבדקת התגובה של תאים שעברו קבציטציה (capacitation), הדגרימו את המבחנות במשך חמש עד שש שעות ב-37 °C ו-6% carbon dioxide כדי לאפשר את הקבציטציה. טפטפו 10 µL של 10% polylysine כמספר טיפות קטנות למרכז של משטח בגודל 22 על 50 מילימטר.

מספר אחת את זכוכית הכיסוי ואפשרו לה להתייבש לחלוטין. השתמשו בגריז ואקום כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי, כאשר הצד המטופל פונה כלפי מעלה, לתא דימוי הניתן להיתוך שנבנה למטרה זו.

עבור כל ניסוי דימוי, בחרו מבחנה אחת של תאים שעברו קבציטציה (capacitated cells) והוסיפו 1.2 µL של Calcium dependent organ green בריכוז של 2.5 mg/mL המומס ב-DMSO, כדי להגיע לריכוז סופי של 10 µM. דגרו את המבחנה למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 °C וב-6% CO2.

באמצעות פיפט 200 µL עם טיפ P 200, הוצאו את כל התמיסה מהמבחנה באופן מלא. מלאו את התא על ידי הזרקה עדינה לתוך פתח הכניסה. הגו את התא כך שבועות אוויר יצאו דרך פתח היציאה.

הניחו את התא כולו בתוך האינקובטור והדגרימו למשך 20 דקות נוספות ב-37 °C ו-6% carbon dioxide. זאת כדי לאפשר לזרעים להיקשר ל-poly D lysine. הרכיבו את התא על המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך וחברו אותו למערכת הפרפוזיה.

השאירו את הדגימה בחושך למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר לסריקה של הפרפוזיה להסתיים. תאי תאים חופשיים ושאריות חוץ-תאיות תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) בהגדלה של 40 x או 60 x, בחרו שדה ראייה שבו המרווח בין התאים מספיק כדי לאפשר הערכה נפרדת של הפלואורסצנציה מכל תא. התאים צריכים להיות מקובעים כראוי, אך רצוי שיציגו פעילות פלגראט (fledger) ברורה.

העבירו את המיקרוסקופ לערוץ הפלואורסצנציה הירוקה. שמרו על זמני חשיפה מינימליים ככל הנדרש לקבלת תמונת פלואורסצנציה ברורה, כדי להפחית פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) בתוכנת IQ.

הפעילו את רכישת התמונות בסדרת זמן. רכשו תמונות בתדר של 0.1 hertz והשתמשו בתריס הנשלט על ידי התוכנה כדי להגביל את התאורה. לאחר הקלטה ראשונית למשך תקופת בקרה של שלוש עד חמש דקות, שנו את ריכוז הסידן בתמיסת הסלין והחילו תרופות על ידי החלפת הסלין בראש מערכת הפרפוזיה.

רשמו את הזמן שבו כל גירוי נוסף לכותרת וחשבו את זמן הגעתו לתא כפי שמתואר בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. כדי לנתח תמונות באופן לא מקוון (offline), השתמשו באחד מכלי הרישום כדי להקיף אזור עניין או ROI סביב כל תא או חלק מהתא; כאן, ראשו האחורי של תא הזרע, מכיוון שסידן מאוחסן ומוגבל באזור זה. גללו עם סרגל ההחלקה כדי לבחון את סדרת התמונות.

זהו והסר תאים שאינם נשארים במלואם בתוך ה-ROI, חופפים לתאים אחרים, או שהראו עלייה חזקה ומהירה בעוצמת הפלואורסצנציה ואחריה ירידה חדה, המאפיינת מוות תאי. השתמש בפונקציית הניתוח (analyze) כדי להפיק סדרת עוצמות פלואורסצנציה לאורך זמן עבור כל ROI. את הנתונים ניתן לייצא לאחר מכן ולנתח בגיליון אלקטרוני.

תמונות אלו הן מסדרה שהתקבלה במהלך גירוי עם פרוגסטרון בריכוז של 3 µM. השורה התחתונה צבועה בצבעי פסאודו. כדי להמחיש טוב יותר שינויים בעוצמה היחסית, הפרוגסטרון נכנס לתא כאן.

תוצאות אלו מוצגות בסרטון time-lapse. שימו לב לעלייה חדה ומהירה בעוצמת הפלואורסצנציה, ולאחריה עלייה איטית, המעידה על שינויים תואמים ברמות הסידן התוך-תאיים. נתונים אלו מכומתים כאן על סמך עוצמות ממוצעות מהחלק האחורי של הראש בשלושה תאים.

פרוגסטרון בריכוז של Three micromolar הוסף בנקודת הזמן המסומנת על ידי החץ. הקו המקווקו מראה את ממוצע הפלואורסצנציה של קבוצת הביקורת. היום הצגנו בפניכם כיצד לבודד תאים באיכות גבוהה, להטעין אותם בצבע רגיש לסידן, ולנטר את התגובה של תא בודד לגירוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש באוכלוסיית התאים הטובה ביותר, כמו כן לצמצם את חשיפת התאים לאור כדי למנוע נזק פוטו-כימי, ולבחור את הצבע המתאים ביותר לתגובות שאתם מחפשים. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.