סינון שינויים גנומיים: שיטה לזיהוי מוטציות שנוצרו על ידי קריספר בדרוזופילה

- כאשר עוברים מוזרקים מתפתחים למבוגרים G0, לחצות את כל הזבובים בודדים למלאי איזון מתאים כדי להרחיב את הקווים הערוכים F1 CRISPR פוטנציאלי ולהיות מסוגל לעקוב אחר התורשה של השינוי הגנומי. לאחר מכן, הצליבו זכרים בודדים שנבחרו באופן אקראי בפורמולה 1 לנקבות מאוזנות מתאימות כדי שיוכלו להחזיר צאצאים אם זכר F1 חיובי למוטציה. לאחר הצלב, העבירו את זכר הפורמולה 1 לצינור להקרנה.

כדי לחלץ DNA גנומי, מעכו את הזבוב עם קצה פיפטה המכיל חיץ מיצוי. ברגע שהרקמה מתפרקת, מוציאים את הנוזל. מאגר המיצוי מכיל פרוטאינאז K, אנזים המעכל חלבונים בדגימה ומנוטרל בחום גבוה.

כעת, כשהדנ"א נגיש, עברו לבדיקת PCR. לדוגמה, השתמשו בפריימרים שנועדו להגביר אזור הכולל את הרצף החדש. רק בנוכחות השינוי יקשור הפריימר השני ומוצר PCR יוגבר. בדוגמה, נראה זבובים מגודלים ומוקרנים על ידי PCR להחדרת רצף טרנסאקטיבציה המחליף את האקסון הראשון של הגן חסר הענפים.

- כאשר עוברי nos-Cas9 שהוזרקו בעבר הן עם פלסמיד ביטוי הרנ"א המנחה והן עם התורם החלופי מתפתחים לבוגרים, זבובי G0 חוצים בנפרד לזבובים מאזנים מקו המתאים לאלל הממוקד. הרדימו את צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית פחמן דו חמצני ובחרו באופן אקראי 10 עד 20 זכרים תחת מיקרוסקופ סטריאו. חוצים בנפרד כל זכר שנבחר לנקבה מאזנת מקו המתאים לאלל הממוקד.

כאשר זחלי F2 בוקעים, בחר את האב F1 מכל צלב. לחלץ DNA