Name: מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: למדו כיצד למדוד את קשיחות הכיפוף של תאי E. coli באמצעות מלכודת אופטית. שיטה זו מאפשרת לחקור את תרומת המבנים התוך-תאיים למכניקת התאים החיידקיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים עצות מועילות מ Mingzhai לסאן תאים מחייב משטחים. אנו מודים נד Wingreen ו זמר גיתאי לדיונים חשובים. מחקר זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P50GM07150 מענק, פרס הקרן הלאומית למדע קריירה PHY-0844466 ו פ אלפרד סלואן קרן.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים E. coli במדיום לוריא-Beltrani (LB) מרק לשלב מעריכי (OD = 0.2-0.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התרבות LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של cephalexin במשך 15 דקות כדי לגרום לצמיחה פילמנטיות, ולאחר מכן לרכז את התרבות על ידי 5 פעמים באמצעות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את PEI מצופה coverslip ידי זורם polyethylenimine 1% מדולל במים לתוך תא זרימה, לשטוף עם מים לאחר דגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים התרבות תאים מרוכזים לתוך החדר, ושטף בתערובת של LB ו cephalexin (50μg/mL) לאחר 3 דקות כדי להסיר תאים פנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החדר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 1 שעה כדי לאפשר לתאים לגדול המצורפת לפני ההשמה על מכשיר אופטי השמנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את polylysine חרוזים מצופים ידי דוגרים-0.5 מיקרומטר בקוטר חרוזי פוליסטירן (בנגס Labs) ב polylysine 0.1% מדולל במים למשך 30 דקות. ואז לשטוף את החרוזים 3 פעמים resuspend במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון חרוז בפקטור של שני לתוך LB עם cephalexin (50μg/mL), ולהוסיף אותו לתוך תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Optically מלכודת חרוז צף לגעת בו עד קצה חופשי של תא. (אנו משתמשים Mad העיר Labs בשלב piezo כדי לשלוט בתנועה של המדגם.) כאשר שילוב חרוז / תא מתאים נמצא, לשטוף את החדר עם cephalexin ב LB (50μg/mL) כדי להסיר חרוזים פנויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה אישית כתוב תוכנית LabVIEW ליישם כוחות כיפוף אל התא בכוח עקירה נתונים שיא. תוכנית פרטי <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול הגלאי תגובה על ידי סריקה סריקת חרוז המצורפת בתוך אלומת לייזר זיהוי ורישום 3D PSD אותות מתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את ציר תא ארוך בתמונה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר תא צעדים בניצב לכיוון לציר תא ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא המרחק זז תזוזה ממלכודת אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר עקירה בכוח מיושם באמצעות קשיחות מלכודת נמדד קודם לכן ולשמור עקירה טיפ כוח לקובץ. </li></ol></li></ol> סודות ההצלחה: בשלב 8), צריך למצוא תא עם סוף מוגדר היטב תקוע. כמה תאים תקועים רק באחת קצה, וכוח כיפוף בקצה השני מובילה שלמה תא הציר ולא כיפוף. זוג מתאים נמצא על ידי כיפוף כל תא מהר ביד באמצעות תנועה ג'ויסטיק שבשליטת הבמה. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. נתון זה מראה כוח תזוזה נתונים עבור תא בודד. השיפוע של קו זה הוא נוקשות כיפוף של התא.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

הפקת וידאו של מאמר זה מומן על ידי Mad העיר Labs, אשר מייצרת מכשירים המשמשים במחקרים אלה.

הפרוטוקול המובא כאן נועד כמותית למדוד את התכונות כיפוף של תאים חיידקיים. הגדרת הניסוי ניתן ליישם תא בצורת מוט כל שניתן לעשות כדי לגדול filamentously. השתמשנו בהצלחה התקנה זו כדי לחקור את ההשפעות של סיבים cytoskeletal על קשיחות כיפוף של E. coli תאים. טכניקה זו דומה ניתן להשתמש כדי להעריך את תפקידי, נוקשות לחץ דופן התא רכיבים תאיים אחרים בקביעת קשיחות כיפוף הכולל של תאים.

<table><tbody><tr><td>צפלקסין (cephalexin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן-אימין (polyethylenimine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>פוליליזין (polylysine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן בקוטר 0.5-&amp;mu;m</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקום ננומטרית מסדרת Nano-LP</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

פיתחנו פרוטוקול למדוד את הנוקשות של כיפוף מוט בצורת חיידקים פילמנטיות. כוחות מוחלים עם מלכודת אופטי, מעיין מיקרוסקופי תלת ממדי עשוי האור נוצר כאשר גבוהה עוצמת קרן לייזר ממוקדת לנקודה קטנה מאוד העדשה המטרה של מיקרוסקופ. כדי לכופף תא, אנחנו הראשונים לאגד חיידקים לחיות coverslip כימית שטופלו. כאשר תאים אלה גדלים, באמצע תאים נשאר חייב coverslip אך מסתיים גדל חופשיים של איפוק זה. על ידי גרימת צמיחה פילמנטיות עם cephalexin את התרופה, אנו מסוגלים לזהות את התאים בהם קצה אחד של התא היה תקוע אל פני השטח ואילו הקצה השני נשאר פנוי רגישים כוחות כיפוף. כוח כיפוף מוחל מכן על ידי קשירה polylysine מצופה חרוז אל קצה של תא גדל עם מלכודת אופטי. שני כוח לבין עקירה של חרוז נרשמות ואת הנוקשות כיפוף של התא הוא השיפוע של הקשר הזה.

אנו מציגים פרוטוקול עבור כיפוף תאים חיידקיים פילמנטיות מצורף מכסה משטח החלקה עם מלכודת אופטי למדידת קשיות כיפוף הסלולר.

פיתחנו פרוטוקול למדידת קשיחות הכפיפה של חיידקים פילמנטריים דמויי מוט. כוחות מופעלים באמצעות מלכודת אופטית, מיקרוסקופ...

על מנת לקבוע את קשיחות הכפיפה של תאי coli בודדים, ראשית, גדלו את החיידקים עד לשלב הצמיחה האקספוננציאלית ולאחר מכן הצמידו אותם לפני השטח של כיסוי זכוכית (cover slip) שעבר טיפול כימי. הרשו לתאים שכבר הצמידו את עצמם לפני השטח לגדול הלאה, כך שיפתחו קצוות גמישים. לאחר מכן, זרימו פנימה חרוזי דיאלקטריים, לכדו חרוד וכופפו אותו לעבר הקצה הגמיש של התא.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כיפוף התא באמצעות המלכוד האופטי ומדידת נתוני ההעתקה הכפויה הנוכרים. ניתן לחשב את קשיחות הכיפוף של התא באמצעות התאמה ליניארית לנתוני ההעתקה הכפויה. שלום, אני סטיבן וונג מהמעבדה של פרופסור ג'ושוע שיר במכון לואי סיקלר לגנומיקה אינטגרטיבית ובמחלקת הפיזיקה באוניברסיטת פרינסטון.היום נדגים בפניכם פרוצדורה של כיפוף תאי E. coli בודדים ומדידה של קשיחות התא. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התרומה של מבנים תוך-תאיים שונים לשלמות המכנית של תאי החיידקים. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, גדלו שלושה מיליליטר של תאי e coli כלשהם במצע LB עד לשלב הצמיחה האקספוננציאלית. ברגע שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר שבין 0.2 ל-0.4, הוסיפו לתרבית 50 מיקרוגרם למילליליטר של cephalexin למשך 15 דקות כדי להשרות צמיחה פילמנטית. במהלך 15 דקות אלו, הכינו תא זרימה.הדביקו שתי פיסות של סרט דביק דו-צדדי למסלול זכוכית, כך שיישאר רווח של 3 מילימטרים בין הפיסות, והדביקו מעליהן כיסוי זכוכית (cover slip). הרווח שבין פיסות הסרט יוצר תעלה לזרימת נוזלים. ציפו את כיסוי הזכוכית ב-PEI על ידי הזרקת 10 µL של 1% polyethaline המדולל במים לתוך תא הזרימה באמצעות מיקרופיפט, והמתינו חמש דקות להדגרה.לאחר מכן, שטפו על ידי זרימה של 200 µL מים בקצה אחד של התא ואיסוףם בקצה השני באמצעות ואקום. לאחר 15 דקות של גידול החיידקים בנוכחות cephalexin, סבבו (spin down) מיליליטר אחד של תאים במיקרו-צנטריפוגה ותלו אותם מחדש ב-200 µL של LV עם cephalexin. לאחר מכן, שוב, השתמשו במיקרו-פיפטה בקצה אחד ובואקום בקצה השני כדי להזרים 50 µL של תרבית התאים המרוכזת אל התא המכיל את כיסוי הזכוכית (cover slip) המצופה, והדגרו למשך שלוש דקות.לאחר מכן שטפו עם 50 µL של Vel B מועשר ב-cephalexin. כדי להסיר תאים שאינם תפוסים, דגרו את התא בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר לתאים התפוסים לגדול, לפני הצבתם במכשיר המלכודת האופטית בזמן דגירת התאים. הכינו חרוזי פוליסטירון מצופים בפוליליזין על ידי דגירה של 3 µL של חרוזי פוליסטירון בקוטר 0.5 µm בתוך 0.1% Polylysine מהול במים למשך 30 דקות.כאשר מסתיימת הדגירה של החרוזיים, שטפו אותם שלוש פעמים על ידי ספינטדאון במיקרו-צנטריפוגה ותגשוש מחדש במיליליטר אחד של מים, לאחר מכן המשיכו לקישור החרוזיים לחיידקים ומדדו את קשיחות הקישור של התאים. ההיבט הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא היכולת לאתר ולזהות תא מתאים למדידות של קשיחות הכפיפה. תא מתאים הוא תא בעל קצה מקובע וקצה חופשי מוגדרים היטב.בסביבת תא הזרימה שעל המיקרוסקופ, חפשו תא בעל קצה מקובע ומוגדר היטב. חלק מהתאים מחוברים רק בקצה אחד, וכוח הכיפוף בקצה השני מוביל לסיבוב של התא כולו במקום לכיפופו. כדי למצוא תא מתאים, כופפו במהירות כל תא באמצעות המלכודת (trap) על ידי תנועת השולחן המנוהלת באמצעות הג'ויסטיק.כאשר נמצא תא מתאים, דללו את תמיסת החרוצים פי שניים ב-lb עם cephalexin, הוסיפו 30 microliters של תמיסת החרוצים לתא הזרימה על ידי פיפטינג לקצה אחד ושאיבה עדינה מהקצה השני בעזרת נייר Kim wipe, לכדו אופטית חרוץ צף והשחיתו אותו לקצה החופשי של תא. שטפו שוב את התא באמצעות מיקרופיפט ונייר Kim white עם 50 microliters של cephalexin ב-LB כדי להסיר חרוצים שאינם מחוברים. לאחר מכן, הפעילו תוכנת lab view שנכתבה במיוחד כדי להפעיל כוחות כיפוף על התא ולהקליט את נתוני ההעתקה הכפויה.ראשית, כייל את תגובת הגלאי באמצעות סריקת RA של החריזה המחוברת בתוך קרן לייזר הגילוי, והקלט את אותות המתח של ה-PSD בתלת-ממד. לאחר מכן, זהה את הציר הארוך של התא בתמונת מיקרוסקופ. לאחר זיהוי הציר הארוך של התא, העבר את התא בצעדים בכיוון ניצב לציר הארוך, ובמהלך העברת התא הקלט את המרחק שנע והעתקת החריזה ממרכז המלכוד האופטי.לבסוף, המירו את ערכי ההעתקה לכוח המופעל באמצעות קשיחות המלכודת שנמדדה קודם לכן ושמרו את התוצאות. נתוני ההעתקה והכוח של הקצה שנשמרו בקובץ הם נתוני העתקה כפויה עבור תא בודד. השיפוע של קו זה הוא קשיחות הכפיפה של התא.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לשלב את קשיחות הכפיפה של e coli עם מלכודת אופטית. בעת שימוש בפרוצדורה זו, חשוב לזכור למצוא תא מתאים עם קצה מקובע וקצה חופשי מוגדרים היטב. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

measuring-bending-stiffness-bacterial-cells-using-an-optical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מוצג פרוטוקול לשיגור ולכידה יציבה של מיקרו-חלקיקים דיאלקטריים נבחרים באוויר.

טוען מלכודת אופטית של דיאלקטרי microparticles באוויר

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

כאן, פרוטוקול משולב המבוסס על פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus מתואר כדי למדוד את התכונות הריאולוגיות של תאים. פרוטוקול זה יש ישימות רחבה בחקר התכונות viscoelastic של אריתרוציטים בתנאים פיזיולוגיים-פתולוגיים משתנים.

ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

למדו כיצד למדוד את קשיחות הכיפוף של תאי E. coli באמצעות מלכודת אופטית. שיטה זו מאפשרת לחקור את תרומת המבנים התוך-תאיים למכניקת התאים החיידקיים.

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

גלה סרטונים נוספים