JoVE Encyclopedia of Experiments
ביולוגיה
0 צפיות • 2:59 דק' • April 30th, 2023
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה ובתוספת סרום יש להסיר את מערכת הרבייה מכל זבוב בעזרת מלקחיים. ראשית, להסיר חלקים של מערכת העיכול שאולי ליווה את מערכת הרבייה. כדי לבודד את בלוטות העזר ואת צינור השפיכה, להסיר את האשכים, את פקעת השפיכה, ואת הטרמינליה. שטפו את הרקמה במשך דקה עד שתיים ב-PBS כדי להסיר את הסרום. לאחר מכן, העבר אותו לפתרון דיסוציאציה.
כדי לחשוף את התאים בתוך הבלוטות לתמיסת הדיסוציאציה, החזיקו את מרכז כל בלוטה במלקחיים וחתכו דרך הבלוטה בעזרת זוג מלקחיים חדים. הסר את החלק הפרוקסימלי של הבלוטה ואת צינור השפיכה כדי להשאיר מאחור את הקצה הדיסטלי של הבלוטות המכילות את אוכלוסיית התאים המשנית הנדירה האחראית על הפרשת חלבונים המעורבים בהזדווגות. לבסוף, להעביר את קצות בלוטת האביזר לצינור מיקרו צנטריפוגה כהכנה לעיכול. בפרוטוקול הבא, ננתח את בלוטות העזר כדי לבודד תאים משניים לניתוח תעתוק.
- לפני תחילת ההליך, חותכים ומסובבים את הלהבה, קצוות רחבים של 200 מיקרוליטר לטיפול בבלוטות, ומעבירים את פתח החוד של מספר קצוות של 1000 מיקרוליטר ליד להבה למשך פחות משנייה אחת כדי להצר את הפתחים. לאחר מכן, מיין את הטיפים שהשתנו מצר לרחב יותר בהתבסס על מהירות השאיפה שלהם. לדיסקציה של בלוטת העזר, הניחו 20 עד 25 זכרים דרוזופילה בצלחת זכוכית על קרח והשתמשו במלקחיים ומיקרוסקופ דיסקציה כדי להסיר את מערכת הרבייה של זבוב זכר אחד.
נקו את זוג בלוטות האביזר מכל שאר הרקמות, כולל האשכים ופקעת השפיכה, והעבירו את בלוטות האביזר לפלטת זכוכית המכילה תוספת סרום בטמפרטורת החדר. כאשר נאספו 20 זוגות בלוטות אביזרים, שטפו את הבלוטות בצלחת של PBS למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. בסוף השטיפה, מעבירים את הבלוטות לתמיסת דיסוציאציה טרייה, ומשתמשים במלקחיים חדים תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לצבוט היטב את אמצע האונה הבלוטתית.
באמצעות זוג שני של מלקחיים, לחתוך את הרקמה עם קצה חד כדי להפריד את האזור הפרוקסימלי של בלוטת האביזר ואת צינור שפיכה מן החלק של הבלוטה המכיל תאים משניים. לאחר מכן, השתמשו בלהבה רטובה מראש מעוגלת בקצה פיפטה רחב של 200 מיקרוליטר כדי להעביר את הבלוטות לצינור של 1.5 מיליליטר.
מאמר זה מפרט פרוטוקול לדיסקציה של בלוטות העזר של זכרי Drosophila לצורך בידוד תאים משניים עבור אנליזת טרנסקריפטום. השיטה כוללת הסרה זהירה של רקמות רבייתיות ועיכוליות כדי להשיג את הבלוטות הדרושות להמשך המחקר.
דיסקציה ובידוד מדויקים של תאים משניים בבלוטת העזר הזכרית של Drosophila מאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי ברמת דיוק גבוהה במודל שניתן לשלוט בו גנטית. תהליך עבודה זה תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור מחקר בביולוגיה של הרבייה ובמסלול ההפרשה. השחזוריות של השיטה והספציפיות לסוג התא מגבירות את הביטחון החזוי עבור יישומי גנומיקה פונקציונלית וסריקות בשלבים הבאים.
פרוטוקול הניתוח והבידוד זה מתאים לממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשר ניתוחים חסונים ספציפיים לסוגי תאים, המנחים את בחירת המטרה ומחקרי מנגנונים.
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026