דרוזופילה בדיקת מחילה ומנהור: שיטה להערכת היפוקסיה של רקמות בזחלי זבובים

- כדי להקים את כלוב איסוף העוברים, השתמשו בצלחות אגר מיץ ענבים בתוספת משחת שמרים טריים והניחו את הצלחות על כלובים המכילים זבובי דרוזופילה זכרים ונקבות מהגנוטיפ המתאים. ריח השמרים ומיץ הענבים מושך ומקדם הטלת ביצים על ידי הנקבות. אפשר הטלת ביצים לתקופה קצובה. לאחר מכן להסיר את המבוגרים לדגור על לוחות העובר במשך 24 שעות כדי לקבל זחלי instar הראשון. לאחר מכן העבירו בעדינות כמה זחלים בודדים מצלחת מיץ הענבים לצלחת בדיקה לאגר בלבד, שם נחתך חור באגר במרכז הצלחת ומולא במשחת שמרים.

זחלים צעירים חייבים להאכיל כדי לעלות במשקל הגוף כדי להתפתח, ולכן הם מתחפרים במקור המזון, משחת השמרים. כאשר הם מתפתחים, הזחלים נכנסים לשלב נדידה ומתרחקים מהמזון כדי לחפש אתר לגור. כדי להעריך היפוקסיה, בחנו את דפוסי המנהור שהזחלים יוצרים במצע. חוסר או מנהור לא מספיק הוא סימן למחסור בחמצן. בפרוטוקול לדוגמה, נראה כיצד להגדיר את בדיקת המחילה והמנהור.

- הגדרת הבקרה וההצלבות הגנטיות הניסיוניות בצלחות הטלת ביצים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. החזיקו את הזבובים בחשיכה לפחות יומיים לפני תחילת איסוף הביצים המתוזמן. לאיסוף ביצים מתוזמן, העבירו את הבוגרים לצלחות אגר ענבים חדשות המעוטרות במריחה טרייה של ממרח שמרים בתחילת היום ואפשרו למבוגרים להטיל ביצים על הצלחות במשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מעבירים את המבוגרים לצלחות אגר ענבים טריים.

לאחר מכן, דגרו על צלחות האיסוף של ארבע שעות למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. עד למחרת אחר הצהריים יבקעו רוב הזחלים. תכננו שיהיו לפחות 50 לכל קבוצת ניסוי.

עבור ריצה אחת של הבדיקה, הכינו לפחות חמש לוחיות בדיקה לכל קבוצת ניסוי. מוסיפים 16 גרם של אגר זבוב ב 700 מיליליטר של מים deionized על ידי חימום. הכינו 17.5 מיליליטר Nipagen ב 95% אתנול. מחממים את תמיסת האגר עד שהיא מומסת כמעט לחלוטין. לאחר מכן מוסיפים תמיסת Nipagen לתמיסת האגר ומחממים עד שהאגר מתמוסס לחלוטין. מצננים את תמיסת האגר לזמן קצר, ואז מעמיסים צלחות של 10 ס"מ עם 15 מיליליטר של תמיסת האגר. לאחר ג'ל אגר, לשים מכסים על הצלחות ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות או לילה.

אגר נרפא חייב להיות יציב למגע ולהתנגד להתפורר כאשר חתיכות נחתכות ממנו. לאחר שהאגר נרפא, השתמשו בבורר שעם בקוטר 1.5 ס"מ כדי ליצור חור מרכזי בג'ל האגר בכל צלחת. לאחר מכן ממלאים את החורים בצורה מסודרת במשחת שמרים טריים.

כדי להעביר את הזחלים לצלחת המבחן, לעשות כלי פשוט. כופפו קימור לקצה של מיקרו-מרית פלסטיק וטבלו את הקצה במשחת שמרים כדי שיהיה דבוק לזחלים. כעת הרימו את הזחלים הראשונים בנפרד והניחו אותם על צלחת האגר קרוב לתלולית המזון. עבור כל קבוצת ניסוי, הכינו לפחות חמש צלחות שכל אחת מהן מכילה 10 זחלים.

כדי להבטיח יכולת שחזור בין שכפול הבדיקה, קריטי להציב רק 10 זחלים על כל צלחת בדיקה. הקפד לבדוק היטב את צלחת הבדיקה כדי לקבוע כי זחל אחד ורק מועבר בכל פעם שאתה מוסר זחל עם קצה microspatula.

לאחר העמסת הצלחת, תייגו אותה, כסו אותה ולאחר מכן הניחו אותה בחושך כשצד המכסה כלפי מעלה בטמפרטורת החדר. בדקו כל צלחת מדי יום עד שכל הזחלים מתו או גדלו. להלן דוגמאות לצלחות לזן מסוג פרא מהיום השני ועד היום השמיני של הבדיקה. ביום השני, הזחלים קבורים במזון ולא מתרחשת מנהור. המנהור מתחיל ביום השלישי ומגיע למקסימום בין הימים החמישי לשמיני כאשר הזחלים מפסיקים לנדוד ולהתגורר במנהרותיהם.

מעבירים בזהירות את הגלמים עם מחט מתגרה כפופה לצלחת ענבים ואם רוצים, סופרים כמה גלמים נסגרים. שימו לב להיווצרות הגלמים והעריכו את הגלמים לאיתור חריגות.