Name: תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: חקור הכנת תרביות עצביות ראשוניות ממוחות של תסיסנית גלמים בשלב מאוחר. השיטה כוללת בידוד האזור המרכזי של המוח, תצפית בגדילת נויטריטים ודימות סידן באמצעות Fura-2 לחקר פעילות נוירונלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS27501 DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופק על ידי מענק קליפורניה תמיכה DKOD באמצעות תוכנית פרופ HHMI.

הכנות לפני יום culturing: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון מנתחים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את DMEM סטרילית ושומרים aliquots 10 מ&quot;ל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סטרילי DDM2 תוספי הקפאת 50 או 100 aliquots μl במשך חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את ConA / laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל coverslips. אופציונלי: בצע CNBM חנות סטרילית להקפיא עד 4 חודשים. </li></ol> ביום של culturing I. הכן פתרון אנזימים (ES) במנדף תזרים למינרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 5 מ&quot;ל של ביתור פתרון (DS) בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 0.8 מ&quot;ג ציסטאין-L ב 0.6 מ&quot;ל Eppendorf ולהוסיף 150 μl של DS. פיפטה למעלה ולמטה עד הקריסטלים נעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 150 מ&quot;ל של DS / ציסטאין על DS 5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 U (יחידות) של Papain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של 0.1 N Na OH ומערבבים היטב. הפתרון יהיה ברור בתוך 30 דקות. כאשר מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים פתרון סינון עם מסנן 0.2 מ&quot;מ מזרק לתוך צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל כובע בורג microfuge Papain: רוצה 50 U DS ב 5 מ&quot;ל. כל אצווה שונה במקצת, אז צריך לחשב כמה: 37.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 28.3 U / מ&quot;ג 37.3 x 28.3 = 1055.59 U / ml (1000 מ&quot;ל) 50 U = 47.4 מ&quot;ל </li></ol> השנייה. הפוך את DDM2 התקשורת ביום של culturing: להוסיף את התוספים הבאים כדי DDM2 עד 10 מ&quot;ל של DMEM להוסיף את התוספים, ממש לפני culturing: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl transferrin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl Putrescine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl סלניום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl הפרוגסטרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50μl אינסולין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl 20-Hydroxyecdysone </li></ol> הערה: בצע מספיק DDM2 לכל התרבויות המתוכנן (כל המוח מצופה על coverslip יחיד צלחת פטרי 35 מ&quot;מ בודדים, 1.5 ms התקשורת / תרבות) שלב III-VI יכול להיות על הספסל נעשה במעבדה nonsterile ואמור להסתיים תוך 45 דקות או פחות. ג. אוסף גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10-15 גלמים משני של הבקבוקון תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום גלמים במכסה של צלחת פטרי 35 מ&quot;מ יבש. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בדרך כלל במוחם של גלמים בין 55-78 שעות לאחר היווצרות puparium (APF). זה מעט קשה יותר לנתח את המוח של גלמים הצעיר מאז כמוסות ראש נוטים לקרוס, בעוד הרמה הכללית של תולדה neurite נמוכה מעט מ גלמים הבכור. בשנת המתח wildtype קנטון-S, בשלבים אלה מוכרים על ידי פיגמנט בעיניים כי הם חום בהיר עד מעט אדמדם, עם פיגמנט מעט במקום אחר. IV. עריפת ראש תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי טיפות של תמיסת לנתח סטרילי בתוך מכסה של צלחת פטרי, ליד גלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק גולם אחד עם מלקחיים קנס ביד שמאל ולהשתמש 27 מזרק מחט מד מצורף מזרק 1 סמ&quot;ק ביד ימין כדי להסיר את העור המת בקצה הקדמי של גולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט מעט גולם עם מלקחיים כראש עולה 27 להשתמש מחט מד לנתק את הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה של מחט או מלקחיים, העברת ראש טיפת לנתח פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד שיש לך 10-15 ראשי בטיפה אחת. </li></ol> V. הסרת המוח מהראש תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ&quot;ק עם מחט מד 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלה לתפקיד ראש לטוס ירידה של ביתור פתרון כל כך חוטם פונה אליך את פני השטח הגבי של הראש הוא בצפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט שמאלה אל חוטם כדי להצמיד את הראש למטה ולהשתמש מחט הזכות לבצע חתך בעין ימין העובר מן הגחון אל פני השטח הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט ממש ליד שמאל באזור חוטם ולאחר מכן להשתמש במחט משמאל בעדינות לדכא את הקוטיקולה מעל העין השמאלית, דוחפים את המוח לכיוון החריץ בעין ימין. המוח צריך לצאת מן חריץ בצד ימין, ללא פגע יחסית, לעתים קרובות עם שני lo אופטייםBES עדיין מחוברת ולפעמים רקמת העין פיגמנט גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את המוח על גבו של המחט ולהעביר לירידה של תמיסת מלח סטרילית לנתח בצלחת חדש סטרילי, 35 מ&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 10-15 מוחות עבור כל גנוטיפ. </li></ol> VI. הסרת אונות אופטיים וטיפול אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ&quot;ק עם מחט 27 מד ולהשתמש אלה כדי לאסוף את כל המוחות בתחום אחד קטן של ירידה של פתרון לנתח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרקים כמו כלי חיתוך כדי להסיר את האונות אופטיים מהמוח כל כך את הרקמה הנותרת לתרבות הוא האזור במוח המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetman 20 μl, נקבע μl 5, להעביר את כל במוחם של גנוטיפ יחיד צינור Eppendorf המכילה 1 מ&quot;ל של תמיסת papain סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מודגרות ב papain במשך 10-15 דקות על קבוצה מסובב ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 3 דקות. </li></ol> בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית סטרילי - כל השלבים שבו רקמה חשוף לאוויר צריך להיעשות ברדס זרימה למינרית עבור השלבים הנותרים. VII. כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון אנזים ולהחליף פתרון מנתחים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם פתרון לנתח סטרילי בסך הכל 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלוחים לנתח ולהחליף DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף בסך הכל 2 פעמים עם DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מוח התקשורת מ&quot;מ צלחת פטרי סטרילית 35. </li></ol> VIII. טחינה דקה ו ציפוי תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 ul של DDM2 במרכז coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 המוח ירידה זו של DDM2 עם קצה צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ, להשתמש במחטים 27 מד אל הקוביות את המוח לחתיכות קטנות (צריך לקחת &lt;1 דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הדרכתו חזותיים, לשבור את קצה pipet כוס כי כבר משך לנקודה קנס כך חלקים גדולים יותר יכולים להישאב לתוך בעדינות קצה pipet וגורשו בחזרה לתוך המדיום. אנו משתמשים צינורות יניקה בפה כי מגיעות כסטנדרט עם זכוכית 100 המטוקריט μl נימי. הערה: הקפד לא לקבל בועות בתקשורת תצטרך אמפירי לקבוע את גודל pipet הטובה ביותר לשימוש. אלה טובים מאפשרים לך לנתק את המוח עם כמה תאים בודדים ועדיין כמה גושים גדולים, כ -30 שניות / המוח. כשאתה מסתכל על אלה בהספק גבוה יותר, כ 10-20% של נוירונים צריך עדיין יש כמה תהליכים שנותרו עדיין יהיו כמה גושים גדולים. אם לנתק יותר מדי, אז כל התאים יהיו עגולים יהיה להם נזק נגרם כל כך הרבה הם לא ישרדו. צעד זה דורש תרגול חייב להיעשות במהירות מאז יש יחס גדול משטח ל-נפח osmolality ו-pH של ירידה של DDM2 יכול להשתנות במהירות. רקמות צריך להיות ממוקם בתוך חממה CO 2 במהירות האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוב על מכסה צלחת פטרי &quot;, גנוטיפ התאריך והשעה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את 35 מ&quot;מ צלחת פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ (עם kimwipe רטוב) ולתת להתיישב CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבול צלחת 35 מ&quot;מ עם 1.5 מ&quot;ל של DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבויות בחממה של 5% CO 2 באינקובטור (23 ° C). הערה: אם אין לך גישה ל-CO 2 באינקובטור קירור, השתמש תקן יונקים בתרבית רקמה החממה או לשים אותו בחדר חום קריר עד 23 ° C, או לשים במעבדה, לכבות זמני, ולהשתמש מגש קרח בחלק התחתון של החממה להסדיר זמני סביב הסביבה. </li></ol> IX. האכלה תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 (למחרת), להוסיף 0.5 מ&quot;ל של CNBM/B27 (Media אילף) כדי להפוך 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5 להחליף 1 מ&quot;ל של התקשורת 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תאים האכלה עם 03:01 DDM2: CNBM/B27 כל 4-5 ימים. הערה: תרבויות ניתן לגדל בלי הלא ממוזג אבל התקשורת העצבית הנוירונים נראים קצת שבירים יותר וקשה יותר לשימוש בניסויים electrophysiology. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

נוירונים שנקטפו מן המוח של מכרסמים עובריים / לאחר הלידה ניתן לגדל בתרבית תאים העיקרי שבו הם להאריך neurites וליצור קשרים סינפטיים תפקודית. שיטות הכנה של תרבויות אלה מבוססים היטב מחקרים בתרבויות מכרסם העצבית יש תפקיד קריטי בזיהוי גנים וגורמים סביבתיים מעורבים ויסות היווצרות פונקציה סינפסה ו (הבנקאי Goslin, 1991). בעוד הנוירונים חרקים ממגוון רחב של מינים יכול להיות גם גדל בתרבות, הנוירונים חרקים רק הראו ליצור קשרים סינפטיים פונקציונלי בתרבות הם מן תסיסנית (Rohrbough et al, 2003). Neuroblasts שנקטפו אמצע...

Coverslips לציפוי: לשים coverslips autoclaved בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. 5 Pipet ul של קון תערובת / Laminin על מרכז coverslip כל אחד. מקום 37 C החממה למשך 2 שעות. לשטוף coverslips 3x עם ul 100 מים autoclaved כל אחד. השתמש ואקום המצורפת pipet פסטר סטרילית. במהלך השטיפה האחרונה, להרים את coverslip עם מלקחיים ויבש שני הצדדים. מעבירים את coverslip כדי בצלחת פטרי 35mm. אחסן בטמפרטורת החדר עד חודש.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של late stage תסיסנית גלמים

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת תרבויות העצבית העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. ההליך מתחיל עם סילוקו של מוחות מחיות ב 70-78 שעות לאחר היווצרות puparium. המוח מבודד מוצגים לאחר דגירה קצרה papain ואחריו שוטף מספר בינוני סרום ללא צמיחה. תהליך ניתוק מכני של המוח כל טיפה 5 ul של התקשורת על coverslip מודגם. האקסונים והדנדריטים של הפוסט mitotic הנוירונים התרחק ליד סומה במהלך דיסוציאציה אבל הנוירונים מתחילים מחדש תהליכים בתוך כמה שעות של ציפוי. תמונות להראות תרבויות לחיות 2 ימים. נוירונים להמשיך לפרט תהליכים במהלך השבוע הראשון בתרבות. אוכלוסיות נוירונים מסוימים ניתן לזהות בתרבות באמצעות GAL4 קווי לנהוג ביטוי רקמות ספציפיות של סמנים ניאון כגון GFP או RFP. הקלטות שלמות התא הדגימו את נוירונים בתרבית טופס פונקציונלי, סינפסות cholinergic ו GABAergic פעיל באופן ספונטני. קטע וידאו קצר ממחיש הדינמיקה סידן נוירונים בתרבית באמצעות Fura-2 כמו צבע אינדיקטור סידן לפקח הארעיים סידן ספונטנית ניקוטין התגובות סידן עורר בצלחת של נוירונים בתרבית. אלו תרבויות המוח גלמי הם מערכת מודל שימושי אילו כלים גנטיים תרופתי יכול לשמש כדי לזהות גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על היווצרות ותפקוד של סינפסות המרכזית.

וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

בסרטון זה, אנו מדגימים את הכנתם של תרביות נוירונים ראשוניות ממוחות של בובות דרוזופילה (Drosophila) בשלבים מאוחרים. ההליך מתחיל ב...

שמי דיאנה דאוד ואני פרופסור במחלקות לאנטומיה ונוירוביולוגיה וביולוגיה התפתחותית ותאית כאן ב-uc Irvine. היום אספר לכם על הכנת תרביות נוירונליות מבובות של Drosophila. תהליך זה כולל הוצאת המוח מבובות בשלב מאוחר, ובדרך כלל אנו מרביים רק את אזור המוח המרכזי.בשלב זה, המבנים האנטומיים העיקריים הקיימים במוח הבוגר כבר נוצרו. אלו כוללים את ה-antenna lobes שבהם נמצאים נוירוני היטל (projection neurons) השולחים את האקסונים שלהם עד לאזור ה-mushroom body, ואת נוירוני ה-mushroom body, תאי Kenyon, ששלחו את האקסונים שלהם אל נוירוני המטרה שלהם דרך ה-Alpha, beta ו-gamma lobes. ביום התרבית, הדבר הראשון שאנו עושים הוא להיכנס למנדף זרימה למינרית ולהכין באופן סטרילי את תמיסת האנזים שבה נשתמש כדי לפרק (dissociate) את הרקמה.בנוסף, אנו מכינים את המצע שבו נגדל את התאים. המצע מורכב ממרכיבים שהכנו מראש. השלב הבא הוא איסוף הפופות שבהן נשתמש לצורך הדיסוציאציה או להבדילה.וזה נעשה מחוץ למכס הפירנה (hood), כיוון שהם גדלים בבקבוקונים המכילים שמרים וסוגים שונים של חומרים אחרים. לכן, אנו מבצעים את השלבים הראשוניים של הנתיחה מחוץ למכס הפירנה. אלו הן זבובים שזה עתה הוצאתי מדפנות הבקבוקון, ובשורה השמאלית יש לנו בעלי עיניים אדומות, והם נמצאים בשלב מתאים לתרבית.אלו מעט, ה-PPP כאן מעט צעירים יותר. יש להם עיניים כתומות או צהובות, וזהו קו 1 0 7 תקין. העיניים שלהם בהירות מעט יותר מאשר באסוגים פראיים רגילים, שבהם הצבע בשלבים אלו יהיה חום יותר.כל השלבים הללו מתאימים לתרבית, ליצירת תרביות של מוחות בני אדם. אוקיי, השלב הראשון כאן הוא להניח כמה טיפות של תמיסת דיסקציה ממש לצד ה-pupi שהוצאתי וסידרתי בצלחת הפטרי שלי. אנו משתמשים במכסים של צלחות פטרי בקוטר 35 מילימטר.לאחר מכן אני לוקח בידי השמאלית פינצטה מסוג no number five ומזרק טוברקולין של 1 CC עם מחט gauge 27 בקצה. אלו הם שני כלי הניתוח שלי. כדי להוציא את הראש מתוך נרתיק הבובניה או מהבובניה, אני מחזיק את הבובניה בעזרת הפינצטה בידי השמאלית, ואז משתמש במחט בידי הימנית כדי להסיר את החלק הקדמי של נרתיק הבובניה.לאחר מכן, אני מחזיר את כיסוי הקוטיקולה למקומה, והראש בולט קדימה. אני משתמש במחט כדי לחתוך באזור הצוואר, ואז אני מרים את הראש ומניח אותו לתוך טיפה של תמיסת סלין לדיסקציה. אחזור על הליך זה 10 עד 15 פעמים, כיוון שכדי להבטיח תרבית טובה, אני מעדיף שיהיו 10 עד 15 בעלי חיים מכל גנוטיפ.כעת אגש להוצאת המוח מראשו של בעל החיים. לשם כך, אני משתמש בשתי מזרקי טוברקולין, כאשר בכל אחד מהם מחט בכילוג 27. את המחט השמאלית אני מניח ישירות דרך ה-psis של בעל החיים כדי לקבע את הראש לתחתית של פטרי הדגס.לאחר מכן, אני משתמש במחט הימנית כדי לפתוח חריץ בצד ימין, ושם אני אדחף את המוח החוצה. כעת, השלב הבא הוא להניח את המחט השמאלית מעל העין השמאלית. ועכשיו אני פשוט אדחף, והמוח אמור לצאת מהצד הימני דרך החריץ.הנה זה מגיע. ניתן לראות זאת בצד ימין, וכעת אני יכול להשתמש במחט הימנית שלי כדי להפריד אותו משאר קפסולת הראש והעיניים. טוב. כעת, לפני ביצוע הנתיחה הסופית, שנועדה להסיר את האונות האופטיות, אני מעביר את המוח לטיפה נקייה של תמיסת סליין.ניתן להשתמש בפיפטה כדי לבצע זאת, ואני אוסף את הדגימה בקצה של פיפטה של 20 µL, כשהיא מכוונת ל-5 µL, או שניתן להעביר אותה גם באמצעות מחטים. זהו השלב האחרון בהליך הנשף. הפעולה מבוצעת בטיפה רעננה של תמיסת סלין, ובדרך כלל יהיו כאן כ-10 עד 15 מוחות.לאחר מכן אני מסיר את האמבולי האופטיים (optic lobes) מכל אחד מהם באמצעות מחטים בכילוי 27 ככלי חיתוך, על ידי חיתוך האמבולה האופטית השמאלית ולאחר מכן חיתוך האמבולה האופטית הימנית בכל מוח. בשלב זה, כל המוחות שעובדו בדרך זו יועברו למבחנה המכילה את תמיסת האנזים, שתשמש לפירוק אנזימטי (enzymatic dissociation). כל המוחות מאותו גנוטיפ מוכנסים למבחנת Eppendorf אחת עם מכסה הברגה המכילה 1 mL של תמיסת האנזים.לאחר מכן, נמקם אותם במחזיק מבחנות ונניח אותם על רוטטור למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. זהו זמן הדיסוציאציה בפועל. כדי להשלים את שלב הדיסוציאציה של האנזים, עלינו להסיר את האנזים.כעת נהעביר את המבחנות לצנטריפוגת EOR, נמקם אותן במכשיר, ונרכז אותן בסחרור למשך שלוש דקות במהירות של 3000 RPM. לאחר ריכוז רכססות המוח, נעביר אותן למנדף זרימה למינרית. כאן מתחיל החלק הסטרילי של הפרוצדורה.כעת לא נפתח את המבחנה אלא אם כן אנו נמצאים תחת מכן זרימה למינרית, וכעת נסיר את תמיסת האנזים. נחליף אותה בתמיסת דיסקציה (dissecting solution), ולאחר מכן נסבב ונשטוף מספר פעמים, תחילה עם תמיסות דיסקציה ובסופו של דבר עם Defined medium, שבו אנו מגדלים את התאים. בסדר.הדבר הראשון שעלי לעשות הוא להניח טיפה של 5 µL של סליין על כל אחד מזכוכית הכיסוי שנמצאות בתוך צלוחיות הפטרי. בכל צלוחית פטרי יש זכוכית כיסוי אחת, שקוּתה בלמינין, לכן אני מניח טיפה של 5 µL בדיוק במרכז זכוכית הכסוי. שם נמצאת טיפת הלמינין שלי.זה חשוב מאוד מכיוון שברצוננו לרכז את התאים בדיוק במרכז השדה, כיוון שאנו מקבלים כ-10,000 תאים למוח, וזהו הכמות ממנה אנו מקימים תרבית בודדת. אוקיי, כעת במבט במיקרוסקופ, כאן יש תשעה מוחות שכבר עברו את הליך הדיסוציאציה האנזימטית. ניתן לראות שהם עדיין נשמרים במידה רבה במצבם השלם.האוניות האופטיות שלהם אינן נמצאות. הן הוסרו, כך שנשארנו רק עם אזור המוח המרכזי, וכעת אשאב באמצעות פיפט מוח בודד ואעבירו לטיפה של 5 µL על לביה cover slip. אני חוזר על הפעולה הזו ארבע פעמים.אני לוקח שתי מזרקים של 1 CC ומחבר אליהם מחטים בכיול 27. שוב, חשוב מאוד לציין שמדובר בכלי ניתוח זולים מאוד וחד-פעמיים, כך שסטודנטים לתואר ראשון יכולים לבצע זאת מבלי לדאוג לתקציב. אוקיי, כעת יש לי את שתי המחטים ואני אבצע את הדיסוציאציה המכנית הראשונית, שפירושה פשוט לחתוך את המוח הזה למספר חלקים, מה שיאפשר לי לשאוב את החלקים הללו לתוך פיפטת זכוכית בעוד דקה כדי להשלים את הדיסוציאציה הסופית.בעת ביצוע שלב זה, אני לא מפרק אותם לחלקים זעירים; אני רק מעוניין להקטין את הגודל הכולל כדי שהפיפטה, בזמן ביצוע הדיסוציאציה, תשאף חלקים קטנים מעט יותר מאשר המוח השלם. אני גם רוצה לבצע זאת במהירות יחסית, כיוון שניתן לראות שטיפות המדיום הן קטנות. המשמעות היא שיש לנו יחס שטח פנים לנפח גבוה, והן ה-pH והן האוסמולריות של התמיסה עלולים להשתנות אם אשאיר אותה בחוץ למשך זמן מה.כשביצעתי זאת לראשונה, הייתי מעבד למעשה רק שני מוחות בכל פעם, שתי תרביות בכל פעם. כעת אני בדרך כלל מעבד ארבעה, ועכשיו אני עומד לשבור את הפ pipette, אבל אני לא יכול לדבר על זה או שום דבר אחר, נכון? את זה הרגע סיימתי.בשלב הדיסוציאציה, גודל הפיפטה היה מתאים למדי. יכולתי לשאוב את הרקמה למעלה ולמטה מספר פעמים, וניתן לראות תאים בודדים; עדיין ישנם גושים, אך זה תקין, הם יישטפו.כעת, מיד לאחר הפריסה על המצע, מוצבים התרביות בתוך צלחת פטרי שנייה ומוכנסים לדגרה עם CO2 בתוך מספר דקות, שכן אנו רוצים להבטיח את שמירת ה-pH והאוסמולריות ברמה התומכת בהישרדותם. לכן, אנו משאירים אותם כאן למשך 30 דקות לפני הצפת הצלחת. תרביות אלו הוכנו ממוחות של בובות בשלב מאוחר.התרבית גודלה במשך יומיים באינקובטור CO2, וניתן לראות תאים בודדים שפיתחו שלוחות. מידת התפתחות השלוחות קטנה מזו שניתן לראות לאחר חמישה ימים וגדולה מזו שניתן לראות לאחר יום אחד. שמי חורחה אנו.אני עובד במעבדת Doubts. אני עומד להראות לכם כעת כיצד אנו מבצעים את הניסוי, ניסוי דימות סידן בתרביות התאים שהכנו זה עתה. זהו סרטון של ניסוי דימות סידן שבו ניתן לראות תאים כחולים המעידים על רמות סידן נמוכות ותאים אדומים המעידים על רמות סידן גבוהות.נראה כי ישנם תאים שהופכים לאדומים, דבר המעיד על עלייה ברמות הסידן התוך-תאיות. אלו הם אירועים ספונטניים וחולפים; הם חוזרים לרמות הסידן הבסיסיות עם הזמן, ולאחר זמן מה נחיל תרופה, במקרה זה ניקוטין, ואנו נראה את התאים מעלים את רמות הסידן התוך-תאיות.אנו מחילים ניקוטין למשך 100 שניות, לאחר מכן אנו שוטפים את הניקוטין, ואז התאים חוזרים לרמות סידן בסיסיות. לכן, היתרון האמיתי של מערכת תרבית זו הוא שאנו מסוגלים להכין את התרביות שלנו משני סוגי קווים של זבובים, הן טרנסגניים והן מוטנטיים, שונים זה מזה, שבהם תתי-אוכלוסיות שונות של נוירונים מסומנות ב-GFP. זהו המוח מאחד הקווים שבהם השתמשנו, שבו GFP מובע בגוף הפטרייה (mushroom body), תאי Kenyon, נוירונים המעורבים בתיווך התנהגויות מורכבות, כולל למידה וזיכרון.גופי התאים ממוקמים בחלק הגבי (דורסלי) של המוח, באזור שבו מופיעים החצים האדומים. ומבנים אלו בצורת L, החיוביים ל-GFP, הם למעשה השליחות האקסוניות של תאי הגוף הפטריות (mushroom body Kenyon cells) הללו. לאחר דיסוציאציה של רקמת מוח זו.הנוירונים מחדשים את תהליכיהם בתרבית, ובמקרה זה ניתן לזהות בקלות את התאים ה-GFP חיוביים. תאים אלו נגישים הן להקלטה אלקטרופיזיולוגית סטנדרטית והן למחקרי דימוי סידן. לפיכך, תרביות אלו הן כלים שימושיים מאוד לחקר הגורמים הגנטיים והסביבתיים החשובים בוויסות תפקודם של נוירונים שידוע לנו כי הם תומכים בתיווך של התנהגויות מורכבות בבעל החיים הבוגר.

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן...

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי גורמים אקסוגניים היוזמים הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה ממצבם השקט. זחלים שזה עתה בקעו מנותחים כדי לבודד את מוחם, אשר לאחר מכן מתורבתים במדיה עם או בלי הורמון בדיקה כדי להעריך את הפוטנציאל של ההורמון לגרום להפעלה מחדש של תאי גזע עצביים והתפשטות.

ניתוח הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים בצמחי מוח דרוזופילה בתרבית

הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.

אברון תחבורה בתרבית דרוזופילה תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לגרימת פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI) לדרוסופילים למבוגרים ובחינת הנוירוגנזה המתקבלת.

גירוי וניתוח נוירוגנזה למבוגרים במוח המרכזי של דרוזופילה

שיטה להפעיל מחדש תאי גזע עצביים שקטים בגרשי מוח דרוזופילה מתורבתים הוקמה. בשיטה זו, ניתן לנתק את תפקיד האותות המערכתיים מאותות מהותיים רקמה בוויסות של השבתת תאי גזע עצביים, כניסה ויציאה.

הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה מתורבת

חקור הכנת תרביות עצביות ראשוניות ממוחות של תסיסנית גלמים בשלב מאוחר. השיטה כוללת בידוד האזור המרכזי של המוח, תצפית בגדילת נויטריטים ודימות סידן באמצעות Fura-2 לחקר פעילות נוירונלית.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

גלה סרטונים נוספים