פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

- התחילו בהרכבת זחל נקי ומורדם מתחת לכיסוי זכוכית כשראשו מורם. לאחר מכן, חשוף את אזור העניין על ידי דחיפה עדינה של תלוש הכיסוי כדי לגלגל את הזחל ולהתאים את מיקומו. השתמש בהדמיה קונפוקלית כדי לאתר את התאים העצביים של הזחל. זהה אקסון ספציפי על אחד מתאי עצבי המטרה כאתר לפציעה.

לאחר מכן חשוף את אקסון המטרה ללייזר בעל שני פוטונים בעוצמה גבוהה יותר מזו המשמשת להדמיה כדי לגרום נזק. לייזר דו-פוטוני משמש בשל יכולתו לחדור ולמקם במדויק נזק בתוך רקמה חיה עם נזק מינימלי לרקמה הסובבת אותו.

עצור את החשיפה ללייזר מיד כאשר יש נזק לנוירון המטרה, וכתוצאה מכך אקסוטומיה, או ניתוק של האקסון. לבסוף, דמיינו את תא העצב הפגוע כדי לראות את הניוון שלו ואת ההתחדשות שלאחר מכן בנקודות הזמן הרצויות.

בפרוטוקול לדוגמה, נרכיב זחל למיקרוסקופיה, נגרום נזק לנוירונים תחושתיים של הזחל, ונעקוב אחר התחדשות עצבית.

- התחילו בהרדמת הזחלים. בתוך מכסה אדים, מניחים צלחת זכוכית 60 מ"מ לתוך צלחת פטרי פלסטיק 15 ס"מ. לאחר מכן קפלו פיסת נייר טישו והניחו אותה בצלחת הזכוכית. מניחים את צלחת אגר ענבים על הרקמה לאחר הוספת אתר diethyl.

לאחר מכן, על מגלשת זכוכית מניחים טיפה אחת של שמן Halocarbon 27 במרכז, ומניחים נקודה של שומן ואקום על כל אחת מארבע הפינות. לאחר מכן השתמשו במלקחיים כדי להעביר זחל אחד לצלחת האגר וכסו את צלחת הזכוכית כדי להרדים את הזחל. ברגע שהלבה מפסיקה לנוע, העבירו אותה בזהירות לשמן ההלוקרבון כשראשו זקוף. לאחר מכן הניחו כיסוי מחליק מעל המגלשה ולחצו עליו בעדינות עד שהוא נוגע בזחל.

לאחר מכן, השתמש בכוח עדין כדי להחליק את החלקת הכיסוי כדי לגלגל את התאים כדי להיות ablated למקום שבו לייזר שני פוטונים יפגע בהם בקלות. המיקום ישתנה בהתאם לתאי העצב שאליהם מכוונים. כעת אבטחו את ההרכבה על במת המיקרוסקופ הדו-פוטוני והתמקדו בתאים המעניינים באמצעות יעד טבילת שמן פי 40.

בתוכנה, עבור למצב סריקה וטען את הפרוטוקול שנשמר. ודאו שפתח את חור הסיכה עד הסוף. לאחר מכן, במצב חי, קבל תמונה טובה של אזור העניין.

לאחר מכן, הפסק את הסריקה החיה כדי שלחצן החיתוך יהיה זמין. באמצעות פונקציית החיתוך, התאם את חלון הסריקה כדי למקד את אזור המטרה רק באתר הפציעה הפוטנציאלי. לאחר מכן פתח חלון הדמיה חדש. כעת הפחיתו את מהירות הסריקה והגבירו את עוצמת הלייזר. לאחר מכן החלף את הלחצן רציף כדי להתחיל ולהפסיק את הסריקה. צפה בקפידה. ברגע שיש עלייה דרסטית פלואורסצנטיות, לסיים את הסריקה.

לאחר מכן, חזור לחלון ההדמיה המקורי ובחר את מצב החי, ומצא את האזור שזה עתה הותקף על-ידי התאמת המיקוד.

- אינדיקציה טובה לפציעה מוצלחת היא הופעתו של מכתש קטן, מבנה דמוי טבעת, או פסולת מקומית ממש באתר הפגיעה. אם עוצמת הלייזר הייתה גבוהה מדי, היה נראה שטח גדול שניזוק, שיכול להיות קטלני.

- כעת הסירו בזהירות את חלקת הכיסוי, והעבירו את הזחל הפגוע לצלחת חדשה עם משחת שמרים. מכניסים את הצלחת לצלחת 60 מ"מ יחד עם רקמה ספוגה בחומצה פרופיונית. לאחר מכן להחזיר את הצלחת לטמפרטורת תרבית.

להדמיה עוקבת של הזחל, השתמש במערך הקונפוקלי שנשמר ואסוף תמונות מחסנית z עם מטרה של 25x. הקפד לכלול את נקודת הנורמליזציה כדי שניתן יהיה לכמת את ההתחדשות.