מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

על מנת לקבוע את קשיחות הכפיפה של תאי coli בודדים, ראשית, גדלו את החיידקים עד לשלב הצמיחה האקספוננציאלית ולאחר מכן הצמידו אותם לפני השטח של כיסוי זכוכית (cover slip) שעבר טיפול כימי. הרשו לתאים שכבר הצמידו את עצמם לפני השטח לגדול הלאה, כך שיפתחו קצוות גמישים. לאחר מכן, זרימו פנימה חרוזי דיאלקטריים, לכדו חרוד וכופפו אותו לעבר הקצה הגמיש של התא.

השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כיפוף התא באמצעות המלכוד האופטי ומדידת נתוני ההעתקה הכפויה הנוכרים. ניתן לחשב את קשיחות הכיפוף של התא באמצעות התאמה ליניארית לנתוני ההעתקה הכפויה. שלום, אני סטיבן וונג מהמעבדה של פרופסור ג'ושוע שיר במכון לואי סיקלר לגנומיקה אינטגרטיבית ובמחלקת הפיזיקה באוניברסיטת פרינסטון.

היום נדגים בפניכם פרוצדורה של כיפוף תאי E. coli בודדים ומדידה של קשיחות התא. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התרומה של מבנים תוך-תאיים שונים לשלמות המכנית של תאי החיידקים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, גדלו שלושה מיליליטר של תאי e coli כלשהם במצע LB עד לשלב הצמיחה האקספוננציאלית. ברגע שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר שבין 0.2 ל-0.4, הוסיפו לתרבית 50 מיקרוגרם למילליליטר של cephalexin למשך 15 דקות כדי להשרות צמיחה פילמנטית. במהלך 15 דקות אלו, הכינו תא זרימה.

הדביקו שתי פיסות של סרט דביק דו-צדדי למסלול זכוכית, כך שיישאר רווח של 3 מילימטרים בין הפיסות, והדביקו מעליהן כיסוי זכוכית (cover slip). הרווח שבין פיסות הסרט יוצר תעלה לזרימת נוזלים. ציפו את כיסוי הזכוכית ב-PEI על ידי הזרקת 10 µL של 1% polyethaline המדולל במים לתוך תא הזרימה באמצעות מיקרופיפט, והמתינו חמש דקות להדגרה.

לאחר מכן, שטפו על ידי זרימה של 200 µL מים בקצה אחד של התא ואיסוףם בקצה השני באמצעות ואקום. לאחר 15 דקות של גידול החיידקים בנוכחות cephalexin, סבבו (spin down) מיליליטר אחד של תאים במיקרו-צנטריפוגה ותלו אותם מחדש ב-200 µL של LV עם cephalexin. לאחר מכן, שוב, השתמשו במיקרו-פיפטה בקצה אחד ובואקום בקצה השני כדי להזרים 50 µL של תרבית התאים המרוכזת אל התא המכיל את כיסוי הזכוכית (cover slip) המצופה, והדגרו למשך שלוש דקות.

לאחר מכן שטפו עם 50 µL של Vel B מועשר ב-cephalexin. כדי להסיר תאים שאינם תפוסים, דגרו את התא בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר לתאים התפוסים לגדול, לפני הצבתם במכשיר המלכודת האופטית בזמן דגירת התאים. הכינו חרוזי פוליסטירון מצופים בפוליליזין על ידי דגירה של 3 µL של חרוזי פוליסטירון בקוטר 0.5 µm בתוך 0.1% Polylysine מהול במים למשך 30 דקות.

כאשר מסתיימת הדגירה של החרוזיים, שטפו אותם שלוש פעמים על ידי ספינטדאון במיקרו-צנטריפוגה ותגשוש מחדש במיליליטר אחד של מים, לאחר מכן המשיכו לקישור החרוזיים לחיידקים ומדדו את קשיחות הקישור של התאים. ההיבט הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא היכולת לאתר ולזהות תא מתאים למדידות של קשיחות הכפיפה. תא מתאים הוא תא בעל קצה מקובע וקצה חופשי מוגדרים היטב.

בסביבת תא הזרימה שעל המיקרוסקופ, חפשו תא בעל קצה מקובע ומוגדר היטב. חלק מהתאים מחוברים רק בקצה אחד, וכוח הכיפוף בקצה השני מוביל לסיבוב של התא כולו במקום לכיפופו. כדי למצוא תא מתאים, כופפו במהירות כל תא באמצעות המלכודת (trap) על ידי תנועת השולחן המנוהלת באמצעות הג'ויסטיק.

כאשר נמצא תא מתאים, דללו את תמיסת החרוצים פי שניים ב-lb עם cephalexin, הוסיפו 30 microliters של תמיסת החרוצים לתא הזרימה על ידי פיפטינג לקצה אחד ושאיבה עדינה מהקצה השני בעזרת נייר Kim wipe, לכדו אופטית חרוץ צף והשחיתו אותו לקצה החופשי של תא. שטפו שוב את התא באמצעות מיקרופיפט ונייר Kim white עם 50 microliters של cephalexin ב-LB כדי להסיר חרוצים שאינם מחוברים. לאחר מכן, הפעילו תוכנת lab view שנכתבה במיוחד כדי להפעיל כוחות כיפוף על התא ולהקליט את נתוני ההעתקה הכפויה.

ראשית, כייל את תגובת הגלאי באמצעות סריקת RA של החריזה המחוברת בתוך קרן לייזר הגילוי, והקלט את אותות המתח של ה-PSD בתלת-ממד. לאחר מכן, זהה את הציר הארוך של התא בתמונת מיקרוסקופ. לאחר זיהוי הציר הארוך של התא, העבר את התא בצעדים בכיוון ניצב לציר הארוך, ובמהלך העברת התא הקלט את המרחק שנע והעתקת החריזה ממרכז המלכוד האופטי.

לבסוף, המירו את ערכי ההעתקה לכוח המופעל באמצעות קשיחות המלכודת שנמדדה קודם לכן ושמרו את התוצאות. נתוני ההעתקה והכוח של הקצה שנשמרו בקובץ הם נתוני העתקה כפויה עבור תא בודד. השיפוע של קו זה הוא קשיחות הכפיפה של התא.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לשלב את קשיחות הכפיפה של e coli עם מלכודת אופטית. בעת שימוש בפרוצדורה זו, חשוב לזכור למצוא תא מתאים עם קצה מקובע וקצה חופשי מוגדרים היטב. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.