Name: בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: למד שיטת הזרעת מושבות מספריות מטגנומיות על ממברנות ניילון באמצעות רובוטיקה מתקדמת. שיטה זו מאפשרת דיוק גבוה בהנחת 10,000 מושבות לממברנה אחת ומקדמת מחקר גנומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכלאה נוהל אחת צינור הכלאה ייקח 1 או 2 ממברנות (בגודל 22 על 22 ס&quot;מ). השתמש 50 מ&quot;ל של תערובת הכלאה ו 0.5 מ&quot;ג של ה-DNA בדיקה (10 ng / ml הריכוז הסופי) לכל צינור הכלאה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להשתמש בג&#39;ל מטוהרים-DNA כמו בדיקה. אם קנה המידה הכנה בדיקה, להגדיל את מספר צינורות במקום להגדיל את כמות ריאגנטים לכל צינור. בדיקה הכנה (0.5 מ&quot;ג DNA): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 15 μl של פתרון חוצה מקשר עם 60 μl של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל DNA עד 10 ng / μl עם מים בנפח 50 סך μl ב microtube בורג הכתיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNA של 5 דקות במים רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להעביר קרח ולתת להתקרר 5 דקות. ספין בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ התגובה ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תיוג מגיב ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הפתרון צולבות מקשר המדולל משלב 1 ומערבבים בעדינות. וורטקס בעדינות ספין בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הקרח עד שעות 2 או להוסיף נפח שווה של גליצרול 100% בחנות ב -20 ° C. הערה: השתמש המים המסופקים עם הערכה. שמור את כל ריאגנטים על קרח אלא אם צויין אחרת. </li></ol> ממברנה הכנה הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 50 מ&quot;ל של חיץ הכלאה צינור הכלאה עד 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את החיץ הכלאה על הכלאה הצינור. מרדדים את קרום (ים) ולהוסיף צינור הכלאה. (אם הוספת 2 ממברנות לכל צינור, הגלגול הראשון את קרום one לחלוטין, אז להפשיל את הממברנה אחרים על גבי באותו כיוון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינור הכלאה ב 60 ° C לפחות ½ ח (ודא קרום (ים) להירטב באופן יסודי.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כ 1 מ&quot;ל של חיץ הכלאה עם פיפטה ארוכה מהצינור הכלאה אל הצינור המכיל את תווית בדיקה. וורטקס בעדינות ספין בקצרה. העברת התערובת בחזרה אל צינור הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 60 ° C במשך הלילה. הערה: מלקחיים שימוש בכפפות בעת הטיפול ממברנות. תוכן מיקס של צינורות הכלאה בעדינות כי תסיסה רבה מדי תגרום להיווצרות קבוע של קצף רצויה. ממברנות יש להוסיף במצב רטוב: לטבול חיץ הכלאה או מים במידת הצורך לנקז נוזלים עודפים לפני שמוסיפים. </li></ol> 2. הליך איתור כביסה ממברנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים חיץ כביסה העיקרי עד 60 ° C. (השתמש מיקרוגל ו / או צלחת חימום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש 2 ממברנות בתוך הגליל האחד הכלאה, העברה חד הממברנה אל צינור נקי, שחומם מראש הכלאה ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף בצינור הכלאה עם כ 50 מ&quot;ל של חיץ לשטוף העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ 100 מ&quot;ל של חיץ לשטוף העיקרי צינור הכלאה ו דגירה ב 60 ° C במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3 ו -4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קרום כביסה מכולה דגירה עם לפחות 250 מ&quot;ל של חיץ לשטוף משני בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6. הערה: ממברנות עשוי להישמר במאגר לשטוף משני בטמפרטורת החדר לתקופה של עד חצי שעה לפני דור האות. </li></ol> אותות הדור וזיהוי (הליך קרום אחד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Two Tape פיסות SaranWrap שטוח על השולחן (אחד עבור לשלב 2 ואחד עבור שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנקז חיץ עודף הממברנה על ידי נגיעה בפינות הממברנה על הצד של המיכל ולהעביר את קרום על SaranWrap (צד מדגם למעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 6-7 מ&quot;ל של ריאגנט ECF על קרום ועוטפים בניילון לקפל מעל הממברנה. בזהירות להפיץ מגיב ECF על קרום בעדינות על ידי העברת Kimwipe על SaranWrap. דגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את מגיב ECF עודף הממברנה ולהעביר אותו על חדש SaranWrap, לעטוף לקפל מעל קרום, וסוגרים את הקצוות עם הקלטת. מכסים את קרום ברדיד אלומיניום. דגירה של 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את צלחת הזכוכית של הסורק ידי הפצת 1-2 מ&quot;ל של ריאגנט ECF על צלחת זכוכית. ואז להעביר את קרום לצלחת זכוכית (צד מדגם למטה) ולהפיץ עוד 1-2 מ&quot;ל של ריאגנט ECF על הממברנה. שכבת עם SaranWrap ובזהירות לדחוף את כל בועות האוויר מן הממברנה. (ייתכן מקום צלחת נוקשה על גבי SaranWrap כדי לשמור על הקרום נצמד צלחת זכוכית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש FLA-5100 פוג&#39;י סורק פלואורסצנטי (&quot;1 1 לייזר תמונת מצב&quot;) עם ההגדרות הבאות: עירור 473 ננומטר, זיהוי לסנן LPB (510 ננומטר), רזולוציה 50 מיקרומטר, אות הסיום 16-bit, CH1 400 V. (סריקה לוקח בערך 15-20 דקות לכל קרום בגודל 22 על 22 ס&quot;מ). אופציונלי: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשבת במשך 2-4 שעות (או יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הסריקה כמו בשלב 6. </li></ol> 3. שלילת ואחסון הליך (NUF גרסה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קרום עד 100% ethanol ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף אתנול 100% טרי דגירה הלילה בטמפרטורת החדר. (ממברנה עשויה להישאר באתנול במשך כמה ימים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף אתנול עם מים מזוקקים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל מים ו - 5 מ&quot;ל של 10% SDS (SDS 0.5% הסופי) לצינור הכלאה ומערבבים בעדינות. הוסף הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קרום למיכל, נקי וריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 500 מ&quot;ל מים ו - 5 מ&quot;ל של 10% SDS (SDS הסופי 0.1%) וכוס וחום לרתיחה בתנור מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את כמעט רותחים 0.1% SDS פתרון מעל הממברנה בעדינות להתסיס במשך כמה דקות. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב מ&quot;ל של לפחות 250 סטרילי 100 מ&quot;מ טריס pH 8 דקות לפחות 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים בקרום ב SaranWrap וקצוות לסגור היטב עם קלטות. חנות ב 4 ° C. (ממברנות אסור לייבש.) </li></ol>

נוהל הפשטת לא עבר אופטימיזציה. עם זאת, הליך הפשטה ניתנה הוראה של היצרן (2 רוחץ כל 10 דק &#39;ב 100% אתנול, לשטוף 1 של ח 1 ב 60 ° C ב 0.5% SDS) אינה מספקת. לפחות הדגירה לילה אתנול 100% יש צורך לפרק את המוצר התגובה ECF; הדגירה מספר ימים אתנול 100% נראה כי אין השפעות שליליות על היכולת reprobe הממברנה. SDS של יצרנית הטיפול גם כנראה לא מספיק. NUF ניסתה 1 ח ב 80 ° C עם 0.5% SDS ואחריו טיפול אחד עם כמעט רותחים SDS 0.1% הצלחה. טרייסי הראו כי פעם אחת לשפוך מעל עם כמעט רותחים SDS 0.1% מספיקה. <p style=";tex...

שילוב חבילת RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות metagenomic

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic ספריות ארכיון שברים גדולים של רצפי הגנום של מיקרואורגניזמים רציף ללא צורך טיפוח מוקדמת. יצירת הליך יעיל ליצירה ההקרנה ספריות metagenomic ולכן הוא שימושי עבור תפוקה גבוהה חקירות יעיל לתוך המאפיינים גנטית מטבולית של חיידקים מכלולים שאין להם תרבות. הנה, פרוטוקולים מפתח מוצגים על וידאו, אשר אנו מציעים הוא פורמט שימושי ביותר עבור במדויק לתיאור תהליך ארוך לסירוגין תלוי מכשור רובוטיים (אדם) התערבות ידנית. ראשית, אנו מועסקים רובוטיקה לזהות שיבוטים ספריה על צפיפות גבוהה ממברנות macroarray, שכל אחד מהם יכול להכיל מושבות לשכפל 20-4 צלחות ספריה-384 גם כן. אוטומציה הוא חיוני עבור הליך זה לא רק דיוק ומהירות, אלא גם בשל המזעור של סולם הנדרשים כדי להתאים את מספר גדול של שיבוטים ספריה לתוך סידורים מרחביים צפוף מאוד. לאחר שנוצר, אנחנו הבא הדגימו איך ממברנות macroarray ניתן לגילוי גנים של עניין באמצעות גרסאות של פרוטוקולים סטנדרטיים עבור תיוג בדיקה, הכלאה קרום, זיהוי האות. אנו משלימים את ההפגנה החזותי של נהלים אלה עם תיאורים מפורטים בכתב של השלבים הכרוכים ואת החומרים הדרושים, אשר כולם זמינים באופן מקוון לצד הווידאו.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

ספריות מטגנומיות מאחסנות מקטעים גדולים של רצפים גנומיים רציפים ממיקרואורגניזמים ללא צורך בגידול מוקדם. יצירת...

המטרה שלנו כאן היא להעביר מושבות מכמה מהספריות המטגנומיות הללו למסנני ממברנה, כאשר כל אחד מהמסננים הללו יכול להכיל 10,000 מושבות. לכן, מה שאני עושה כעת הוא להניח את מסנן הניילון הזה על גבי בלוק ולהחליקו. הוא נמצא במעט נוזל, שזה פשוט מצע הגידול luria broth.לאחר מכן, הוא יעביר את הממברנה הלחה לרובוט שיזריק באופן אוטומטי 10,000 מושבות על גבי הממברנה. רובוטיקה חיונית עבור סוג זה של הליך, מכיוון ששום בן אדם אינו בעל הסבלנות או הדיוק הנדרשים כדי להניח 10,000 מושבות על אחת מהממברנות הללו. רובוטים הם אחד הגורמים שקידמו בפועל את מדע הגנום, בכך שאפשרו ביצוע של פעולות חזרתיות מאוד ובקנה מידה מרחבי קטן בדיוק גבוה.כרגע, הרובוט מוגדר להעברת תכנים מ-3 פלטות של 84 בארות; כל בארה בפלטות אלו מכילה מושבה בודדת מספריית המטגנומיקה. כעת, הרובוט מעקר את מחטי ההזרקה שבהן ישתמש להטבעה על הממברנה. המחטים עוברות דרך מספר תמיסות שונות, אחת מהן היא 70% ethanol, לצורך עיקור, ולאחר מכן מחטי ההזרקה יוטבלו בפלטה של 84 בארות המכילה את כל המושבות.כעת הן עוברות עיקור וייבוש באמצעות אור. לאחר ייבוש מחטי ההזרקה, הרובוט יזיז פלטה פנימה. כל אחת מהמושבות הללו נספגת למעשה באופן כפול, דבר המשמש כביקורת.למעשה, אנו מחפשים שתי מושבות זהות המראות אות מההיברידיזציה. לאחר שכל המושבות הועברו למסנן, הוא מוחלה שוב על צלחת האגר שאתם

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

מקור: קים, ה. ואח', סקר רב-אנזימטי באמצעות מערכת סקר אנזימים גנטית בעלת תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שיטת סינון גנטית לזיהוי ביטוי אנזימים באמצעות ספריות פוסמידים מטאגנומיות וסובסטרטים כרוגניים. ציטומטריית זרימה מזהה ומבודדת תאים בודדים המייצרים תוצרים צבעוניים, ומאפשרת בחירה בתפוקה גבוהה של תאים פעילים המבטאים אנזימים.

זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

Metagenomics שימש לחקירת המיקרוביום של מזון בקר תחמיץ. הניתוח בוצע על ידי ריצוף רובה ציד. גישה זו שימשה לאפיון הרכב הקהילה המיקרוביאלית בתוך מזון הבקר.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למד שיטת הזרעת מושבות מספריות מטגנומיות על ממברנות ניילון באמצעות רובוטיקה מתקדמת. שיטה זו מאפשרת דיוק גבוה בהנחת 10,000 מושבות לממברנה אחת ומקדמת מחקר גנומי.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

גלה סרטונים נוספים