מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית
April 26th, 2010
אנו מציגים פרוטוקול עבור כיפוף תאים חיידקיים פילמנטיות מצורף מכסה משטח החלקה עם מלכודת אופטי למדידת קשיות כיפוף הסלולר.
על מנת לקבוע את קשיחות הכיפוף של תאי קולי בנפרד, ראשית, יש לגדל את החיידקים לשלב אקספוננציאלי ולאחר מכן לחבר אותם למשטח החלקה של כיסוי שטופל כימית. תנו לתאים שכבר מחוברים לפני השטח לגדול עוד יותר כך שהם יפתחו קצוות גמישים. לאחר מכן, זרמו בחרוזים דיאלקטריים, לכדו חרוז וכופפו אותו לקצה הגמיש של התא.
השלב האחרון של ההליך הוא לכופף את התא עם המלכודת האופטית ולמדוד את נתוני התזוזה הכפויה המתקבלים. ניתן לחשב את קשיחות הכיפוף של התא על ידי התאמה ליניארית לנתוני התזוזה הכפויה. היי, אני סטיבן וונג מהמעבדה של פרופסור ג'ושוע שר במכון לואיס סיקלר לגנומיקה אינטגרטיבית והמחלקה לפיזיקה באוניברסיטת פרינסטון.
היום נראה לכם בהליך של כיפוף תאים אקולוגיים בודדים ונוקשות התאים המתחתנים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התרומות של מבנים תוך-תאיים שונים לשלמות המכנית של תאי החיידקים. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, גדל שלושה מיליליטר של כל תאי אי קולי בשלב LB בינוני עד אקספוננציאלי. ברגע שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של בין 0.2 ל-0.4, השלימו את התרבית עם 50 מיקרוגרם למיליליטר צפלקסין למשך 15 דקות כדי לגרום לצמיחה חוטית. במהלך 15 הדקות הללו, צור תא זרימה.
חבר שתי חתיכות של סרט דו צדדי עם מרווח של שלושה מילימטר בין החלקים למגלשת זכוכית והדביק החלקת כיסוי מעל. הפער בין פיסות הקלטת יוצר תעלה לזרימת נוזלים. מצפים את תלוש הכיסוי ב-PEI על ידי הזרמת 10 מיקרוליטר של 1% פוליאתלין מדולל במים לתוך תא הזרימה עם דגירה של מיקרו פיפטה למשך חמש דקות.
לאחר מכן יש לשטוף על ידי זרימה של 200 מיקרוליטר מים בקצה אחד של החדר ואיסוף בקצה השני עם ואקום. לאחר 15 דקות של גידול החיידקים בנוכחות צפלקסין, סובב מיליליטר אחד של תאים במיקרו צנטריפוגה והשהה מחדש 200 מיקרוליטר של LV עם צפלקסין. לאחר מכן, שוב, השתמש במיקרו פיפטה בקצה אחד ובוואקום בקצה השני כדי להזרים 50 מיקרוליטר מתרבית התאים המרוכזת לתוך התא המחזיק את החלקת הכיסוי המצופה למשך שלוש דקות.
לאחר מכן יש לשטוף עם 50 מיקרוליטר של Vel B בתוספת צפלקסין. כדי להסיר תאים לא מחוברים, דגרו את התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר לתאים המחוברים לגדול לפני הנחתם על מכשיר הלכידה האופטי בזמן הדגירה. הכן חרוזים מצופים פוליליזין על ידי דגירה של שלושה מיקרוליטר של חרוזי פוליסטירן בקוטר 0.5 מיקרומטר באחד מ-0.1% פוליליזין מדולל במים למשך 30 דקות.
כאשר החרוזים מסיימים לדגור, שטפו אותם שלוש פעמים על ידי סיבוב במיקרו צנטריפוגה והשעיה במיליליטר מים, המשיכו לקשור את החרוזים לחיידקים ולמדוד את קשיחות הקישור של התאים. ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה הוא היכולת לשחזר, לאתר ולזהות תא טוב למדידות של כיפוף, נוקשות. ותא טוב הוא תא עם קצה תקוע מוגדר היטב ומקום קצה חופשי.
תא הזרימה במיקרוסקופ מחפש תא עם קצה תקוע מוגדר היטב. חלק מהתאים מחוברים רק בקצה אחד, וכוח הכיפוף בקצה השני מוביל לתא שלם להסתובב במקום להתכופף. כדי למצוא תא מתאים, כופפו כל תא במהירות עם המלכודת באמצעות תנועת הבמה המבוקרת של הג'ויסטיק.
כאשר נמצא תא מתאים, יש לדלל את תמיסת החרוזים בפקטור של שניים ל-lb עם צפלקסין, להוסיף 30 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים לתא הזרימה על ידי פיפטינג לקצה אחד וזרימה עדינה החוצה בקצה השני עם רקמת ניגוב קים ללכוד אופטית חרוז צף ולגעת בו בקצה החופשי של התא. שטפו את החדר שוב על ידי מיקרופיפט והשתמשו ברקמה לבנה של קים עם 50 מיקרוליטר צפלקסין ב-LB כדי להסיר חרוזים לא מחוברים. לאחר מכן, הפעל תוכנית תצוגת מעבדה כתובה מותאמת אישית כדי להפעיל כוחות כיפוף על התא ולתעד את נתוני התזוזה הכפויה.
ראשית, כייל את תגובת הגלאי על ידי סריקת RA של החרוז המצורף בתוך קרן הלייזר לזיהוי והקלטת אותות מתח PSD תלת מימדיים. לאחר מכן זהה את הציר הארוך של התא בתמונת מיקרוסקופ. לאחר זיהוי ציר התא הארוך, הזז את התא בשלבים בכיוון מאונך לציר הארוך תוך הזזת רשומת התא, המרחק נע ותזוזת החרוז ממרכז המלכודת האופטית.
לבסוף, המירו את ערכי התזוזה לכוח המופעל באמצעות קשיחות ההשמנה שנמדדה קודם לכן ושמרו. תזוזת הקצה וכוח ההגשה כאן הם נתוני תזוזה מאולצת עבור תא בודד. השיפוע של קו זה הוא קשיחות הכיפוף של התא.
זה עתה הראינו לכם כיצד לשלב את קשיחות הכיפוף של אי קולי עם מלכודת אופטית. בעת שימוש בהליך זה, חשוב לזכור למצוא תא טוב עם קצה תקוע מוגדר היטב וקצה חופשי. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת קשיחות הכפיפה של תאים חיידקיים חוטייים באמצעות טכניקות לכידה אופטית. השיטה כוללת גידול תאי E. coli, חיבורם לזכוכית מכסה והפעלת כוחות כפיפה כדי להעריך את המאפיינים המכניים שלהם.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביופיזיקה
- מכניקת תאים
רקע
- הבנת המאפיינים המכניים של תאים חיידקיים חיונית להבנת התנהגותם ושלמותם.
- גידול חוטי של E. coli ניתן לגירוי כדי לחקור את קשיחות הכפיפה שלהם.
- מלכודות אופטיות מספקות שיטה לא פולשנית להפעלת כוחות על תאים בודדים.
- מחקרים קודמים התמקדו בשלמות המכנית של תאים בתנאים שונים.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול אמין למדידת קשיחות הכפיפה של תאי E. coli.
- לחקור את התרומות של מבנים תוך-תאיים למכניקת התא.
- לשפר את ההבנה של התנהגות תאים חיידקיים תחת לחץ מכני.
שיטות בשימוש
- גידול תאי E. coli במדיום LB עד לשלב אקספוננציאלי.
- גירוי גידול חוטי באמצעות cephalexin.
- חיבור תאים לזכוכית מכסה שטופלה כימית.
- שימוש במלכודות אופטיות להפעלת כוחות כפיפה ומדידת נתוני תזוזה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מודד בהצלחה את קשיחות הכפיפה של תאי E. coli בודדים.
- ניתוח הנתונים מגלה את הקשר בין הכוח המופעל לתזוזת התא.
- זיהוי תאים מתאימים למדידה הוא קריטי לתוצאות מדויקות.
- הממצאים תורמים להבנת מכניקת התאים החיידקיים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לחקר המאפיינים המכניים של תאים חיידקיים.
- לכידה אופטית היא כלי בעל ערך לחקירת קשיחות התאים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור היבטים נוספים של מכניקת התאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
