תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים
28 במאי 2007
וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.
שמי דיאנה דאוד ואני פרופסור במחלקות לאנטומיה ונוירוביולוגיה וביולוגיה התפתחותית ותאית כאן באוניברסיטת קליפורניה באירווין. היום אני הולך לספר לכם על הכנת תרביות עצביות מדרוזופילה פופי. זה כרוך בהסרת המוח מהגורים בשלב מאוחר, ובדרך כלל אנו מגדלים רק את אזור המוח המרכזי.
ובשלב זה כבר נוצרים המבנים האנטומיים העיקריים הקיימים במוח הבוגר. זה כולל את אונות האנטנה שבהן יש נוירוני הקרנה ששולחים את האקסונים שלהם כל הדרך למעלה לאזור גוף הפטרייה ונוירונים של גוף הפטריות, תאים קנייתיים, ששלחו את האקסונים שלהם למטה לנוירוני המטרה שלהם דרך אונות אלפא, בטא וגמא. ביום התרבית, הדבר הראשון שאנו עושים הוא להיכנס למכסה הזרימה הלמינרי ולהכין סטרילי, תמיסת האנזים שבה נשתמש כדי לנתק את הרקמה.
ואנחנו גם מרכיבים את המדיום שבו נשתמש לגידול התאים. וזה עשוי מגבעולים שהכנו מבעוד מועד. השלב הבא הוא לאסוף את הגורם שבו נשתמש עבור הניתוק הזה או עבור הדיסקציה.
וזה נעשה מחוץ למכסה המנוע מכיוון שהם גדלים בבקבוקונים המכילים שמרים וכל מיני דברים אחרים. וכך אנו למעשה מבצעים את השלבים הראשונים של הנתיחה שלנו מחוץ למכסה המנוע. אלה מציצים שזה עתה הורדתי מדפנות הבקבוקון, ובשורה השמאלית הזו יש לנו בעלי חיים עם עיניים אדומות והם מהווים במה טובה לתרבית.
אלה הם מעט, ה-PPP האלה כאן קצת יותר צעירים. יש להם עיניים כתומות או צהובות, וזו שורה בסדר 1 0 7. יש להם עיניים מעט בהירות יותר מסוגי בר רגילים שבהם הצבע בשלבים אלה יהיה קצת יותר חום.
כל השלבים הללו מתאימים לתרבית, להפיכת האנשים לתרביות מוח. אוקיי, הצעד הראשון כאן הוא לשים כמה טיפות של תמיסת ניתוח ממש ליד הגורם שהוצאתי וסידרתי בשורה בצלחת הפטרי שלי. אנו משתמשים בחלק העליון של צלחות פטרי 35 מילימטר.
לאחר מכן אני לוקח זוג מלקחיים ללא מספר חמש ביד שמאל ומזרק טוברקולין CC אחד עם מחט בקוטר 27 בקצה. אלה שני כלי הניתוח שלי. וכדי להסיר את הראש ממארז האישון או מהגור, בעיקרון אני צריך להשתמש ב-i, אני מחזיק את הגור עם המלקחיים ביד שמאל, ואז אני משתמש במחט ביד ימין כדי להסיר את החלק הקדמי של מארז האישון.
לאחר מכן אני מחזיר את המשיכה לאחור את כיסוי הציפורן והראש קופץ מלפנים. אני משתמש במחט שלי כדי לחתוך את אזור ה-I בצוואר ואני מרים את הראש ומניח אותו בתוך טיפת מי המלח המנתחים. אני אחזור על ההליך הזה 10 עד 15 פעמים כי כדי ליצור תרבית טובה, אני אוהב שיהיו לי 10 עד 15 חיות מכל גנוטיפ.
בסדר, אני הולך להסיר את המוח מראש החיה. כדי לעשות זאת, אני משתמש בשני מזרקי טוברקולין שכל אחד מהם מחזיק מחט בגודל 27. את המחט השמאלית אני מניח ישר דרך הפסיס של החיה כדי להצמיד את הראש לתחתית צלחת הפטרי.
ואז אני משתמש במחט הימנית שלי כדי לפתוח חריץ בצד ימין, ושם אני הולך לדחוף את המוח החוצה. אוקיי, ואני, השלב הבא הוא לשים את המחט השמאלית שלי על העין השמאלית. ועכשיו אני הולך פשוט לדחוף לשעבר והמוח אמור לצאת מהצד הימני דרך החריץ.
הנה זה בא. אתה יכול לראות את זה בצד ימין, ועכשיו אני יכול פשוט להשתמש במחט הימנית שלי כדי להפריד אותו משאר קפסולת הראש והעיניים. בסדר. כעת, לפני שאני מבצע את הדיסקציה הסופית, שהיא הסרת האונות הראייה, אני מעביר את המוח לטיפה נקייה של מי מלח.
אני יכול להשתמש באימן צינור כדי לעשות זאת, ואני מרים אותו ממש בקצה של אימן צינור של 20 מיקרוליטר, ואני משתמש בו מוגדר על חמישה מיקרוליטר, או שאני יכול להעביר אותו גם על המחטים. זהו השלב האחרון בהליך הדיסקציה. זה נעשה בטיפה טרייה של מי מלח, ובאופן כללי יהיו לי כאן בערך 10 עד 15 מוחות.
לאחר מכן אני מסיר את האונות האופטיות מכל אחת מהן על ידי שימוש במחטים בגודל 27 ככלי חיתוך, ואני פשוט חותך את האונה האופטית השמאלית ואז אני חותך את האונה האופטית הימנית בכל מוח. ובשלב זה, כל המוחות שעובדו בדרך זו יועברו לתוך שפופרת המכילה את תמיסת האנזים, שתשמש לדיסוציאציה האנזימטית. כל המוחות מגנוטיפ יחיד מוכנסים לתוך צינור einor יחיד של מכסה בורג אפי המכיל טחנה אחת של תמיסת האנזים.
ואז אנחנו פשוט מדביקים אותם למחזיק מבחנה ומניחים אותם על מסובב שם הם יושבים במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. וזה הזמן האמיתי של הדיסוציאציה. כדי להשלים את שלב הדיסוציאציה של האנזים, עלינו למעשה להסיר את האנזים.
אז אנחנו מביאים את הצינורות לצנטריפוגה של EOR, מניחים את הצינורות בצנטריפוגה, ואנחנו הולכים לסובב אותם במשך שלוש דקות ב-3000 סל"ד. לאחר שאנו מסובבים את המוחות כלפי מטה, אנו מביאים אותם כעת למכסה הזרימה הלמינרי שלנו. כאן מתחיל החלק הסטרילי של ההליך.
כעת איננו פותחים את הצינור אלא אם כן אנו נמצאים במכסה הזרימה הלמינרית, וכעת נסיר את תמיסת האנזים. נחליף אותו בתמיסת ניתוח, ואז נסתובב ונשטוף מספר פעמים גם בתמיסת חיתוך וגם במדיום מוגדר, שבו אנו מגדלים את התאים. בסדר.
הדבר הראשון שאני צריך לעשות כאן הוא שאני צריך לשים טיפה של חמישה מיקרוליטר של מי מלח על כל אחד מפתקי הכיסוי שיש לי בצלחות הפטרי האלה. יש פתק כיסוי יחיד לכל צלחת פטרי, והוא מצופה בקון למינין, אז שמתי טיפה של חמישה מיקרוליטר ממש באמצע החלקת הכיסוי. שם נמצאת טיפת הלמינין שלי.
זה חשוב מאוד כי אתה רוצה לרכז את התאים שלך ממש באמצע השדה כי אנחנו מקבלים בערך 10,000 תאים למוח, וזה מה שאנחנו מייצרים איתו תרבית אחת. אוקיי, אז עכשיו כשמסתכלים במיקרוסקופ, הנה תשעה מוחות שכבר עברו את הליך הדיסוציאציה של האנזים. אתה יכול לראות שהם עדיין די שלמים.
אין להם את האונות האופטיות שלהם. אלה הוסרו, אבל יש לנו רק את האזור המרכזי במוח ועכשיו אני הולך להעלות מוח בודד ולהעביר אותו לטיפה של חמישה מיקרוליטר על פתק כיסוי. ואני עושה את זה ארבע פעמים.
אני לוקח שני מזרקי CC אחד ששמים על מחטי 27 מד. שוב, חשוב מאוד לציין שמדובר בכלי ניתוח זולים וחד פעמיים מאוד, כך שסטודנטים לתואר ראשון יכולים לעשות זאת מבלי לדאוג לתקציב שלך. אוקיי, אז עכשיו יש לי את שתי המחטים ואני הולך לעשות את הדיסוציאציה המכנית הראשונית, כלומר פשוט לחתוך את המוח הזה לכמה חלקים, מה שיאפשר לי למעשה לשאוב את החתיכות האלה לתוך פיפטה מזכוכית תוך דקה בלבד כדי להשלים את הדיסוציאציה הסופית.
כשאני עושה את זה, אני לא מוריד אותם לחתיכות קטנות, אני רק רוצה להגדיל את הגודל הכולל כדי שאוכל לקבל קצת כך שהפיפטה, כשאני עושה את הדיסוציאציה תעלה חתיכות קצת יותר קטנות מהמוח המלא. אני גם רוצה לעשות את זה מהר יחסית כי אתה רואה שהנפילות של המדיה קטנות. זה אומר שיש לנו יחס משטח לנפח גבוה וגם ה-pH וגם האוסמולריות של התמיסה יכולים להשתנות אם אני משאיר אותה בחוץ למשך זמן כלשהו.
כשעשיתי את זה לראשונה, למעשה עשיתי רק שני מוחות בכל פעם, שתי תרביות בכל פעם. עכשיו אני בדרך כלל עושה ארבעה, ועכשיו אני הולך לשבור את הפיפטה, אבל אני לא יכול לדבר על זה או משהו, נכון? את זה סיימתי זה עתה.
הדיסוציאציה, גודל הפיפטה היה די טוב. הצלחתי למצוץ את הרקמה למעלה ולמעלה ולמטה כמה פעמים, ואתה יכול לראות תאים בודדים ואלה, עדיין יש לנו גושים, אבל זה בסדר. הם יישטפו.
כעת, התרביות, ברגע שהן מצופות, מונחות בצלחת פטרי שנייה והן מונחות באינקובטור CO2 תוך כמה דקות, כי אנחנו רוצים לוודא שאנחנו שומרים על ה-pH והאוסמולריות ברמה שתומכת בהישרדות שלהן. אז אנחנו מדביקים אותם כאן למשך 30 דקות לפני שאנחנו מציפים את הצלחת. תרביות אלה הוכנו ממוחם של גורי כלבים בשלב מאוחר.
התרבית גדלה במשך יומיים בחממת CO2, ואתם יכולים לראות תאים בודדים שיש להם תהליכים מורחבים. היקף ההרחבה של התהליך קטן ממה שהייתם רואים בחמישה ימים ויותר ממה שהייתם רואים ביום אחד. שמי חורחה אנו.
אני עובדת במעבדת הספקות. אני הולך להראות לכם עכשיו איך אנחנו עושים את הניסוי, ניסוי הדמיית הסידן בתרביות האנשים שזה עתה הכנו. זהו סרטון של ניסוי הדמיית סידן שבו אתם רואים תאים כחולים שמראים רמות סידן נמוכות, ותאים אדומים מצביעים על רמות סידן גבוהות.
נראה שיש כמה תאים שהופכים לאדומים וזה מצביע על עלייה ברמות הסידן התוך תאיות. ואלה ספונטניים ואלה חולפים. הם חוזרים לרמות הסידן של בעל עם הזמן, ולאחר זמן מה, אנו הולכים למרוח תרופה, במקרה זה, ניקוטין, ואתם תראו שהתאים מעלים את רמות הסידן התוך-תאי.
אנחנו מורחים ניקוטין במשך 100 שניות, ואז אנחנו נזהרים מניקוטין, ואז התאים חוזרים לרמות הסידן הבסיסיות. אז היתרון האמיתי של מערכת התרבית הזו הוא שאנחנו מסוגלים ליצור את התרביות שלנו מקווי זבובים טרנסגניים ומוטנטיים כאחד, שונים שבהם תת-אוכלוסיות שונות של נוירונים מסומנות ב-GFP. זהו המוח מאחד הקווים שבהם השתמשנו שבו GFP מתבטא בגוף הפטרייה, בתאים קנייתיים, בתאי עצב המעורבים בתיווך התנהגויות מורכבות, כולל למידה וזיכרון.
גופי התאים ממוקמים למעלה בהיבט הגבי של המוח סביב האזור שבו נמצאים החצים האדומים. והמבנים האלה בצורת L שהם חיוביים ל-GFP הם למעשה ההקרנות האקסונליות של התאים הקנייתיים האלה בגוף הפטריות. לאחר דיסוציאציה של רקמת מוח זו.
הנוירונים מחדשים את התהליכים שלהם בתרבית, ותוכלו לזהות בקלות את התאים הקנייתיים החיוביים ל-GFP במקרה זה. אלה נגישים הן לרישום אלקטרופיזיולוגי סטנדרטי והן למחקרי הדמיית סידן. לכן, התרבויות האלה הן כלים שימושיים מאוד לחקר הגורמים הגנטיים והסביבתיים שחשובים בוויסות התפקוד של תאי עצב שאנו יודעים שהם חשובים בתיווך התנהגויות מורכבות אצל החיה הבוגרת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הכנתם של תרביות נוירונים ראשוניות ממוחות של בובות Drosophila בשלב מאוחר. התהליך כולל את הוצאת המוח וגידול של אזור המוח המרכזי, תוך הצגת צמיחת נוריטים ודימות סידן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- בובות של Drosophila משמשות להכנת תרבית נוירונים.
- אזור המוח המרכזי גודל בתרבית כדי לחקור התפתחות נוירונלית.
- מבנים אנטומיים עיקריים נוצרים בשלב מאוחר זה.
- טכניקות של דימות סידן מיושמות כדי להדמיות של פעילות נוירונלית.
מטרת המחקר
- להדגים את הכנתם של תרביות נוירונים.
- לבחון צמיחה של נוריטים בנוירונים בתרבית.
- להשתמש ב-Fura-2 לצילום רמות סידן בנוירונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאת המוח מבובות של Drosophila בשלב מאוחר.
- הכנת תמיסת אנזימים סטרילית לפירוק רקמות.
- תרבית של אזור המוח המרכזי.
- דימוי רמות סידן באמצעות Fura-2.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של תרביות נוירונים ראשוניות.
- תצפית על צמיחת נוריטים בתרביות חיות.
- דימיון החושף דינמיקת סידן בנוירונים בתרבית.
- הדגמה של מבנים אנטומיים מרכזיים במוח הבוגר.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של התפתחות נוירונלית.
- דימות סידן מספק תובנות לגבי פעילות נוירונלית.
- בובות של Drosophila משמשות כמודל בעל ערך למחקר במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרביות עצביות ראשוניות מפוּפאות של Drosophila בשלב מאוחר מספקות מערכת ניתנת למניפולציה גנטית לצורך חקר היווצרות ותפקוד סינפסיים. מודל זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות בנורו-פרמקולוגיה על ידי קישור מניפולציה גנטית למדדי תפקוד, כגון דינמיקת סידן ופעילות סינפטית ספונטנית. המערכת תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים שבהם סינון פנוטיפי ופיתוח בדיקות נהנים מרשתות עצביות הניתנות לשחזור ורלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כלים גנטיים כמו סמנים פלואורסצנטיים המונעים על ידי GAL4, כדי לזהות תתי-אוכלוסיות של נוירונים המעורבות בהתנהגויות מורכבות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות רישומים של תא שלם (whole-cell recordings) המדגימים יצירה של סינפסות כולינרגיות ו-GABAergic.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכה של גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על יצירה ותפקוד של סינפסות מרכזיות באמצעות חומרים פרמקולוגיים כגון nicotine.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות המתאימות ליישומי סריקה בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות צמיחה עקבית של נוריטים ושינויים ספונטניים בריכוז הסידן הניתנים למדידה באמצעות צבע Fura-2.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני קווי תאים טרנסגניים ומוטנטים להערכה מהימנה של תרכובות בצינורות גילוי מרכזיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק ערך להפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי קישור מניפולציה גנטית ב-Drosophila לפנוטיפים נוירונליים תפקודיים הרלוונטיים למסלולים סינפטיים שמורים.
- תועלת של מודל פרה-קליני: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מידול של רגולטורים פנימיים וחיצוניים של תפקוד הסינפסה במערכת נגישה גנטית.
- הלימה לסממנים ביולוגיים: מאפשר זיהוי של אוכלוסיות נוירונליות המסומנות פלואורסצנטית (למשל, תאי Kenyon חיוביים ל-GFP) למעקב אחר מעורבות המטרה ומודולציה של המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד לזיהוי מוביל, על ידי אספקת מערכת נוירונלית פעילה תפקודית וניתנת למניפולציה גנטית, המתאימה לסריקה פנוטיפית ולהמשך בירור מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות ניתוח גנטי של תתי-אוכלוסיות נוירונליות תוך שימוש בקווי GAL4 ובסמנים פלואורסצנטיים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות רגנרציה ניתנת לשחזור של ניוריטים ותוצרי דימות סידן כמותיים באמצעות Fura-2 לניטור תגובות ספונטניות ותגובות מושראות על ידי תרופות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון תנודות סידן תוך-תאיים ופעילות סינפטית ספונטנית, כדי לאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות שימור מנגנוני תמסורת עצבית כולנרגית ו-GABAergic הרלוונטיים למודלים של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כבסיס ליכולת ניתנת לשימוש חוזר על פני גנוטיפים ותנאים ניסיוניים מרובים, ובכך מפחית פיתוח כפול של מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה על היווצרות סינפסות פונקציונליות ואיתות סידן תלוי-פעילות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולי דיסוציאציה מוגדרים וצפיפות זריעה עקבית (~10,000 תאים למוח).
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהערכת מטרות עצביות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם-סיכון, בהתבסס על השפעות על מעגלים עצביים מוגדרים גנטית ועל תפקוד סינפטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירו-אנאטומיה, בדיסוציאציה אנזימטית של רקמות ובטכניקות של דימוי תאים חיים.
- תלוי בכלי ניתוח סטריליים, בתמיסות אנזימטיות (למשל, papain), ובאינקובציה תחת בקרת CO2 לשמירה על התרבית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין הצוותים להבטחת עקביות בתהליכי הוצאת המוח, הדיסוציאציה המכנית והזריעה (plating).
- שיקולי התאמה כוללים שונות בתשואת הנוירונים בין גנוטיפים שונים והצורך באופטימיזציה של זמן הדיסוציאציה בהתאם לשלב ההתפתחותי.
- מגבלות מעשיות כוללות קריעה של נוריטים (neurite sheering) לאחר הדיסוציאציה, הדורשת זמן התחדשות, ושונות פוטנציאלית בביצוע התהליך במהלך ימי התרבית הראשונים.
